齐墩果酸治疗皮肤增生性瘢痕的作用机制研究

齐墩果酸治疗皮肤增生性瘢痕的作用机制研究 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下进行的研究工作 及所取得的研究成果。据我所知,除文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中 不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得福建中 医药大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明并表示谢意。本人完全意识到本 声明的法律结果由本人承担。 ~ 签字日期: 年‘月陟自 :, .学位论文作者签名:槐抱唿 学位论文版权使用授权书 . 本学位论文作者完全了解福建中医药大学有关保留和使用学位论文的规定, 即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属福建中医药大学。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许学位论文被 查阅和借阅。本人授权福建中医药大学可以公布学位论文的全部或部分,并 编入有关数据库进行检索,可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。保密的学位论文在解密后遵守此规定 本学位论文属于必须在以下相应方框内打。?一,否则一律按。非保密论文刀处理: , ,历 、保密论文:凸本学位论文属于保密,在 年解密后适用本授权书。 、非保密论文:血本学位论文不属于保密范围,适用本授权书。 ,。. 是否同意授权以下单位必须在以下相应方框内打。’,刀,否则?律按“同意授权一 . 处理../ 、目同意授权 口不同意授权 清华大学“中国学术期刊光盘版电子杂志社将本人学位论文进行电子和网 络出版,并编入系列数据库《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和《中 。 国知识资源总库》。 、蚋意授权 口不同意授权 中国科学技术信息研究所万方数据库将本人学位论文收录到《中国学位 羹麓登蘧篮竺巯甲僦擀警锷侥 导师 日, 净 ? ’?缩略词表蜘旺增生性瘢痕 成纤维细胞 增生性瘢痕成纤维细胞 ~.. . 细胞外基质磷酸盐缓冲液 一二甲基亚砜 渤’改良培养基 胎牛血清 ? 程序化死亡 感 磷脂结合蛋白碘化丙啶活性氧簇罗当明 细胞色素么% 线粒体膜电位 ‘ ’ 流式细胞仪 瘢痕增生指数 苏木精和伊红 酶联免疫吸附分析’型胶原?型胶原 ?. 一 转化生长因子 ?。 ‘ 瞰 基质金属蛋白酶 丝裂原活化蛋白激酶胍‘ .氨基末端激酶 细胞外信号调节蛋白激酶 目 录 中文摘要?.....:...:..:??.?.?.?....??.?: 葑言??.“ 日舌?..?.. 第一章瘢痕成纤维细胞的分离和培养一材料和方法?。二、 结果。 三、分析与讨论。 ‘四、 小结??.....。 第二章齐墩果酸对增生性瘢痕成纤维细胞的影响?.. 一、材料和方法.. 一 , 二、结果? 三、分析与讨论 第三章齐墩果酸对增生性瘢痕成纤维细胞信号通路的影响. 一、材料和方法.. 二、 结果?,..?. 三、分析与讨论::??..:。 ’ 第四章齐墩果酸对兔耳增生性瘢痕的影响?.. 一、材料和方法?. 二、 、:: 口::??..?.....?.?..??.........?.........?.?.......................... ..?上 结果??...一 三、分析与讨论?. 四、’小结..第五章研究总结参考文献? 综述?... 在读期间发表论文和科研情况。 至谢. 个人简历:?~齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制研究 魏艳洁 中文摘要 增生性瘢痕是皮肤创伤愈合后瘢痕持续增生的一种病理现象,是病理性瘢痕 的一种。它的形成与纤维细胞的异常增生、胶原的过度生成和细胞外基质过度沉 淀有关,常见于深度烧伤,炎症和外伤等的创伤后修复。增生性瘢痕以红肿、明 显高出于皮肤和病变皮肤瘙痒扭曲,并伴随着挛缩为特点。压迫感、僵硬感、关 节灵活性丧失和变形常使病变部位瘙痒疼痛,并有一系列的功能障碍和影响美观。 对于瘢痕的治疗目前有许多手段,但尚未有一种方法能够完全有效且永久有效而 无副作用,而天然药物在许多疾病的治疗中的重要作用己被广泛接受。 本研究采用组织培养的方法分离出瘢痕成纤维细胞,通过测定细胞的活 力并计算其增殖抑制率。通过流式细胞仪测定成纤维细胞的凋亡作用,/双染 用于测定细胞的凋亡率,检测’含量,?测定细胞水平,罗 丹明测定线粒体膜电位。用蛋白质印迹法检测成纤维细胞的凋亡信号转导通 路的磷酸化和磷酸化蛋白,以及在凋亡中起关键作用的蛋白 .和的表达情况。通过建立兔耳瘢痕模型,从整体动物水平对齐墩果 酸的药效做进一步考察。兔耳瘢痕被随机分为组,分别为模型组、低剂量组 .%、中剂量组%、高剂量组%和阳性药组,正 常组的兔耳不做任何处理。给药天后,检测瘢痕组织中的型和?型胶原、转 化生长因子.、基质金属蛋白酶.的含量,并测定瘢痕增生 , 指数。 实验结果表明齐墩果酸能够抑制瘢痕成纤维细胞的增殖,并呈剂量和时间依 赖性,流式检测的结果显示,齐墩果酸能够诱导瘢痕成纤维细胞凋亡,降低线 粒 体膜电位,但可能不是通过升高细胞水平而进一步诱发凋亡。在给予齐墩果 酸处理后,蛋白印迹结果显示.和均被激活,磷酸化和磷酸化 蛋白的表达均上调。在兔耳瘢痕模型中,给药天后,兔耳瘢痕组织中的?