三倍体雌性虹鳟卵巢发育的类雄性化趋势

三倍体雌性虹鳟卵巢发育的类雄性化趋势 三倍体雌性虹鳟卵巢发育的类雄性化趋势 第17卷第4期 2010年7月 中国水产科学 JournalofFisherySciencesofChina Vo1.17No.4 July2010 三倍体雌性虹鳟卵巢发育的类雄性化趋势 韩英,刘蔓,张澜澜,李海龙 (1.东北农业大学动物科学技术学院,黑龙江哈尔滨150030;2.黑龙江省渔业经济研究所,黑龙江哈尔滨150018) 摘要:以4,35月龄三倍体雌性虹鳟(Oncorhynchusmykiss)~实验材料,以同源二倍体为对照,采用组织学和放射免疫方法, 从性腺发育和生殖激素变化2个方面对其类雄性化现象进行了研究,并分析了类雄性化的原因.结果表明,三倍体虹鳟的 卵原细胞可正常发育至卵黄发育前期卵母细胞(8月龄左右),此后卵母细胞败育,基质细胞包围卵原细胞形成卵原细胞簇, 17月龄后卵巢中卵原细胞簇减少,出现与雄性精小囊结构相似的类生精细胞囊结构;26,35月龄类生精细胞囊逐渐成为 性腺的主要成分,在类生精细胞囊内出现大量坏死的细胞;13月龄后三倍体雌性虹鳟血清中GtH—I,GtH—II,17g—E2含量 显着低于同期二倍体虹鳟,睾酮(T)在21月龄后持续上升,并显着高于同期二倍体(P<0.05).17月龄后三倍体雌性虹鳟卵 巢发育呈现类雄性化趋势,但不能完成精子发生全部过程.由于性腺中生殖细胞与体细胞之间正常的相互作用缺失,合成 类固醇的滤泡细胞发育分化受阻,T芳化为17fl—E,途径中断,导致血液中T浓度升高,进而使性原细胞的分化受到了诱导, 因而卵巢发育呈现类雄性化趋势.【中国水产科学,2010,17(4):739,744] 关键词:三倍体雌性虹鳟;类雄性化;卵巢发育;生殖激素 中图分类号:$96文献标识码:A文章编号:1005—8737一(2010)04—0739—06 虹鳟(Oncorhynchusmykiss)是重要的冷水性养 殖鱼类,在中国已有50年的养殖历史.由于长期的近 亲繁殖以及缺乏系统的选育,虹鳟养殖中出现了性早 熟,个体小型化,病害滋生等问.三倍体虹鳟雌性 不育,可将用于生殖的能量用于体细胞生长,因此个 体较二倍体虹鳟大,群体产量高,含肉率高,并可避免 生殖过程中生长衰退,肉质降低和死亡加剧等不良影 响,因而得到广泛利用"'.,在法国,英国和日本,三倍 体虹鳟养殖已成功进入商业化生产,在中国也进入了 实用化生产阶段. 中国三倍体虹鳟制种技术较为成熟,但有关三 倍体虹鳟的生殖发育研究较为滞后.据Krisfalusi 等报道,三倍体虹鳟卵巢发育异常,其卵母细胞 缺失,滞育或畸形;Lincoln等,Carrasco等b研究 报道,三倍体雌性虹鳟在10,15月龄卵巢中出现 生精样细胞.上述研究多取材于某一发育阶段,仅 研究了性腺组织学或生殖激素某一方面,缺乏对整 个发育过程及生殖调控的系统了解,也未就其发育 趋势和机理进行深入探讨.本实验以二倍体虹鳟 为对照,对4,35月龄三倍体雌性虹鳟的性腺和配 子发育进行组织学研究,并同步测定促卵黄生成激 素(GtH—I),促性腺成熟激素(GtH—II),17fl一雌二醇 (17fl—E)和睾酮(T)的变化,旨在系统了解三倍体 雌性虹鳟性腺发育全过程及其生殖调控特点,并对 三倍体雌性虹鳟类雄性化趋势及其原因进行分析, 旨为该品种的育种和养殖生产提供科学依据. 1材料与方法 1.1样本来源 实验用鱼来源于黑龙江水产研究所渤海实验 收稿日期:2009—09—11;修订日期:2010,O1—11. 基金项目:黑龙江省科技攻关项目(GAO6B203). 作者简介:韩英(1963-),女,教授,博士生导师,主要从事水生动物遗传育种与繁殖的 研究.E-mail:hanying_ 606@163一m 中国水产科学第17卷 站.采卵后,进行人工授精,一半卵正常孵化,用于 培育对照所用二倍体;另一半卵采用热休克法诱导 三倍体,受精后10min,26?处理20min.冷泉水流 水养殖,水温10,18cI=.经红细胞体积法和流式 细胞法确定其倍性.随机抽取受精后发育正常的 4,35月龄(用于显微和超微切片),11,35月龄(用 于生殖激素测定)三倍体和二倍体虹鳟各30尾,用 0.5mI几苯氧乙醇麻醉2,3min后,将样本编号标 记,先采集血样,后采集性腺样本. 1.2光镜和电镜切片制作 三倍体虹鳟从外观上难以分辨性别,必须通过 解剖观察.4月龄性腺性别肉眼无法确定,只能标 记后切片观察.8月龄后卵巢表面有微血管,用肉 眼即可与精巢区分开来.剖腹采集性腺并用PBS冲 洗血渍,经Bouin'S液固定,石蜡包埋,HE染色,切 片厚度5m,样本在Olympus—CH20,~微镜下观察, Moticam480系统采集图像;同时采集电镜样本,用 2.5%戊二醛固定,环氧树脂一812包埋,醋酸双氧铀, 柠檬酸铅染色,切片厚度5000,7000nm,样本在 TecnaiG2型透射电子显微镜下观察,拍照. 1.3性激素测定 尾静脉采血,制备血清,一80?