1.2. 3 染色体核型分析和胎儿尸体解剖外周血, 羊水或脐带血经常规培养, 获取中期细胞分裂相, 采用国际标准G 显带进行核型分析. 对于同意胎儿尸体解剖者, 签署 .doc

1.2. 3 染色体核型分析和胎儿尸体解剖外周血, 羊水或脐带血经常规培养, 获取中期细胞分裂相, 采用国际标准G 显带进行核型分析. 对于同意胎儿尸体解剖者, 签署 .doc Array-CGH联合NIPT技术进行染色体微缺失和重复产前检测 12234444441 ,符 芳, 李 茹,黄海辉, 徐婉芳 ,何 怡 ,林洋洋, 叶菀华, 隗伏冰, 刘彦慧(523808广东 东莞，广池一婵 234东医学院;510623广州，广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心;518083广东 深圳,华大临床检验中心有限公司;52300广东 东莞，广东莞市妇幼保健院产前诊断中心) [摘要]目的 探讨无创产前检测技术(oninvasive prenatal testing，NIPT)联合基于微阵列芯片的比较基因杂交技术 (array-based comparative genomic hybridization，Array-CGH)在染色体微缺失或重复中的产前检测价值。方法 选择孕12,24 高危孕妇，采集静脉血并提取循环胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)，利用NIPT技术检测，结果为阳性者，适时周 进行羊膜腔或脐静脉穿刺并以Array-CGH技术检测，以DECIPHER和OMIM数据库对检测数据进行分析，所有病例均随访至胎 儿出生。结果NIPT检出10例阳性，Array-CGH检测和随访证实其中6例为染色体缺失或重复，但所检出的缺失或重复以及 片段长度与NIPT不一样;4例Chr7长臂偏多为假阳性。另1例NIPT结果阴性但Array-CGH发现异常。 结论 NIPT技术对染 色体缺失或重复的检出率高，但存在假阳性和假阴性，采用Array-CGH技术对其结果进行验证，可实现准确评价，减少误诊 和漏诊。 [关键词]基于微阵列芯片的比较基因杂交技术;无创产前检测技术;产前检测 [中图法分类号] [文献标识码]A Application of Array-CGH and NIPT in prenatal testing chromosome deletion and repetition Yichan Chi1, Fang Fu2, Ru Li2, Haihui Huang3, Wanfang Xu4, Yi He4, Yangyang Lin4, Kouhua Ye4, Fubing Wei4, Yanhui Liu4 (1Guangdong Medical College, Dongguan, Guangdong, 523808;2Prenatal Diagnostic Center，Guangzhou Women & Children’s Medical Center，Guangzhou，Guangdong, 510623;3BGI- Shenzhen, Shenzhen, Guangdong, 518083;4Prenatal Diagnosis Center, Dongguan Maternal and Child Health Hospital, Dongguan, Guangdong, 523700.) [Abstract] Objective To investigate the prenatal diagnostic value of noninvasive prenatal testing (NIPT) combined with array-based comparative genomic hybridization (Array-CGH) in prenatal detecting chromosomal deletions or repetition. Methods The NIPT was performed using cell-free fetal DNA (cffDNA) isolated from maternal plasma from 12 to 24 weeks of gestation with high risk. For the positive ones, amniocentesis or umbilical vein puncture was performed subsequently and detected by Array-CGH. DECIPHER and OMIM, and all the cases were followed to fetal birth. Results 10 positive cases The detective data were analyzed by were detected by NIPT, 6 of which were confirmed positive by Array-CGH and the following. However, the deletion or repetition length detected by the two technologies existed difference. 