、 . 和?型胶原的含量都显著降低,而.的水平显著的升高,也明显的降 低,组织切片显示瘢痕组织中的胶原纤维排列趋于正常,成纤维细胞的数目 减少。 膳 综上,齐墩果酸能够抑制瘢痕成纤维细胞的增殖并诱导其凋亡;在兔耳瘢痕 模型中,齐墩果酸能够抑制兔耳瘢痕的形成。? 关键词:增生性瘢痕齐墩果酸细胞凋亡 ’ . ? , ,,, . 璐 ,, , ., . ... . .朋 ?/. ,? . ,. ?, . 舐矽,? , .%,/, %,/,? %,/ ,; . . ,,... 廿 , 陋 。 一 . . , ., ..。 . ,. ; ; : ; ;; ;一; 福建中医药大学硕士论文 .一 刖吾 增生性瘢痕 盯,是皮肤真皮层受创后局部组织增生而形 成的病理结构,它是创伤后,尤其是烧伤后常见的并发症。创伤的愈合过程是以 瘢痕的形成来完成的,瘢痕是创伤修复的必然产物,凡是涉及真皮层的创口几乎 都可以形成瘢痕以愈合。正常的瘢痕不会过度生长,随着时间可自行消退;而增 生性瘢痕属于病理性瘢痕的一种,在创面愈合后继续生长,高出于周围皮肤组织, 厚度不等,形状不。在早期出现充血肿胀,呈红色或紫色,伴随剧烈的痛痒, 质地坚韧,但不向周围组织扩散与基地组织不粘连,可推动。深部的胶原纤维 ’ 增厚,排列不规则,或呈旋涡形,或呈绳索状,并在其中常有粘多糖蛋白的沉淀, 使成为坚硬的实块。 发病机制 对于增生性瘢痕的发生机制至今尚未阐明,目前的研究显示成纤维细胞是瘢 痕形成的效应细胞,也成为瘢痕研究的重点所在。瘢痕中成纤维细胞增生,并且 对细胞外基质 ,的合成明显的增加和降解不足。在增 生性瘢痕组织内, 型胶原和?型胶原的表达增强,而胶原酶的活性较正常组织 内的明显降低,胶原酶的表达也减少。随着对瘢痕的形成机制进行了细胞生物学 和分子生物学的深入研究,人们发现细胞因子在其中起着重要的作用,其中又以 转化生长因子.的作用较为突出 .家族是细胞生长、分化、 合成与代谢的多功能调节因子。目前在哺乳类动物体内发现三种异构体,分别为 、、.聆,三者在体内分别相互作用以维持平衡的水平,当这种 水平被打破时,即有可能导致组织器官的纤维化。几乎所有细胞表面都有. 的受体存在,具有高度的亲和性和特异性,主要分为、、?型,其中型和 型受体是糖蛋白,属于跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶,二者之间相互作用,并互为 信号。在创伤的愈合过程中,创面的部位聚集着一群对.敏感的成纤维细胞, 他们在肉芽组织期和瘢痕增生的形成期过度表达.的型和型受体;。 通过作用于型受体介导的合成和沉淀,通过型受体介导细胞的生长和增 殖。在.的三种异构体中.是最具有特征性的促纤维化细胞因子,能刺 激周围成纤维细胞产生胶原及其基质并沉淀,增加整合素的表达,降低基质金属 蛋白酶的表达和增加基质金属蛋白酶抑制剂的表达。通过成纤维细胞的体外研究 发现,通过.和.的阻断,能明显的抑制成纤维细胞的增殖,减少胶原 等的合成嵋。 在瘢痕的形成过程中不仅是的过度分泌沉淀,另一重要的方面便是其降齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 解减少,在细胞中有六大酶系参与的降解,分别为:脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、 半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶舢,其中以 ?的作用最为重要。的活性又受特异性抑制因子金属蛋白酶组 织抑制因子的调节阳。二者的相互作用调节着的代谢,并且对细 胞的增殖也有影响口。此外,.对于能够影响细胞凋亡的蛋白和基因均可影响瘢痕的 . 形成。 治疗进展 有统计数据显示,我国各种烧烫伤病人约占总人口的%,各种手术病人约占 .%:而烧烫伤病人的比例最高,可达%以上,手术病人中约%会形成增生性 瘢痕,因此,我国每年就有相当庞大数量的增生性瘢痕的患者呻,。目前对于增生性 瘢痕的治疗手段主要有:?硅凝胶治疗该法的应用自年首次报 道以来就一直沿用至今们,最新报导有一种新型种自干型硅凝胶治疗新鲜手术瘢 痕的疗效,结果瘢痕的外观得到明显改善。这种新型自干型硅凝胶不需要固定并 且完全透明,患者的依从性较好可用该法在手术后对患者进行瘢痕形成的预防。 另有将硅凝胶用于正中胸骨切开术后对增生性瘢痕的形成有预防作用,且无副作 用,在术后早期使用硅凝胶可预防增生性瘢痕的的形成引。此法的优点在于无侵 害、无痛及副作用少,应用方便,尤其适用于儿童和不能耐受其他方法的患者。 但这种方法只能对操持压力的部位有效,如四肢。?压迫疗法 此法开创于世纪年代,得到广泛的认可和应用,常用于肺功能区域增生性 瘢痕和瘢痕疙瘩的治疗割。此法主要对活动期的瘢痕有效,伤口的愈合早期使用 压迫疗法有助于减轻增生性瘢痕的形成,其预后效果越好,一般建议在创伤后 个月内即开始进行压迫治疗钔。压迫疗法显效缓慢,过早停止容易是瘢痕复发, 其缺点是单一使用压迫治疗时间较长,尤其对儿童的发育不利;由于压力分布不 均,偶尔出现皮肤溃疡,且关节活动及体表不平而妨碍治疗,因此压迫疗法需要 因人而异。?类固醇皮质激素治疗该类药物中常用的有醋酸 氢化可的松、倍它米松、曲安奈德等,其中以曲安奈德最为常用,通过局部注射 进行治疗刚在创伤愈合期,此类药物可通过影响胶原的重塑和抑制炎症反应来组 织瘢痕的形成。虽然此类药物目前依然是药物治疗的首选药物,但容易产生各种 不良反应,常见的有局部萎缩、色素脱失、毛细血管扩张等,并且在注射时虽然 加入了麻醉剂但仍有剧烈的疼痛感,且由于外用皮质固醇激素的组织渗透性较低, 只能用于比较浅表的瘢痕。?