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细胞凝集反应实验.doc

2017-10-30 6页 doc 37KB 29阅读

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细胞凝集反应实验.doc细胞凝集反应实验.doc 细胞凝集反应 王玉琼201005232142 齐鲁医学班 一 实验目的: 1了解细胞膜的表面结构 2了解血细胞凝集原理 3学习研究细胞凝集反应的方法 二 实验原理: 细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起,成为一簇不规则的细胞团。细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构,脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为,细胞间的联系,细胞的生长和分化,免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。 凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一结合的蛋白质,如植物血球凝集素,伴刀豆凝集素和土豆...
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细胞凝集反应实验.doc 细胞凝集反应 王玉琼201005232142 齐鲁医学班 一 实验目的: 1了解细胞膜的表面结构 2了解血细胞凝集原理 3学习研究细胞凝集反应的方法 二 实验原理: 细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起,成为一簇不规则的细胞团。细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构,脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为,细胞间的联系,细胞的生长和分化,免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。 凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一结合的蛋白质,如植物血球凝集素,伴刀豆凝集素和土豆凝集素等,它具有凝集细胞核刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接,在细胞间形成“桥”的结果,加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的 凝集。 三 实验用品: PBS缓冲液 显微镜 双凹载玻片 滴管 土豆凝集素 土豆凝集素的提取:去皮土豆块茎2g,加10mLPBS缓冲液浸泡24h,所得粗提液中既含有可溶性土豆凝集素. 1%兔血红细胞 2.1%兔血红细胞制备:抽取兔静脉血1mL加抗凝剂,加入3mL生理盐水,1000r/min离心5min,重复洗涤三次。按红细胞压积配成1%红细胞悬浊液。 四 实验步骤: 1( 分别用滴管吸取土豆凝集素和1%兔血红细胞各一滴,置于双凹片左孔混匀。 2( 吸取PBS缓冲液各一滴置于双凹片右孔混匀。 3( 摇晃5-10min观察,并以低倍镜镜检。 五 实验结果: 反应前 反应后 (左为混合了PBS的兔血红细胞,右为混合了土豆凝集素的兔血红细胞) 发生凝集的细胞 未发生凝集的细胞 图2 低倍镜(*10)下混合了了土豆凝集素(左)和PBS缓冲溶液(右)的兔血红细胞观察 结果: 混合土豆凝集素9分钟时细胞开始发生凝集,可以观察到细小沙粒状的细胞团,随时间流逝小细胞团变大。 如图1可看到,混合了土豆凝集素的兔血红细胞(右侧)聚集成块,周围液体较澄清;而混合了PBS缓冲溶液的兔血红细胞(左侧)未发生凝集,液体浑浊。 低倍镜下镜检(图2)可看到,凝集了的细胞聚成一簇不规则的团,而未发生凝集的红细胞很 均匀。 六 关于实验操作的反思 1 兔子耳缘静脉抽血: 基本操作:按压兔子耳缘静脉的近心端,用酒精棉球擦拭,可以看到耳缘静脉鼓起来。针尖孔朝上,平行进针。看到针尖回血后,抽取血液。拔针止血。 第一次抽血,手还是有点抖,不过还是抽到血。 存在问:感觉抽不动针的活塞。不习惯拿针管的姿势。 2细胞凝集反应操作反思: 前两次由于滴入的PBS缓冲液太多,致使两边混合在一起。因此,要少滴,摇晃玻璃片时要缓慢。 七 关于实验内容的理解体会 一 关于实验原理 定义:颗粒性抗原(细菌、红细胞、偶联抗原的乳胶颗粒)与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象, 此称 凝集反应。 1.直接凝集 直接凝集是颗粒性抗原(细菌红细胞)与相应抗体结合产生的凝集反应。利用直接凝集可鉴定细菌和血型。 2.间接凝集 将可溶性抗原或抗体包被在红细胞或乳胶颗粒载体表面后,与相应抗体或抗原作用出现的凝集。采用红细胞为载体的间接凝集称间接血凝。采用乳胶颗粒为载体的凝集称为乳胶凝集。以包被抗原检测抗体的 间接凝集。以包被抗体检测抗原的间接凝集称为反向间接凝集。 