幽门螺杆菌低分子量外膜蛋白的基因克隆、重组载体构建

幽门螺杆菌低分子量外膜蛋白的基因克隆、重组载体构建幽门螺杆菌低分子量外膜蛋白的基因克隆、重组载体构建现代消化及介入诊疗2001年第6卷第3期ModemDigestion&Intervention2001,Vo1.6,No.3—39一幽门螺杆菌低分子量外膜蛋白的基因克隆,重组载体构建姜政黄爱龙王丕龙陶小红浦丹幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是上消化道疾病的主要致病菌,它的感染不但与B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系,而且与非溃疡性消化不良,MALT淋巴瘤和胃癌也有重要关系,并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤的相,关致病菌.Hp在我国普通人群的感染率较为高50%一80%].随着分子生物学技术的发展,幽门螺杆菌致病机理研究的进一步深入,有效抗原的筛选,以及基因工程菌株构建的运用,将预防和根治印的感染成为了可能.因此,本实验以THp特快特异性基因…18kDa外膜蛋白基因,经PCR扩增,构建重组载体,为在原核生物表达创造条件,同时为疫苗的研究以及快速诊断试剂盒的开发奠定基础.材料和方法1.菌株质粒:幽门螺杆菌由重庆医科大学微生物教研室提供;菌株Topl0等为重庆医科大学病毒肝炎研究所保存.2.限制性内切酶及T4KNA连接酶:T4DNA连接酶,限制性内切酶(Hind?,BamHI,BgLI)购自Promega公司,TaqDNA聚合酶为北京医科大学免疫教研室的产品,dNTP为上海生工生物工程公司产品,PE一9600型PCR为PE公司产品.3.Hp基因组DNA提取:将}{p培养物1.5ml离心2分钟,在其沉淀中加入567ui的TE缓冲液,混悬,再加入30ul10%SDS和3ul20mg/ml蛋白酶K,于37c【=温育1小时;加入100u15mol/Nac1.再加入80ul10%SDS,于65~C温育i0分钟;用酚,酚/氯仿各抽提3次;将上清液转入EP管中,加入0.6体积异丙醇,稍微离心,沉淀中加入imi7O%乙醇洗涤;离心5分钟,弃上清,沉淀溶于100ulTE中;一20<保存,备用.4.18kDa外膜蛋白基因扩增:在50ul反应系体中,分别加入IuldNTP,2ulDNA,浓度各为18umol/L的P1,P2引物各lu!以及lulTagDNA聚合酶,按照PCR条件进行扩增,即94oC变性7作者单位:重庆医科大学临床学院分外,然后按如下参数循环35次;94oC变性5O秒,52~C退火45秒,72~C延伸5O秒,最后个循环结束后72c【=延伸7分钟.将PCR产物进行1%琼脂凝胶电泳,同时进行胶回收.5.质粒Pqe30的筛选:提取质粒分别进行BamHI,Hind?,以及BamHI和BgLI酶切,将酶切产物与质粒同时进行1%琼脂糖凝胶电泳(如图1所示).从图中看,质粒被Hind?和BamHI双酶切,在约为3420bp处有一条带(而另一约为42bp的条带则看不见),与被Hind?或BamHI单酶切所形成的条带(3642bp处)几乎一致,而被Bam_HI和BgLI双酶切为两条过,分别在约为2445bp处和1017bp处.因此,可以判断质粒就是Pqe30质粒.6.重组载体构建:1目地基因与载体的连接将纯化的PCR产物,鉴定的质粒pQE30分别进行Hind?,BamHI双酶切,用PCR纯化试剂盒进行纯化;将酶纯化的目的基因,质粒PQE30按4:1(摩尔数)进行连接,反应体系30ul,加入目的基因60rig,质粒pQE30100ng,T4DNA连接酶3ul,在4?