放射治疗可以作为单一治疗手段, 也可以作为外科手术后的辅助方法,单独使用效率低、复发率高,目前常用来预 防手术后瘢痕的复发羽。由于放射性疗法有严重的副作用,目前的瘢痕治疗应用 较少钔,但是经过几十年的发展,并发症已经降低不少,虽然理论上放疗具有潜 在的危险性,但经过大规模多中心统计学的调查显示:合理的放疗并不会增加恶 福建中医药大学硕士论文 性肿瘤发生的可能九。?激光治疗 利用激光的灼烧、汽化、切 割、凝固及散焦等技术祛除瘢痕组织、抑制胶原的合成、成纤维细胞的增殖及诱 导细胞凋亡。已有的研究表明用 波长的脉冲激光可以治疗或预防增生性瘢 痕以及瘢痕疙瘩口旧。使用此方法常见的副作用有:短暂的皮肤紫癜、色素减退或 色素沉淀比钔。?手术治疗自年利用此法以来,外科手术切除是 增生性瘢痕最常用的治疗方法之一,此法可明显改善病变部位的外观和功能汹。 手术治疗虽然疗效好,但其复发率高,治疗的手术仍可能再次创伤愈合失控而导 致瘢痕的过量形成。因此目前少见单纯的施行手术切除,而是与激光疗法、压迫 疗法、放射治疗以及类固醇皮质激素等方法联合使用以达到较理想的治疗效果洲。 ?冷冻疗法是利用冷冻剂如液氮的低温破坏瘢痕局部的细胞和微 循环,造成组织坏死,脱落,以达到消除瘢痕的目的。另外还利用超低温使皮肤 角质层与生长层松懈,胶原纤维变性从而抑制成纤维细胞生长。该法能有效的改 善患者的症状啪删,但该法至少要经过次的治疗才能产生较好的疗效,且治 疗 是的疼痛、皮肤萎缩、色素减退是较多患者不愿接受治疗的原因。目前,利用冷 冻探针进行局部冷冻,可以在尽量不损伤表皮的情况下对瘢痕组织的深层结构进 行破坏,治疗周期缩短,无明显上述的副作用,易于操作,提高了治疗的效果九。 ?其他目前还有干扰素疗法、基因疗法、中草药提取物等方法。 因此,对于预防和治疗瘢痕的药物筛选可从抑制成纤维细胞的增殖、诱导成 纤维细胞凋亡、抑制的过度沉淀和促进的降解等几方面考虑。 通过前期的实验筛选发现,齐墩果酸对瘢痕的成纤维细胞的凋亡诱导作用较 为显著。齐墩果酸 ,作用天然的三萜类化合物,广泛的分布 于食品和药用植物中。齐墩果酸常用于:抗炎镇痛,在热板、甩尾和扭体的疼 痛模型中,富含的提取物均有显著的镇痛作用九。并有研究表示对于关节 炎疼痛也具有镇痛效果口羽。保肝作用,在小鼠肝损伤模型中,富含的果实 能够保护由引起的肝损伤?。进一步的研究表明,可能是通过抑制肝脏 微粒体中细胞色素、增加肝脏金属硫蛋白,、上调肝 . 脏核因子相关因子 , 的表达以起到保 肝作用口淌。抗肿瘤,能够抑制人结肠癌细胞增殖口们,其衍生物同样具有 抑制血管新生、肿瘤细胞的浸润和扩散啪、肺癌细胞和白血病细胞的凋亡作 用啪】。 目前的临床应用主要是用于急慢性肝炎的治疗、肝硬化的治疗、免疫治疗恶 性肿瘤的二期临床等。 本课题通过建立人皮肤瘢痕成纤维细胞的体外模型,研究对成纤维细胞的 增殖抑制作用、细胞凋亡凋亡率的影响、含量的影响,明确具有诱导瘢 痕成纤维细胞凋亡的作用;应用技术考察了对于凋亡蛋白和信号 齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 转导通路蛋白的作用,揭示诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的机制。进一步通过建 、 立整体动物模型??兔耳瘢痕模型,。对瘢痕的关键生化指标型胶原 型胶原 、转化生长因子.和基质金属蛋白酶进行 了研究,验证了在整体动物水平对瘢痕的抑制作用,为将应用于防治瘢痕 形成和进一步的开发利用提供了科学依据。 福建中医药大学硕士论文 第一章瘢痕成纤维细胞的分离和培养 组织块培养法是一种简便易行和成功率高的原代培养方法,是成纤维细胞最 常用的培养方法之一。由于在体外培养条件下和在机体内,细胞的行为规律 基本 一致,所以许多研究可以通过体外培养的方法进行,并且在体外培养条件下, 人 们可以有目的地、有选择性地控制细胞生长的环境,以此可以研究出在某种 特殊 的条件下细胞生物学的行为。由于细胞外基质的过度积淀是瘢痕形成的重要 环节, 而皮肤成纤维细胞是合成和分泌细胞外基质的主要细胞,因此成纤维细胞的 体外 培养是瘢痕研究的重要基础。 一、材料和方法 一实验器材 .试剂 磷酸缓冲液,,美国 胎牛血清,,美国 细胞培养液,美国 二甲基亚砜,,美国 . .%胰酶,,美国 链霉素、青霉素双抗液,碧云天生物研究所,中国 甲基四唑蓝,‘,美国,临用前用配制成.% .材料 细胞培养瓶,美国 一次性离心管,美国 细胞冻存管,美国 移液器,德国 玻璃细胞培养瓶上海均尔医药发展有限公司,中国 .仪器 恒温培养箱,,日本 ’倒置相差显微镜,,日本 台式离心机 ,上海安亭科学仪器厂,中国 齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 双人单面超净工作台?,苏州空气净化设备厂,中国 ,美国 超低温一?冰箱一 , ’ 冰箱一 ,海尔,中国 漩涡混合器,上海琪特分析仪器有限公司,中国 二实验方法 .组织来源 增生性瘢痕组织标本取白手术切除的增生性瘢痕组织的例患者,男性例, 女性例;年龄.岁。取材部位为颜面、前胸、四肢等,瘢痕生长时间为? 年,患者均来自上海市长海医院烧伤科,均无全身器质性疾患,并获患者知情 同 意。标本切除后,浸泡于生理盐水中,并置于冰箱暂时保存。 .增生性瘢痕细胞的培养 ..的原代培养 增生性瘢痕的培养采用组织块培养法。将新取的病人皮肤瘢痕在无菌操作台 内,用手术剪去除皮肤的表皮和皮下组织留下真皮组织,用含有%双抗的溶 液含青霉素 /、链霉素 /反复清洗至无油滴,然后将清洗过的 真皮组织剪切成..