保存待测.根据 解剖和切片结果,对照标记,选取雌性血样,采用放 射免疫法测定GtH—I,GtH—II,17/3一E2和T含量,放 免试剂盒为北京华英生物技术研究所生产(挖I—Na 为英国Amersham公司生产,GtH—I,GtH—II,17fl—E2 和T抗原及抗体为美国SIGMA公司生产). 1.4数据处理 数据分析采用SPSS软件进行,Excel~lJ图. 2结果与分析 2.1性腺发育 4,8月龄三倍体虹鳟卵巢发育与二倍体无异. 4月龄卵巢呈透明线状,被腹膜形成的白膜所包被, 白膜下为柱状上皮,卵巢中仅有靠近卵巢基膜的椭 圆形卵原细胞,胞径(21.34+_2.91)m,大于二倍体 [(16.45?3.55)m];卵原细胞核占据细胞的大部分, 核中央有1个较大核仁,核旁有类核周体;基质中分 布少量基质细胞,无滤泡细胞.8月龄卵巢透明扁带 状,表面有少量微血管,内部出现产卵板,卵母细胞 发育至卵黄发生前期,直径为(34.20+8.1O)岬,核 仁多个分布于核膜内侧并有外排现象;胞质中出现 外周环;卵母细胞外有单层扁平的鞘膜细胞(图版 I—a);电镜下卵母细胞核内可见联会复合体. 10,13月龄三倍体卵巢呈粉红色三棱状,发 育出现异常.卵母细胞染色质聚集于核中央或一 侧,出现破裂,坏死等败育现象(图版I-b);多个卵 原细胞被基质细胞包围,形成卵原细胞簇(oogonial cluster,图版I—c),簇内常可见坏死的卵原细胞(图版 I—d),其旁可见核膜清晰,核仁较大的吞噬细胞,细 胞内可见吞噬囊泡(图版I—e).卵原细胞簇壁较厚, 基质细胞异常发达,形状不规则,胞质富含线粒体和 核糖体,无滑面内质网.基质细胞与卵原细胞间紧 密连接,无微绒毛结构(图版I—f).卵巢基膜附近有 少量卵原细胞游离于卵原细胞簇之外. 17月龄后I生腺前部仍为三棱状,后部线状.卵巢 中除了卵原细胞簇之外,还出现了与雄性精小囊结构 相似的类生精细胞囊(spermatogenic—likecflocy~)结构 g).类生精细胞囊壁比卵原细胞簇壁薄,囊内 (图版I— 类生精细胞深染,胞径(12.36?2.42)?,比卵原细胞 小而数量多,染色质呈颗粒状,胞膜不清.26,35月 龄依然有少量的卵原细胞簇,而类生精细胞囊成为性 腺主要成分,卵巢类雄『生化更为明显.囊壁基质细胞 分化出柱状的类支持细胞和长梭形类边界细胞(图版 I_h).结缔组织发达,部分区域成纤维细胞深人生殖 细胞之问将其分隔,包围(图版I—i).26月龄后类生精 细胞囊内出现大量坏死的细胞(图版I_j).基膜附近 有少量残存的卵母细胞,其外有正常发育的滤泡膜. 解剖样本中未观察到精液. l7月龄和26月龄样本中,分别有4尾和5尾出 现了小管样结构(图版I—k).管腔中有泡状,胶状物 质,管壁中可见具椭圆形深染核的细胞.35月龄有 1尾样本电镜下可见管内壁有密集的纤毛,管腔中 有形状不规则的细胞,核内染色质浓聚,核外有极薄 第4期韩英等:三倍体雌性虹鳟卵巢发育的类雄性化趋势741 且多空泡的胞质,似败育的精子细胞,管腔内有数根 轴丝,其横切面显示由微丝组成,似精子尾部(图版 I—1). 2.2生殖激素含量的变化 三倍体雌性虹鳟血液GtH—I水平在11,13月 龄与二倍体无显着差异,13月龄后呈现不规则波动, 与二倍体差异显着(P<0.05);血液GtH—II水平在 11,17月龄与二倍体无显着差异,但在21月龄出现 峰值,显着高于同期二倍体(P<0.05);17fl—E:在整 个检测期间呈低水平波动,1l,13月龄与二倍体无 显着差异,21,35月龄有增加的趋势,但显着低于 同期二倍体(P<0.05);血液T水平呈逐渐上升趋势, 26月龄后显着增加(P<0.05),并显着高于同期二倍 体(P<0.o5),详见表1. 表1不同倍性雌性虹鳟血清中生殖激素的含置变化 Tab.1ContentofreproductivehormoneinserumofdifferentploidyfemaleOncorhynchusm ykiss n=30:?SD H.Ageof2 n 体璐 3n 体H.Ageof2 n 体璐 3n 体 1119.76?2.6320.88?3.021115.13?2-3015.26?2.65 1318.17?3.572l_31?3361315.03?2.5418.46?5.35 1720.26?3.95h'0—一1d1722.47?3.78hA18.98?4.15 (u OH . - I/ )221.89~6.29::4i.JJM~x*wt4Je:.22s52bA. 65.014-14.56.B 2624.99?3.9614.97?2.59"2623.33?4.5413.34?1.98. 