用此法可检测乙型肝炎表面抗原和甲胎蛋白等。 二 应用 1血型的鉴别 若将血型不相容的两个人的血液滴加在玻片上并使之混合,红细胞可凝集成簇,这个现象称为红细胞凝集。红细胞凝集的本质是抗原-抗体反应。起抗原作用的是镶嵌在红细胞膜上的一些特异蛋白质或糖脂,称为凝集原。能与红细胞膜上凝集原起反应的特异抗体是存在于血浆中的γ-球蛋白,称为凝集素。发生红细胞凝集时,由于每个抗体上具有2-10个抗原结合位点,因此,抗体可在若干个带有相应抗原的红细胞之间形成桥梁,使它们聚集成簇。输血反应就是由于在体内发生了红细胞凝集。在体外可利用红细胞凝集进行血型鉴定。 2 作为细胞分化和成熟的标记 应用凝集素作为细胞分化的标志,在这方面的应用报告最多,而且研究比较集中于血细胞,特别是淋巴细胞的分群。如Rose(1980)等发现在小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应,在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞,后者是否属于不成熟的T淋巴细胞,是值得进一步研究的问题。Newman等(1979)以荧光素标记凝集素PNA,发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞,荧光弱或无,随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光程度逐渐加强,而泌乳期荧光强度达最高峰。在皮肤角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中,细胞表面的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed等(1981)应用新生大鼠皮肤的实验表明,皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合,蓖麻素与棘细胞和基底细胞相结合,而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在成肌细胞(myeoblast)的分化与成熟过程中,Winaod 和Luzzati(1975)注意到类似的皮肤的改变。 3作为细胞特殊类型的标记 Kivela和Farkkanen(1987)发现在人视网膜,PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应而肌上皮细胞和间质细胞呈PNA阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明,刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部,PNA和双花扁豆凝集素(DBA)主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞,荆豆凝集素(UEA)主要分布在血管内皮细胞,而麦芽素分布在肾小球。应用DBA对RIII和DDK品种的小鼠研究表明,DBA主要结合在各种组织内毛细血管内皮细胞上,电镜观察显示DBA结合在内皮细胞的表面,在趣的是在RIII品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的DBA阴性反应,说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit和Kreutzberg(1987)发现Griffonia Simplicifolia凝集素特异性标记面神经节 内的小胶质细胞,其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(astrocyte)等都显示阴性反应。在切断面神经 后,增殖的小胶质细胞对Griffonia Simplicifolia凝集素的反应加强,免疫电镜观察表明,凝集素主要沉积在细胞膜或小胶质细胞突起的轴膜表面,特异性结合糖基是α—D—半乳糖。上海医科大学附属肿瘤医院免疫病理室应用12种凝集素(表6-1)对人胚胎及各种正常组织进行了系统的凝集素受体的定位研究,结果表明,凝集素受体的分布并无即定规律可寻。如胃粘膜主细胞为PNA受体,而壁细胞为BSL受体,双花扁豆受体(DBA)主要出现在大肠部份。 4(在肿瘤中凝集素结合的改变 肿瘤细胞伴有细胞膜的改变,细胞膜上的糖基也会产生相应的变化,可用凝集素检测出来。大量研究发现,凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等(1987)报道115例胃癌标记PHA阳性率高达90.43%,而正常胃粘膜基本是阴性,故认为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79%,而对良性病变均呈阴性反应,提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。凝集素还有助于判别肿瘤的组织类型,如神经系统星形细胞瘤ConA阳性,小胶质细胞瘤阴性,肾腺癌UEA1阴性,透明细胞癌阳性。
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