的组织块,用弯头滴管将组织块接种至一次性培养瓶 的底部,组织块间距以..。加入适量的以润湿组织块,将培养瓶倒置 于%,的培养箱中培养后,加入含%的培养基含青霉素 ’ /、链霉素 /以浸没组织块,正置培养,每换液一次,每次加 入%的培养基含青霉素 /、链霉素 /以刚好浸没组 织块为宜。待细胞从组织块表面游离出后,改以%的培养基含青霉 /培养,待游离出的细胞生长成片,相互融合铺满 素 /、链霉素 瓶底约%时,可进行细胞的传代培养。 ..的纯化 在某些培养瓶中可见细胞生长的不纯,即混有表皮细胞,进而对成纤维细胞 进行纯化。根据上皮类细胞和成纤维细胞贴附能力和贴壁所需的时间不用, 即消 化时容易脱壁和接种后容易贴壁的细胞主要是成纤维细胞的特点,对瘢痕成 纤维 细胞进行纯化。在镜下观察贴壁细胞消化的情况,当大部分梭状细胞体变圆 时, 终止消化,未脱壁的细胞丢弃;接种传代细胞?后,未贴壁的细胞丢弃;经? 次传代后即可得到纯化的成纤维细胞。 福建中医药大学硕士论文 ..的鉴定 形态学鉴定:用倒置显微镜观察细胞形态,上皮样细胞和从形态上有很大 区别,在显微镜下上皮细胞呈椭圆形样排列,多呈梭形或不规则三角形,细胞 质向外伸出?个长短不同的突起。细胞染色鉴定:将培养的第二代接种到放 有盖玻片的培养皿中,待细胞长至一定密度时取出盖玻片,经丙酮固定吹干, 按 照常规法操作,进行波丝蛋白、角蛋白、?型胶原染色。显微镜下观察可见 波丝蛋白染色阳性、细胞浆呈棕黄色、角蛋白染色阴性、?型胶原染色阳性。 ..的传代培养 当原代细胞长覆盖%%的培养瓶底部时即可进行传代培养,吸出培养基, 将含有%双抗的溶液荡洗培养瓶内的细胞两遍,加入适量浸润细胞即 可含有的.%胰蛋白酶溶液后,在倒置显微镜下观察消化情况,见大部 分细胞收缩、间隙增大时,即刻停止消化。弃去胰酶后加入含%的 培养基终止消化,用弯头滴管轻轻吹打瓶壁的细胞,细胞脱壁成为细胞悬液, 调 整细胞数量接种于培养瓶中一般按照 的培养瓶大约接种万个细胞,或 者按照:的比例分别接种在新的培养瓶内。换一次培养基,待细胞生长达到 %以上时,继续传代。实验研究所采用的均为.代的成纤维细胞羽。 .的冻存 将培养至或代的细胞,消化吹打成细胞悬液,/离心,去除 上清液,加入预先配制好的冻存液%%%于离心 管中并调整冻存液中的细胞浓度为/,每个冻存管中加入细胞悬液, 封口,进行梯度降温‘删。 .的复苏 从液氮罐中取出冻存管,迅速投入。的水浴中,轻轻摇晃冻存管,‘使其均 匀受热尽快解冻融化,吸出细胞悬液于离心管中,加入倍量的新鲜培养基, /离心,弃去上清液,加入含有 %的培养基吹打均匀, 。 接种于细胞培养瓶中,于%,。的培养箱中培养,后换液 二、 结果 原代组织经过.天的培养,可在组织块的边缘看到有成纤维细胞开始游离查 璺墨墼塑堑望生丝塑壅塑堡旦垫墅 出图.,周后细胞可贴壁生长至%,可以进行传代。在倒置显微镜下观察, 成纤维细胞贴壁呈梭形或者不规则三角形生长,细胞中央有卵形核,胞质向 外伸 出.个长短不同的突起或不突起。在?代的成纤维细胞细胞活力较好,传代后 天即可传代。冻存的细胞在复苏后,状态基本保持原来的细胞活力。一些细 胞 在培养至代以后,可出现细胞体积变大,胞质突起增多,生长缓慢等细胞活力 下降的现象,故本实验选用代的成纤维细胞进行实验研究。 .细胞从组织块中游离出 窆:..吵弗,艺譬噬‘二四 一一帮””。’?一习 笋‘ 垂?:。?一.:。 :』。:.二,?秀 ‘。一:‘,.?:一.‘一一,,‖.:毒 箩。 ,?。。.’?,二二二.:一跫 孽一一?’:,,簟囊 爹,?。.三了./一二’一.,’‘二, .,一。.。~一 哥一。。 二: .’.. 一?一一‘‘一?一、 ‖’,一 ,。, 。~? 一” ’’.?一啊 一:一.‘,,‘’?.一.二: 三蠢 一。。 , 塌 ?. ,.~ ,。 耋?, ’.。 。一,二.戈 落。’。二..一:乙‘.’?《~,. ~纛 《矾:。“?一,掣‘一乞。:二:::咒.鼍 ,一跳~?一?一.主 图.成纤维细胞倒置显微镜观察 .,,. ? 三、分析与讨论 本实验采用组织块培养法成功建立了增生性瘢痕成纤维细胞体外模型,为研 福建中医药大学硕士论文 究增生性瘢痕的体外研究奠定了基础。以下是在实验过程中需要注意的一些事项: 一瘢痕切除后应尽快进行原代培养的实验,若无法即刻进行,应浸泡于 生理盐水中并于?冰箱中暂时保存,但时间不宜超过。 二在剪切组织块时,一定要尽量的去除表皮和脂肪组织。表皮可能会在 后期的培养中出现表皮细胞,导致细胞不纯,且表皮细胞生长迅速,与成纤维细 胞争夺养料影响成纤维细胞的生长;脂肪组织的油滴会妨碍组织块的贴壁,导致 实验失败。 三组织块应尽量剪碎,以利于组织块对营养成分的充分吸收和细胞游离, 但不宜剪成无定形状,这样不利于组织中的细胞存活继而从组织块中游离出。在 剪切组织块时,应适量的加入一些培养基或者,使组织块保持表面的湿润,不 要让组织块干燥。 四原代培养的组织容易被污染,所以在原代实验中要加入双抗进行培养, 应特别注意观察是否有污染的现象,一旦发现应及时处理,以免影响其他细 胞。 五为了便于组织块贴壁,初始接入组织块后加入的培养基不宜过多,否 则组织块容易因为浮力而漂浮或因液体的振荡而脱落。 六在给原代组织换液时,应小心移动培养瓶,因组织块贴壁黏附不牢固, 在观察和移动的过程中动作要轻巧,尽量不要引起液体的振荡而产生组织块漂浮。 对于已经漂浮的组织块,应及时的移除,因为已经漂浮的组织块和很多细胞碎片 中含有不利于细胞生长的物质,影响原代细胞的生长。 七对于准备进行传代的原代细胞,在消化前应先除去贴壁的组织块,尽 量减少组织块的残余。 细胞传代时,吹打的动作应轻柔,尽量减少泡沫的产生,以减少对细 胞的损伤。