3127.02?3.54.74?.52~513135.76?3.1615.O4?4.16 354.90?1.247.01+1.033539.25?5.1223.54?9.24~ 1152.17?14.0336.42?12.14118.67?4.297.19?1.54 1360.46?19.45aA49l32?19.231328.49?12.5234.79?10.86 1770.13?26.53d38.82?20.89T,1750.06~12.6562.65?14.53b r 17/~-E T J 一 ,21103.16~24.29dA45. 93-4-20.87f.( ng?mL-)2144.67~12.5879.77~19.41bL pg.m川 26278.65?55.2651.09?19.53B26136.70?24.19191.74?28.29 31591.43?76.53105.43?32.8731176.54?20.46265.74?26.87 35169.14?29.87193.44?41.5935231.78?89.26396.12?98.43 注:同行上标表示倍性差异,同列下标表示月龄差异;相同字母表示差异不显着(P>O.05),相邻字母表示差异显着(P<0.05),相间字母表 示差异极显着(P<0.01). Note:Superscriptsrepresentcontrastofdifferentploidyinthesameseries;subscriptsreprese ntcontrastofdifferentmonthsinthesameline.Same lettersrepresentnosignificantdifference(P>0.O5);e]osetogetherlettersrepresentsignif icantdifference(P<0.05);partinglettersrepresent exceedinglysignificantdifference(P<0.01). 3讨论 3.1类雄性化的组织学分析 三倍体虹鳟卵巢经历了异常的发育过程,其主 要特点是卵原细胞的持续存在,类精子发生区域的 逐渐出现和非卯泡成分的极度发达.卵原细胞可正 常发育至卵黄发育前期卵母细胞,此后卵母细胞败 育出现卵原细胞簇,再发育到出现类生精细胞囊,与 卵原细胞簇并存,最后类生精细胞囊成为性腺的主 要成分,卵巢呈现类雄性化. 多倍体动物卵巢发育过程中出现精巢样结构 并非偶然.三倍体鸡卵巢能够逐渐转变为卵精巢; 三倍体两栖类减数分裂前卵母细胞退化,性腺最终 向雄性逆转;Carrasco等b报道了三倍体虹鳟卵母 细胞可发育至皮质泡出现,15月龄后卵巢中出现生 精样细胞,呈现雌雄嵌合现象,随后许多雄性分化区 进入精子发生晚期,在胞囊中心可见形态异常的精 子;Krisfalusi等在10月龄三倍体虹鳟卵巢中也发 现了生精样细胞;桂建芳等在三倍体水晶彩鲫卵 巢中发现有类似于精巢的组织;成嘉n..在四倍体鲫 鲤杂种雌性F的卵巢中,发现许多分化程度较低的 742中国水产科学第17卷 小细胞,其排列似精巢中呈囊状排列,进行同步分裂 的精原细胞,并将其称之为精原样细胞;刘少军等n1] 发现三倍体湘云鲫卵巢主要由体积较小,分化程度 较低,呈囊状排列的细胞组成. 性腺的分化与发育涉及复杂的生殖细胞一体细 胞的相互作用.Hashimoto等"研究发现,小鼠卵巢 体细胞分化需要特定的体细胞与生殖细胞的相互作 用,而精巢体细胞则不需这种互作,可自动分化为支 持细胞和间质细胞.关于三倍体卵巢发育中体细胞 的变化未见报道.本实验在观察三倍体虹鳟卵巢中 生殖细胞变化的同时,还观察了性腺体细胞的相应 变化,即最初由基质细胞分化为滤泡细胞,然后随着 卵泡的败育和卵原细胞簇出现,基质细胞包围卵原 细胞,直至分化出类边界细胞,类支持细胞.三倍体 虹鳟卵巢中卵原细胞簇壁有异常发达的基质细胞, 其胞质中没有能够分泌类固醇的滑面内质网,与卵 母细胞间没有微绒毛通道,从而阻止了生殖细胞和 体细胞的相互作用,抑制了恰当的滤泡细胞分化. 在这种情况下,卵巢体细胞有可能自动分化为雄性 支持细胞,分泌雄性类固醇,导致卵巢重组成为生精 组织.这一推测尚需进一步的细胞学和分子生物学 实验所证明. 35月龄样本电镜下观察到败育的类精子细胞 和精子尾部的鞭毛.Carrasco等也发现44月龄三 倍体虹鳟卵巢雄性分化区虽已进入精子发生晚期, 但精子形态异常.实验结果表明,尽管i倍体卵巢 类雄性化,但不能完成正常的精子发生,这是染色体 三倍化所致.三倍性对雄性虹鳟的影响主要在于精 子发生的最终阶段,导致出现大量败育的精子细胞 和少量形态异常的精子. 