4 cases long arm of chromosome 7 adding were false-positive. In addition, one case negative by NIPT was proved to be abnormal by Array-CGH. Conclusion NIPT plays an important role in prenatal detecting chromosome deletion or repetition, but it exists false-positive and false-negative. Combined with Array-CGH, it can achieve accurate diagnose and reduce misdiagnose or missed diagnose. [Key Words] array-based comparative genomic hybridization (Array-CGH);noninvasive prenatal Testing(NIPT) ;prenatal diagnosis supported by the Key Project of Dongguan of Guangdong Province (2012105102003，2013108101021) and the Science and Technology Project of Guangdong Province (20130318C). Correspondence author: Yanhui Liu,E-mail: liuliang71215@163.com;Fubing Wei, E-mail: yufbing126@.com [基金项目]东莞市重点资助课题(课题编号2012105102003,2013108101021);广东省科技计划项目(20130318C) [通信作者]刘彦慧，E-mail: liuliang71215@163.com 隗伏冰，E-mail: yufbing126@.com 染色体缺失和重复可导致智力和发育缓慢、多发畸形等症状，且多数可成活而出生，相对于非整倍体 畸变胎儿(约95%于孕早期自然淘汰)而言对人类影响更大。胎儿染色体缺失或重复类型多而复杂，且多 为新发突变，检测和分析难度较大，一直是产前诊断研究的难点和热点。基于微阵列芯片的比较基因杂交 技术(array-based comparative genomic hybridization, Array-CGH)具有准确度和精确度高等优点，但需羊膜腔 穿刺等创伤性手术获取样本，无创产前检测(noninvasive prenatal tests，NIPT) 技术可采用母体血进行检测， 1 [1]但对于染色体缺失或重复的检测尚处于基础研究阶段，作者结合两种技术的优缺点对高危孕妇进行检测，收到良好效果。 1 对象与方法 1.1 研究对象 2012年3月至2013年3月期间，在东莞市妇幼保健院遗传咨询门诊就诊的高危孕妇890例，这些高危孕妇包括产前血清学筛查阳性、超声筛查异常、年龄?35周岁或具有异常妊娠史的孕妇。 1.2 研究方法 [2]1.2.1 NIPT检测 签署知情同意，在妊娠12,24周采集孕妇外周静脉血，及时分离血浆、提取cffDNA,采用Illumina新一代测序技术进行检测，该技术利用专利芯片，制备DNA簇，边合成边测序，自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析:某染色体含量(%Chr N),某染色体唯一序列读取数,参考序列染色体,上基因组唯一序列总数;测试样本Chr N的关联Z-score,(%Chr N检测样品–%Chr N对照组平均值)/S.D.%Chr N对照组，计算每条染色体的Z-score值，Z-score [3]值?3为染色体异常高风险标本，给出分析。 1.2.2 Array-CGH检测 对于NIPT检测出的阳性病例，通过遗传咨询，择时进行羊膜腔或脐静脉穿刺获取检测样本，并采集夫妻双方外周血，同时提取DNA用于Array-CGH检测，采用DECIPHER数据库和OMIM数据库对检测结果进行分析。 [4]采用美国 Affymetrix公司提供的SNP6.0芯片。主要步骤包括?提取全基因组DNA。? 500ng完整基因组DNA平分成两份分别经NSPI和 STYI两种限制性内切酶37?消化2 h。?用TDNA连接酶16?连接相应接头3h。? 进行PCR扩增，4 PCR反应条件:94? 3min。(94? 30s、60? 30s、68?15s)共30个循环;68? 7min。? 扩增产物使用Agencourt的磁珠吸附法纯化至45μL，浓度为5.0~6.0μg/μL。? 纯化产物经0(01U,μL反应浓度的 DNaseI37?消化35min至50bp长度。? 使用末端转移酶在DNA的末端标记生物素，37? 4h。? 标记产物加入杂交液50?下杂交芯片16,18h。? 芯片杂交后在 Affymetrix的流体工作站上经过洗涤(洗液 A:6×SSPE，0.01%Tween20;洗液 B:0.6×SSPE，0.01%Tween2O)和染色。? 随后与生物素标记的羊抗链霉亲和素的抗体 (Vector)结合后在分辨率为0.7μm的扫描仪上扫描，扫描信号图经 Affymetrix 的 GCOS 和 Genotyping Console两种软件分析、计算产生每一个位点的基因型或信号相对强度，包括CNV和单核苷酸多态性(single nucleotide p olymorphism，SNP)。 1.2.3 染色体核型分析和胎儿尸体解剖 外周血、羊水或脐带血经常规培养，获取中期细胞分裂相，采用国际标准G显带进行核型分析。对于同意胎儿尸体解剖者，签署知情同意书，由解剖、超声和实验专业技术人员共同完成解剖和记录。 1.2.4 随访 对检测出的所有阳性病例进行随访，继续妊娠者主要跟踪超声检测，直至分娩。 2 结果 2.1 NIPT检测结果 在890例接受NIPT检测病例中，共检出42例染色体异常，其中染色体缺失或重复10例和超声提示胎儿畸形但NIPT检测阴性病例1例，共11例(1)。 