首次传代接种细胞时细胞量可适度的增加,以便细胞尽快适应新的环 境,利于生长。 九细胞冻存时,在?放置的时间应严格控制,因为在该温度下细胞内 的水分子容易形成冰晶,破坏细胞内的一些细胞器或者细胞膜,影响细胞的存活。 十细胞复苏时,在吸出离心后的上清液时要注意不要将细胞块的形状冲 散,造成不便或者细胞损失。 四、 小结 瘢痕成纤维细胞的活力与组织来源的病人的年龄、体质、部位等因素有密切 联系,通常从年龄小的患者身上取到的组织更容易得到活力好的成纤维细胞。培 养的成纤维细胞单层生长,增殖能力旺盛,当细胞相互接触成片时,呈放射状或 螺旋状排列,直至细胞铺满培养瓶底。当细胞紧密接触时细胞因接触抑制停止分 裂,但仍具有代谢活力,可以继续存活一定的时间。若不及时传代,细胞将老化,齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 有的拥簇成团,最后脱落死亡。由于体外培养的模型不属于细胞株或细胞系,在 体外传代一定次数后细胞的活力下降呈现老化状态,形态发生相应的改变细胞 的体积增大、胞质突起增多、细胞界限不清晰等。体外培养的瘢痕成纤维细胞是 体外研究瘢痕的特征,研究药物对瘢痕细胞的作用及研究其机理的重要载体,其 生长状态对后续的研究有及其重要的作用。福建中医药大学硕士论文 第二章齐墩果酸对增生性瘢痕成纤维细胞 的影响 本研究通过检测凋亡通路上不同时间发生的不同事件,从多角度多位点检测 细胞的凋亡事件,从而确定齐墩果酸是通过诱导凋亡的方式是死亡的。进 一步通过细胞信号通路的研究,初步阐述齐墩果酸诱导凋亡的作用机制。 由于血清中存在着许多可激活与细胞生长有关的信号通路如通路 或诱导有关的细胞因子,在进行后续的信号通路研究或细胞因子的相关研究 时, 会因为血清而干扰实验结果。故在本实验中用血清饥饿的方法。 ,汉语 全称为,.,. 化学名为.,.甲基噻唑..,.二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝。是一 种黄颜色的染料。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中,而死细胞无此 功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,结 晶形成的量与细胞数成正比。通过实验法筛选不同的给药浓度对细胞活力的 影响以及不同的药物作用时间对细胞活力的影响。 正常细胞膜磷脂的分布是部队称的,膜内表面含有带负电的磷脂如磷脂酰 丝氨酸,,而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞发生凋亡的早期, 细胞表面发生变化,细胞膜内部的可迁移到细胞外层表面,并且是不可逆的 转 变。是一种依赖的,对有高度亲和力的磷脂结合蛋白,可作为 探针识别细胞膜表面是否有,将.用进行荧光标记,利用流式细 ,是一种 胞仪就可识别早期凋亡的细胞。核酸染料碘化丙啶 核酸染料.它不能通过完整的细胞膜,但对于凋亡中晚期的细胞和死细胞,能够透 过细胞膜而使细胞核染红.因此将 与匹配使用,就可以将处于不 一 同凋亡时期的细胞区分开来。 ? 细胞发生凋亡时,由于胞浆和染色质浓缩、核裂解,产生凋亡小体,使细胞 的光散射性质发生变化。在凋亡的早期,细胞对前向角光散射的能力显著降低, 对角光散射的能力增加或没有变化。在凋亡的晚期,前向角和角光散射的 信号均降低。因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察凋亡细胞。用 对细胞进行染色,凋亡细胞由于总含量降低,于正常唰细胞群前出现一 低染细胞群,即峰前出现亚二倍体峰.。活性氧 齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 ,是细胞代谢过程中产生的一系列活性氧簇,有研究显示细胞内 的含量与细胞凋亡有密切韵关系,能够诱发一系列的凋亡事件与凋亡蛋白的表达。 还原型.为细胞内的检测探针,其可通过细胞膜及线粒体膜,在线 粒体内经内酯酶作用脱去二酯生成不发荧光的。可被细胞内产生的 氧化生成发荧光的,检测的荧光就可以知道细胞内的水平。 线粒体膜电位的降低也是细胞凋亡的早期事件之一,通过线粒体膜电位的降 低可 导致膜的通透性改变,是内膜中的一些物质外泄至胞质,致使细胞发生凋亡。 罗 丹明 是一种阳离子型的亲脂性荧光燃料,能顺利通过活细胞的细胞 膜和线粒体膜,进入细胞后,可选择性地富集在线粒体上。在正常细胞中,线 粒 体膜电位高, 浓度高,聚集在线粒体并形成多聚体,产生明亮的红色荧光; 对于凋亡细胞,线粒体膜电位降低, 无法聚集于线粒体,以单体的形式停 留在细胞质中,显示绿色荧光。因此通过测定 的荧光强度可以反映线粒体 的膜电位及其膜电位的变化。 一、材料和方法 一实验器材 .试剂 磷酸缓冲液,,美国 胎牛血清,,美国 细胞培养液,美国 二甲基亚砜,,美国 .%胰酶,,美国 链霉素、青霉素双抗液,碧云天生物研究所,中国 甲基四唑蓝,,美国,‘临用前用配制成.% 活性氧检测试剂盒 ,碧云天生物技术研究所,中国 罗丹明粉末分析纯,美国 细胞凋亡检测试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司,中国 细胞含量检测试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司,中国 齐墩果酸含量之%,上海药品生物制品检定所,中国 .材料 细胞培养瓶,美国 孔板,瑞士 孔板,瑞士福建中医药大学硕士论文 移液器德国 .