3.2类雄性化的生理学分析 与二倍体相比,三倍体雌性虹鳟生殖激素分泌 水平在13月龄(GtH—I,17fl—E,)后和17月龄(GtH一 ?,T)后出现了异常,说明随眷l生腺结构的改变,其 生殖内分泌机制也发生了相应的变化. K0bayashi等n,中村将等和Lincolntfful1对 虹鳟,以及Basant等u和Schafhauser等'对三倍体 美洲红点鲑(Salvelinusfontinalis)的研究结果表明, 雌『生三倍体鱼类血液T含量低于二倍体.本实验结 果显示,三倍体雌性虹鳟血液T含量在21月龄后持 续上升,高于同期二倍体,其原因与卵巢组织结构的 变异有关.卵巢中滤泡细胞分为外层的鞘膜细胞 和内层的颗粒细胞层,鞘膜细胞先出现,然后再分化 出颗粒细胞.鞘膜细胞层在GtH作用下由胆固醇合 成T,然后转移到颗粒细胞层,芳化为17一E.三倍 体雌性虹鳟8月龄卵巢中已出现单层的鞘膜细胞但 始终未见颗粒细胞,导致T不能芳化为17g—E,而积 累,呈现较高水平.体细胞诱导信号或性腺类固醇 激素环境对生殖细胞的分化直至配子形成有重要的 作用.较高含量的睾酮使三倍体雌l生虹鳟性原细胞 的分化受到了诱导,此研究结果从生殖内分泌角度 为三倍体雌』生虹鳟发育后期的类雄}生化趋势提供了 新的证据.三倍体雌性虹鳟各发育期肝脏,血液和 性腺组织中卵黄蛋白原均呈阴性,说明低水平的 17fl—E,不足以诱导肝脏合成卵黄蛋白原,卵泡中的 卵母细胞也就不能完成卵黄发生和成熟,导致败育. 根据上述组织切片,超微切片以及生殖激素分泌 水平分析可以确定,三倍体雌『生虹鳟在性腺发育过程 中逐渐呈现类雄性化.而其卵巢中的类生精细胞形 态结构与精巢的生精细胞很相似,能否确认类生精细 胞就是生精细胞,尚有待于进一步的实验证明. 参考文献: [1]工炳谦,徐连伟,贾钟贺,等.热休克诱导全雌虹鳟三倍体[J].水 产学杂志,2005,18(2):22—27. [2]KrisfalusiM,CloudJ.G.Gonadalsexreversalintriploidrainbow trout(Oncorhynchusmykiss)?.JExpZoolPartA:Comparative ExperimentalBiology,1999,284(4):466-472. 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Virilescent-liketendencyoftriploidfemalerainbowtrout(Oncorhynchus tykiss)duringtheProcessofovariandevelopmentmvkissduringtlleProcessovarlandevelopmentJ HANYing,LIUMan,ZHANGLanlan,LIHailong (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.HeilongjiangFisheries EconomyResear~?hInstitute,Harbin150018,China) Abstract:Triploidfemalerainbowtrout(Oncorhynchusmykiss)of4-35monthsoldweresampled(diploidsatthe samestageascontrols)andanalyzedusinghistologicalandradi0immunoassay.Fromtwoaspectsofbothgonadal developmentandchangesofreproductivehormone,wetriedtoexplorethevirilescent— likephenomenonandfindout themechanismofit.Theresultsdisplayedthatoogoniumoftriploidcouldnormallydevelopintoprophaseoocytes ofvitellinedevelopmentatabout8monthsoldafterthesenecrosisoccurred.Oogoniumweresurroundedbystroma cellstoformoogonialcluster,after17monthsoldwhenthenumberofoogonialclusterdecreased,formingastructure whichresembledspermatogonialcystsinmaleandwerenamedspermatogenic— likecytocysts.Spermatogenic-like