表1 染色体缺失或重复样本的产前检测结果 高危因素 例数 核型结果 NIPT Array-CGH 胎儿 父亲 母亲 高龄 — — — — 4 dub(7)(1-3Mb) — — dup(18)(q12.3-21.31) 超声提示胎儿双肾膨大，脑室不对称 1 del(18)(q21.31-23) del(18)(q21.31-23) ;del(18)(q2131-23) — — 3次流产史 1 del(3q)(35Mb) dup(8q) del (3q)(60Mb) 血清学筛查高危 — — — 1 dup(1q)(15.6 Mb) dup(1q)(28.6 Mb) 血清学筛查高危 — — — 1 dup(9q)(20.2 Mb) dup(9q)(26.2 Mb) 高龄孕妇 — — — 1 dup(6p)(21.8 Mb) dup(6p)(30.8 Mb) — — — 超声NT增厚 1 del(16p)(33.6 Mb) del(16p)(42.6 Mb) 右侧胫骨局部成角弯曲 阴性 — 1 dup 10q11.22(1.3 Mb) 详见表2 ,:检测结果为正常 2.2 Array-CGH检测和随访 2 通过Array-CGH检测和随访，其中6例证实为染色体缺失或重复，4例为假阳性，1例为假阴性，1例接受胎儿尸体解剖。 6例证实为染色体缺失或重复的病例:Array-CGH所检出的缺失或重复以及片段长度与NIPT不一样(表1)。其中1例NIPT提示Chr18长臂末端存在长约14.35 Mb重复(38987507-53333582)，同时存在长约21.34 Mb缺失(53333583-74673666)。孕31w取脐静脉以Array-CGH技术检测，显示Chr18长臂缺失，但未见重复，孕妇接受终止妊娠。胎儿引产后再次采集脐静脉血做基因测序，仍为缺失而未见重复。 引产胎儿体重1700g，身长40cm，双手呈重叠指，低位耳，左手通贯掌。解剖显示肝脏体积增大(中央线偏左)，肾脏肿胀呈多囊肾。 4例假阳性病例:4例7号染色体偏多，片段长度为1至3Mb，Array-CGH检测均未见异常，超声跟踪检查亦未见异常，均足月平产，新生儿表型正常 1例假阴性病例:超声提示胎儿右侧胫骨局部成角弯曲，因孕妇对羊膜腔穿刺有忧虑而选择NIPT检测，结果未发现异常，考虑到超声检测异常，经遗传咨询再行穿刺取样做Array-CGH和核型分析。核型未见异常，Array-CGH发现2号、10号、14号和X染色体异常，具体见图1和表2。其中10q11.22区段的1.3 Mb微重复为新发突变，该突变可能与微重复可导致自闭症、骨骼发育异常等。另据文献报道[5]，本检测片段中的基因GPRIN2和PPYR1变异与X连锁Rett Syndrome相关，该综合征患者临床表型主要是出生6月之后开始进行性精神运动发育迟缓和行为刻板。因此，结合超声发现的异常和Array-CGH分析结果，孕妇选择终止妊娠。 ?红色区域表示缺失，?蓝色区域表示重复，无颜色标注区域表示正常 图1 脐静脉血染色体Array-CGH分析结果图 表2 胎儿及其父母Array-CGH分析结果 染色体 区段 缺失/重复 片段长度 胎儿 父亲 母亲 说明 Chr2 q13 重复 495 kb + , + 遗传自母亲 Chr10 q11.22 重复 1.3 Mb + , , 可能致病 Chr14 q32.33 重复 269 kb + , , 多态 ChrX p22.33 缺失 256 kb + + , 遗传自父亲 +:检测阳性，,:检测阴性 3 讨论 Array-CGH可在传统核型分析的基础上，将染色体的异常检出率提高到10%,欧美国家已应用于产前诊断,并逐步替代核型分析[6]， 但需要介入性手术获取羊水等样本，属于创伤性产前诊断，存在因穿刺导致胎儿丢失的风险，增加孕妇心理负担。NIPT [7-8]技术可通过母体cffDNA进行胎儿染色体检测，对于21-三体等常见非整倍体的检出率可达99%以上，但仍需传统产前诊 [9-10]断技术进行验证，尤其是对于胎儿染色体缺失或重复的检测尚处于研究阶段。 [12]Anupama等[11]研究发现NIPT技术可能检测300kb以上胎儿基因组微缺失和微重复，Miller等研究发现，对于小片段的染色体畸变，通过母体cffDNA检测可出现假阳性或假阴性，可能与二代测序技术原理、cffDNA复杂性以及生物信息分析方法等有关。本研究中4例7号染色体偏多的病例(重复片段大约为1-3Mb)，通过Array-CGH检测和随访，证实为假阴性结果，提示NIPT技术检测7号染色体重复可靠性低。另外，NIPT检测所发现的18号染色体长臂末端存在长约14.35 Mb的重复和长约21.34 Mb的缺失，经Array-CGH和细胞培养证实仅存在重复,而21.34 Mb的缺失为假阳性结果，胎儿引产脐静脉血的直接测序得到进[12]一步证实。原因可能与游离DNA来源有关(胎盘)，因胎盘细胞可出现异常细胞的嵌合而不能完全代表胎儿细胞。 NIPT技术是以单个碱基为单位，而Array-CGH技术则以大片段序列为单位进行检测，因此，两种技术在染色体缺失和重复片段长度的识别上并一定一致，表1检测数据显示，Array-CGH检测出片段长度均大于NIPT测序结果，但均包含测序片段， 3 对疾病的判断并不存在差异。 本研究得到以下启示:Array-CGH技术在产前诊断中具有重要地位，在对于染色体缺失或重复的检测方面具有良好的应 用价值，将来可替代核型分析成为染色体畸变产前诊断的金标准;NIPT技术具有对胎儿无创的优点，可对所有染色体的缺失 或重复进行预测，但由于游离DNA来源和复杂性，以及低覆盖度测序和生物信息学分析策略等因素，对于小片段和较大片段 的检测均可出现假性结果，因此，在临床上必须把握NIPT检测的适应症，其阳性结果需经Array-CGH技术验证，而对于超声 发现胎儿异常而NIPT结果阴性者仍然需要遗传咨询和Array-CGH检测。 