仪器 恒温培养箱.,,日本 倒置相差显微镜,,日本 台式离心机 ,.上海安亭科学仪器厂,中国 双人单面超净工作台一,苏州空气净化设备厂,中国 十万分之一分析天平 ,,德国 漩涡混合器二,上海琪特分析仪器有限公司,中国 全自动定量绘图酶标仪 ,,美国 流式细胞仪, ,美国 二、 实验方法 .药物配制 由于齐墩果酸的理化性质,不易溶于水溶性介质中,且易于从溶液中析出, 所以本实验中所用的齐墩果酸溶液不配制成母液,而是以临配临用的方法。 实验 前先秤取适量的齐墩果酸,加入适量的溶解,再加入所需的培养基 %%。 .无血清饥饿处理 由于血清中含有多种的细胞因子,可对细胞的信号转导产生干扰,故在本实 验中,细胞给药前,弃去含血清的培养基,用清洗两遍,加入不含血清的 培养基培养,在分别加入所需的含药培养基进行给药处理。 . 不同给药浓度和不同给药时间对细胞活力的影响 取对数生长期的,用.%含胰酶消化,加入新鲜含%的 培养基吹打,并调整细胞浓度到/,以“/孔接种于孔板中, 在%,?的细胞培养箱内培养,饥饿处理弃去培养基,用清洗 ? 两遍,加入不含的后,弃去培养基,加入不同浓度的含药培养 基 不含配制,每个浓度做平行复孔个,在%,?的细 胞培养箱内培养,分别于,,三个不同时间点对细胞进行拍照图, 再加入.%的液“/孔,继续培养后弃上清,加入 ,振 荡 。在 检测波长下,自动酶联免疫分析仪测定值,实验重复三 遍。 齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 % :‘’, 一 习蔼哥囊勇, ?眦.。 暑童;; ,焉毒;; ‖。『;笋。垂;,“ 尧二山舡?.“曲押舶铮一二 删 ‘.’’’ 。吣婀,鼍 种“?’‘‘”警?麓二帮‘?气’ 。’吲 , ? 如 、?~ 篁 ’? .. 护 一、 ’飞 《 。,,。蚕 ? ’ 、 ’. ’” 。: . ’ ,: 萼 。、 . .., :. , 口 ‘ , , , , ,, ? 夸 譬 . 毋’ 一. ,, 。 。卉’ “.,. 。。,,‖ ;一童镐 ,慕诤。。%.慨彬。、,一、.氏扣摊叱掣。舀 / / 秽‘卿枷弦啁妒『碍酽叩“。昏?“、 ;。一 瞥啊孵嘲喇嘲即嗍忡习妒哎‰一?”节蠹 ’ ‘ . 一 .‘ 雩 ‘; ?“??盘 争“,,;,氛 十 潆 彬 波 籼 牛 如矗.‰‘... , .矗椭:~磬嘞,二、。, 州,.% 。 /么 卸柚 , 吖肿一一彤一飞 簧 。’ ‘ 々’ 习 、 ? 一 莲 ~ 扣 ~ 甜 , “ 一。舅 一福建中医药大学硕士论文 ?辉岬烨啊畔惭蟑即’罚戳‘ 、 强日喝,. 《 ,,嗨,., . 孰 譬 致。,.产,。,。、,。臀:。。,,,。、。 医?镒函谴铀蛹幽兰幽幽《.幽“漱二 ‘。 篮 . , 咿口‘哆黔?萨‰磺帅‘赫妒僻叩甓”喝 ? , , 黟忡。、?》....‰。,海矗星~,二数 ” 山孙 ,心弘~ , .? .~ ??:霉吨。 鞫萱:堪。,奠前 。一 一 . 姻/棚 ‖ 圈.不同浓度齐墩果酸作用不同时闻对的形态影响 ? 明皿三 . .细胞凋亡率 取对数生长期的.代,用.%含胰酶消化,加入新鲜含% 的培养基吹打,并调整细胞浓度到/,孔接种于孔板中。 在%,?的细胞培养箱内培养后饥饿处理弃去培养基,用清洗 两遍,加入不含的后,弃去培养基,加入、. /、 /、 不含配制。药物作用后,弃去 /不同浓度的含药培养基 含药培养基,用不含的胰酶消化,弃去胰酶加入培养基终止消化,用移液 器轻轻吹打细胞成悬液后,将细胞悬液移至离心管中, /离心 收集 /离心 细胞,用洗涤细胞两次 收集.×细胞。加入 此的 悬浮细胞;加入此 混匀后,加入此 ,混匀;室温、避光、反应. ,流式细胞仪检测激发波长 。 为 ,发射波长为 的绿色荧光通过通道 检测;红色荧光通过通道或检测。用未经凋亡诱导处理的正常 细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置图。齐 墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 。 . 细胞含量检测 取对数生长期的.代,用.%含胰酶消化,加入新鲜含% 的培养基吹打,并调整细胞浓度到/,/孔接种于孔板中。 在%,?的细胞培养箱内培养后饥饿处理弃去培养基,用清洗 两遍,加入不含的后,弃去培养基,加入、. /、 /、 “/不同浓度的含药培养基 不含配制。药物作用后,弃去 含药培养基,用胰酶消化,弃去胰酶加入培养基终止消化,用移液器轻轻吹打 细 胞成悬液后,将细胞悬液移至离心管中, /离心 收集细胞,用 洗涤细胞两次 /离心 收集细胞。制备的单细胞悬液用体 积分数为%的乙醇固定,?保存,染色前用洗去固定液;加入 ?水浴 瞳;上流式细胞仪 .;再加入此染色混匀,?避光 检测,激发波长为 处红色荧光图。 .活性氧检测 按照:用不含的培养基稀释.,使终浓度为 /待用。取对数生长期的.代,用.%含胰酶消化,加入新 鲜含%的培养基吹打,并调整细胞浓度到/,/孔接种 于孔板中。在%,?的细胞培养箱内培养后饥饿处理弃去培养基, 用清洗两遍,加入不含的后,弃去培养基,加入、. /、 不含配制。后去除含 /、 /不同浓度的含药培养基 药的细胞培养基,加入. ,..细胞培养箱内孵育 。用洗涤三遍, 以充分去除未进入细胞内的.。加入不含的胰酶消化,弃去胰酶后 / 加入 的缓冲液,吹打混匀成细胞悬液,转移至离心管中;以 离心 ,吸弃上清液,加入 的缓冲液吹打均匀,上流式细胞仪检 测。的荧光光谱和非常相似,可以用的参数设置检测 图。 检测通道,激发波长为 ,发射波长为 .细胞膜电位检测 秤取适量罗丹明粉末用缓冲液配制成浓度为 /的溶液,待用。