cytocystsbecamethemajorcomponentsofgonadinthesamplesfrom26to35monthsold,andmanynecroticcells wereinit.BloodhormonelevelsofGtH—I,GtH—IIand17fl— E2weresignificantlylowerthanthoseindiploidafter 13monthsold,respectively.BloodTlevelexperiencedaconstantlyrisingprocessafter21monthsoldandwas higherthanthatindiploid(P<0.05).Theresultsindicatedthat17一month— oldtriploidfemalepresentedatendency ofvirilescent,butdidnotexperiencethewholeprocessofspermatogenesis.Becauseoflackofnormalinteractionsof somaticcellsandgerminalcells,developmentanddifferentiationoffolliclecellsinwhichsteroidsynthesizedwere blocked,thepathofTarylatedas17fl— E2wasinterrupted,resultinginarisinglevelofbloodTandtheninducing thedifferentiationofgonocytes,makingthegonadpresentthetrendofvirilescent.[JournalofFisherySciencesof China,2010,17(4):739—744] Keywords:triploidfemalerainbowtrout;virilescent— likephenomenon;ovariandevelopment;reproductivehormone 韩英等:三倍体雌性虹鳟卵巢发育的类雄性化趋势 HANYingetal:Virilescent.hketendencyoftripl.idfemalerainbowtrout(Oncorhynchusmykiss)duringthe processofovariandevelopment 图版I三倍体虹鳟卵巢发育 a)8月龄卵巢,Ooc:卵母细胞,OR:外周环;b)11月龄卵巢,?:坏死的卵母细胞;C)10 月龄卵巢中的卵原细胞簇(?);d)13月 龄卵巢,Fc:滤泡细胞,T:坏死的卵原细胞;e)13月龄卵巢,?:吞噬泡,T:坏死的卵原细 胞;f)13月龄卵巢,Oog:卵原细胞, SC;基质细胞,TJ:紧密连接;g)17月龄卵巢,示类生精细胞囊SLC;h)26月龄卵 巢,BLC:类边界细胞,SeL:类支持细胞;i)35 月龄卵巢,Fb:成纤维细胞,SCL;类生精细胞;j)35月龄卵巢,T:坏死的类生精细 胞;k)26月龄卵巢中管状结构;1)26月龄卵 巢小管腔内结构,A:轴丝 PlateIOvariandevelopmentoftriploidrainbowtrout aJ8-montholdovary,Ooc:oocyte,OR:outerring;b)11-montholdovary, ?:oocyteofnecrosis;C)Oogoniumclustersin10-month oldsamples(?);d)13一montholdovary,Fc:folliculecell,T:oogoniumofnecrosis;e)13一 montholdovary,?:phagocytoticvesicle, T:oogoniumofnecrosis;f)13-montholdovary,Oog:oogonium,SC:stromacell,TJ:tightjun ction;g)17-montholdovary,SLC: spermatogenic— likecytocyst;h)26-montholdovary,SeL:sertoli-likecell,BLC:boundary?likecell;i)35-mo ntholdovary,Fb:fibroblast, SCL:spermatogeniccell—like;j)35-montholdovary,1:spermatogeniccell— hkeofnecrosis;k)Tubule-likestructurein26一montholdovary; 1)Thelumenin26一montholdovary,A:axialfilament