参考文献: 1. Vora NL, Brien BM.Noninvasive prenatal testing for microdeletion syndromes and expanded trisomies: proceed with caution. Obstet Gynecol. 2014 ;123(5):1097-9. 2. Shan Dan,Wei Wang,Jinghui Ren,et al.Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11105 pregnancies with missed risk factors.Prental Diagnosis.2012,32:1-8. 3. Srinivasan A, Bianchi DW, Huang H, Sehnert AJ, Rava RP. Noninvasive Detection of Fetal Subchromosome Abnormalities via Deep Sequencing of Maternal Plasma. Am J Hum Genet. 2013 Feb 7;92(2):167-76. 4. Fu F, Liu HL, Li R, Han J, Yang X, Min P, Zhen L, Zhang YL, Xie GE, Lei TY, Li Y, Li J, Li DZ, Liao C3.Prenatal diagnosis of foetuses with congenital abnormalities and duplication of the MECP2 region.Gene. 2014 Aug 10;546(2):222-5. 5. Rosangela Artuso, Filomena T Papa, Elisa Grillo, Mafalda Mucciolo, Dag H Yasui, Keith W Dunaway, Vittoria Disciglio, Maria A Mencarelli, Marzia Pollazzon, Michele Zappella, Giuseppe Hayek, Francesca Mari. Investigation of modifier genes within copy number variations in Rett syndrome. J Hum Genet. 2011 ; 56(7): 508–515. 6. Chia-Cheng Hung, Chia-Hui Lin, Shin-Yu Lin,etal.Prenatal diagnosis of a fetus with a de novo trisomy 12p by array-comparative genomic hybridization (array-CGH). Gene , 2012,495:178–182 7. Simpson JL, Bischofff F. Cell-free fetal DNA in maternal blood: evolvingclinical applications[J]. JAMA, 2004, 291: 1135-1137. 8. Shan Dan,Wei Wang,Jinghui Ren,et al.Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11105 pregnancies with missed risk factors.Prental Diagnosis.2012,32:1-8. 9. Lau TK, Chen F, Pan X, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of commonfetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing [J]. J Matern Fetal Neonatal Med. 2012, 25: 1370-1374. 10. Miller DT, Adam MP, Aradhya S, et al. Consensus statement: Chromosomal microarray is a first-tierclinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies[J]. Am J Hum Genet, 2010, 86: 749-764. 11. Srinivasan A, Bianchi DW, Huang H, Sehnert AJ, Rava RP. Noninvasive Detection of Fetal Subchromosome Abnormalities via Deep Sequencing of Maternal Plasma. Am J Hum Genet. 2013 Feb 7;92(2):167-76. 12. Lo YM,Chan KC,Chiu RW.Nonivasive fetal trisomy 21 delection using chromosome-selective sequencing:a variation of the molecular counting theme.Expert Rev Mol Diagn,2012,12:329-331. 4