取 对数生长期的.代,‘用.%含胰酶消化加入新鲜含%的 培养基吹打,并调整细胞浓度到/,/孑接种于孔板中。在 %,?的细胞培养箱内培养后饥饿处理弃去培养基,用清洗两 遍,加入不含的后,弃去培养基,加入、. /、 /、福建中医药大学硕士论文 “/不同浓度的含药培养基 不含配制。后吸除含药培养基, 加入不含的胰酶消化,弃去胰酶后加入培养基终止消化,吹打混匀成细胞 悬液,转移至离心管中:以 /离心 ,吸弃上清液,加入缓冲液 ,上 洗涤次,加入预制的的罗丹明溶液肛,?细胞培养箱内孵育 流式细胞仪检测细胞膜电位?‰检测通道,激发波长为 ,发射波长 为 图。 二、结果 ?一、阳 一不同给药浓度和给药时间对细胞活力的影响 本实验中考察了个不同给药浓度和个不同时间点齐墩果酸对活力的影 响,结果见下图。结果显示图,在低浓度给药时“/对细胞的活力 有一定的促进作用,但无显著性的差异。随着药物浓度的增大,齐墩果酸表现 出 增殖抑制的作用,且呈现剂量和时间以来关系。通过本实验的结果,确定后续 的 实验浓度分别采用、、 /进行。从细胞形态中可观察到;当给低剂量 刺激时,细胞对刺激作出反应,可收缩变圆,但细胞活力保持不变,随着刺激 强 度的增大,细胞变形,发生活力下降。当给药浓度大于肛/后,细胞对与药 物的刺激无太大的形态变化,但从显微镜中观察到,细胞的边界不清晰,培养 板 的底部呈现弥漫状。 的 ? ? 纶 船 ? 一上?三墨口,篁五直鲁 ? 舱 齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 ? : ? 高 搬? 的? 邑 鼻 的? 童 工 , ?盼 暑 ?? 卅嫩 鼢 雠 ? 一看.苫芒言暑暑 舱 。 臼 .?幸. 曙 锄.. ; 舔 圈.不同给药浓度和给药时间对细胞活力的影响 .矗鹤细胞凋亡率检测 在细胞凋亡的流式图的四象限中,左上象限代表分正常死亡的细胞,可能是 实验过程中造成的细胞破损导致的;左下象限代表正常的细胞,对两种染料 均拒 染,即细胞膜完整对不通透且无的外翻;右上象限表示晚期凋亡的细胞, 即细胞膜的外翻,且膜的完整性被破坏,。对通透,细胞核被染色;右下象 限代表早期凋亡的细胞,细胞膜的外翻,但膜完整对不通透,细胞核未被 福建中医药大学硕士论文 染色。从凋亡双染的图图可看出,空白组的凋亡率在.%,给药刺激后 的凋亡率分别为.%,.%币 .%,呈现剂量依赖的关系。说明齐墩果酸 能够诱导凋亡,且与浓度呈正相关的关系。 ? . . .% .% ? ?.?? ? ?? ~ ??.?苛”。.’ 荣蓦. 鳢 苞 互 ’、馓‘ 矗饕:;。 鞲箩’ 爹‘ 。瀵 ‘,;叠’ 熬 :.笔囊;?’ .% .% . / % ,:. .?粥 罐. ; ~., 毒乞: 器 黟? .% 谢 / / 图.细胞凋亡的流式检测图. 四的含量检测 在流式含量测定的图中,最高的峰表示的是的含量,紧 接着后面的较平缓的为期和的含量.,.最后一个峰表示期的 含量,当细胞放生凋亡时,由于反生的裂解,细胞内出现裂 解,总含量,所以在峰前出现一个小峰,即.峰。从图上图 齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 可知,在空白组和低浓度组删中,无明显的.峰出现,但在中浓 度组 /和高浓度组删中,出现明显的.峰,表明在浓度 的刺激下细胞出现明显的含量变化,发生明显的凋亡。 / / 图.含量流式图 . 五活性氧的检测 图上的区域表示与相关的荧光值,从图中图】可看出,在加入药物 刺激后,细胞内的水平未见增长,反而出现了降低的情况。实验结果说明, 在其齐墩果酸诱导的的凋亡中,可能不是通过增加细胞的水平来产生后 福建中医药大学硕士论文 续的凋亡效应的。对于细胞内水平的降低,目前尚未有更明确的解释说明 有待后续的深入研究。 / 峙枷 图.的流式检测图 . 线粒体膜电位的检测 从图上图可看出,空白组的荧光强度值最大,随着给药浓度的增大,细 胞线粒体膜电位的荧光值显著下降,当浓度达到 ./线粒体的膜电位基本崩 溃,细胞发生严重凋亡或坏死。 ??齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 // / 图.线粒体膜电位的流式检测图 . 三、分析与讨论 增生性瘢痕的形成与成纤维细胞的异常增生与凋亡障碍密切相关,且成纤维 细胞是细胞外基质的主要分泌细胞,所以诱导成纤维细胞的凋亡对与瘢痕的 治疗 有着极其重要的意义。细胞凋亡是一个在自身程序控制下的自发性的死亡过 程, ,。在体外细胞凋亡的形态 也称为“程序性细胞死亡 学上可分为个阶段:?凋亡的起始,这个阶段的变化主要表现为:细胞表面的 特 化结构小时,细胞间接触小时,但胞质膜依然完整,为失去选择通透性;胞质 中, 线粒体大体完整;细胞核内染色质固缩。?凋亡小体的形成,首先,核染色质断 福建中医药大学硕士论文 裂为大小不一的片段,与某些细胞器和线粒体等聚集在一起,被反折的胞质膜包 围,最后相互分离开来形成凋亡小体。在体内,凋亡小体最后被吞噬细胞所吞噬, 残余物被重新利用。由于整个过程中无胞内物质的释放,因此也不引发机体的炎 症反应】。 线粒体是调控细胞增殖、生长、死亡的重要细胞器,是胞内能量代谢的重要 部位,在细胞凋亡的过程中处于中心位置。它是许多外源性和内源性的化合物最 敏感也是最早受累的损伤靶点,特别是在氧化损伤中。线粒体膜的通透性转变是 细胞凋亡发生的先导,线粒体的内膜含有合酶、电子传递体等物质,在生理 条件下这些物质维持着电化学梯度。当外源性或内源性的信号传递至线粒体上, 导致线粒体膜上的通道不可逆的过渡开放,导致线粒体跨膜电位的崩解,呼吸链 界偶联,线粒体机制渗透压升高,内膜肿胀,位于膜间隙的细胞色素 等释放至胞浆?。 是细胞凋亡的关键物质,它能与结合形成复合体, 在进一步的募集.的前体,令其自身活化并启动并启动的级联, 导致下游执行凋亡的关键蛋白.和的激活副。 是需氧生物利代谢过程中产生的一类性质活泼的物质,各种促凋亡信号 都可引起细胞内源性或外源性的升高或氧化还原水平的改变,进而促发凋亡 信号转导途径。的堆积能够激活线粒体上非特异的膜通道开放,导致细胞 凋亡四。还可导致内质网腔内的钙离子释放入胞浆,引起线粒体的膜电位崩 解瑚。但是在本实验中,检测的水平并没有升高,反而是出现随给药剂量的 增加而减少的趋势,目前仅在极少量的文献且年代久远的文献上有报道水平 降低与凋亡的关系‘一,因此关于本实验中细胞凋亡与水平降低需进一步进 行实验设计研究。 综上所述,通过不同的检测方法:/膜双染、含量检测、线 粒体膜电位等三种不同方法检测确定了齐墩果酸能够诱导的凋亡,并且通 过的测定,表明了齐墩果酸对的诱导可能不是通过增加胞内水 平而产生凋亡诱导的作用。齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 第三章齐墩果酸诱导增生性瘢痕成纤维细 胞凋亡的通路研究 。 细胞凋亡的过程是一个将死亡信号通过复杂的信号网络进行转导的过程,不 仅有许多的信号通路参与其中,并且这些通路与通路之间还存在着“串话” .,共同调控着细胞的凋亡。其中蛋白家族在凋亡执行的过程 中起着重要的作用,是近年凋亡调控机制研究的热点。.是细胞凋亡的关 键执行蛋白,其位于级联反应的下游,通过降解细胞内的相应底物使细胞凋 亡。 通过执行凋亡的成为依赖的凋亡通路,在细胞中还存在着一类不 依赖于蛋白的凋亡通路,它可通过凋亡诱导因子 产生作用。存在与线粒体内膜,在凋亡过程中,从线粒体转移 到胞质内,然后进入细胞核,引起核内凝集并断裂成片段。 在凋亡信号转导的上游,受许多信号通路的影响,其中通路是最重要 ,是 的一条。丝裂原活化蛋白激酶. 细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,将细胞外的刺激信号转导至胞质及 其核内, 并引起细胞生物学反应,如细胞增殖、分化、转化及凋亡。在通路中, 和通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥着重要的作用。这些通路通过磷 酸化相应的蛋白而开启,产生作用。故本实验通过用 的方法检测细胞 中的磷酸化、磷酸化、和四种蛋白的表达情况来研究齐墩 果酸诱导的凋亡的通路。 材料和方法 一实验器材 .试剂 及细胞裂解液,碧云天,中国 ,美国 蛋白质定量试剂盒,上海康成生物工程公司,中国 ,, ,美国 三羟甲基氨基甲烷,华美,中国 丙烯酰胺,美国 ’双丙烯酰胺,美国 福建中医药大学硕士论文 美国,美国 甘氨酸上海制剂三厂 ,美国 ,美国 巯基乙醇,美国 磷酸化抗体, ,美国 磷酸化抗体, ,美国 抗体, ,美国 抗体, ,美国 抗体, ,美国 标记的抗兔、抗小鼠二抗上海康成生物工程公司,中国 蛋白预染碧云天,中国 膜,美国 滤纸,英国 丽春红,美国 . 考马斯亮蓝.,美国 脱脂奶粉内蒙古伊利实业股份有限公司,中国 , 发光剂, 美国 显影液、定影液上海冠龙照相器材公司,中国 光感光胶片,美国 .仪器 双人单面净化工作台二.,苏州净化有限公司,中国 恒温培养箱.,,日本 移液器德国 水平电泳仪、电泳槽 ,?,美国 超低温冰箱. 眈,,美国 恒温振荡器.,上海之信仪器有限公司,中国 台式高速冷冻离心机.,上海安亭仪器厂,中国 调温水平摇床上海离心机械研究所,中国 恒温烤箱,日本 凝胶成像系统 ,美国 二实验方法 .细胞总蛋白的提取 ....一?????? 一齐墩果酸治疗增生性瘢痕的作用机制 取对数生长期的代,用.%含胰酶消化,加入新鲜含% 的培养基吹打,并调整细胞浓度到,/孔接种于孔板中。 在%,?的细胞培养箱内培养后饥饿处理弃去培养基,用清洗 两遍,加入不含的后,弃去培养基,加入、 ./、 /、 不含配制。分别药物作用、、 /不同浓度的含药培养基 后,从以上培养皿中小心吸去贴壁细胞培养液,用预冷的清洗贴壁的细胞 次,配制含抑制剂的蛋白质抽提试剂抽提试剂中加入此蛋白酶抑制剂混合 液, 和此磷酸酶混合液,孔板中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽 抽提试剂, 提试剂个细胞中加入 抽提试剂;个细胞中加入. 轻轻摇动 ,用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养板上贴壁细胞刮下来,转移 细胞悬浮液到离心管中,冰浴下摇动 进行裂解。裂解液于预冷的离心机中 。弃去沉淀,上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。 离心 . 蛋白检测 . 法定量蛋白质 配置工作液:以试剂:试剂为的比例混合, 配制得到工作液。每孔需配置的工作液。 步骤样品::: ?分别吸此品到微孔板的对应孔中浓度为,嵋/。 ?分别吸取.此待测样品至微孔板对应孔中,并加入.肛稀释液。 ?每孔加入儿的,震板秒以彻底混合均匀。 。 ?盖好微孔板,。孵育 ?冷却至室温。 ?测量 附近. 皆可以使用的各孔吸收值。 ?测得的每个标准孔和待测样品孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值. ?以校正过的标准蛋白 测量值对其浓度./做图绘制标准曲 线。使用标准曲线定量待测样品蛋白浓度。 . .电泳 .: ?制备分离胶 猛膣邃度 竖