条件下过夜.2感受体Topl0菌制备取50uiToplO菌过夜,弃上清;加入150ul1OOmmol/!cacl2浊悬,在0?冰水浴2小时;而后加入连接产物10ul,混悬,再在0.?冰水浴3O分钟;在42?水浴2分钟后,冰水浴2分钟后,冰水浴2分钟;加入ImlLB培养液,37?孵育3O分钟;取种在2mlLB+氨苄青霉素100ug/ml平皿,37?过夜.3重组载体提取挑选单菌落,接种在2mlLB氨苄青霉素100ug/ml培养液里,37?摇菌250rpm,12小时,然后提取重组载体(按照华舜生物工程有限公司DNA提取纯化操作手册操作).结果1.幽门螺杆菌18kDa外膜蛋白基因;根据文献报道.5’E],经微机分析设计18kDa外膜蛋白基因引物:P151一CCGGATCCATGAAAAATCAAGTTAAAAA一31,引物P1引入了BamHI酶切位点,P251—..—.40...—.现代消化及介入诊疗2001年第6卷第3期ModemDigestion&Intervention2001.v01.6.No.3CCAAGCTTCTACTTTTTAACCATGCCCA一31,引物P2引入了Hindm酶切位点,以Hp基因组为模板进行PCR扩增,得到目的基因片段,经1%琼脂糖凝胶电泳,2.PCR筛选重组载体:挑选两个含重组质粒的TOP10单菌落进行培养,分别取50ul过夜培养物,煮1O分钟;离心,取上清2ul作为PCR模板;同时提取重组质粒,分别取2ul作为PCR模板;反应体系25ul,按照上述PCR条件进行PCR扩增,扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,如图3所示.用细菌或从细菌中提取的质粒作为模板都能扩增出一条位于4500bp附近的片段,说明质粒中含有目的基因片段.讨论自从1982年Marshall和Warren从慢性活动性胃炎患者的胃粘膜中分离出幽门螺杆菌以来,Hp与上消化道疾病之间的关系受到广泛关注,现已确认Hp是慢性胃炎的主要致病因子,且与消化性溃疡的发病有密1)]关系,根除Hp之后,可以显着降低或防止溃疡复发,同时可以使Y_ALT淋巴瘤明显缩小或消退引.因此,如何及时,准确对感染的检测,诊断;如何进行有效预防Hp的目前研究的重点.以往检测Hp的方法存在许多不足:快速尿酶检查的结果依赖于细菌的量和产酶的能力;体外培养受其培养条件和细菌活力的影响;组织学检查受其取材以及检查者的制约;呼吸度验受多种外界环境的干扰;而血清学的检查因受多样化抗原影响,其特异性和敏感性各家报道参差不齐,但是由于血清学检查性属于非创伤性检测,同时可检测大量标本,以及不同的抗体,因此受到了临床青睐.据初步研究,18kDa外膜蛋白具有特殊的功能结构,不但作为Hp检测的一种标志性抗原,而且具有免疫源性.据文献报道HD的低分子量外膜蛋白对胃癌以及胃癌高发人群的筛选具有重要价值,特别是18kDa,26.5kDa外膜蛋白基因进行克隆,构建重组质粒,与文献报道相比.18kDa外膜蛋白基因有2%(11/528)编码碱基发生变异,约1.68%(3/178)氨基酸残基不同,研究其原因可能有(1)所采用菌种不同;(2)HD具有转化能力,它能够通过死亡的印DNA的转化可以导致基因组的重排,从而导致了基因的变异.(3)}!p的菌株间的变异引起,不同的患者感染的Hp具有其特殊的限制性片段多态性(RFLP)谱型,尤其是不同地区差别更加明显,通常有好几个片段的差异,但其高度同源性又决定了不同的菌株间编码蛋白的主要抗原决定簇的一致性;另外,从理论上讲以质粒Pqe30构建的重组载体的蛋白表达,只有目的蛋白而没有载体蛋白,这就为重组质粒表达高免疫源性的蛋白提供了保障.而且Pqe30载体属于PDS质粒家簇,带有大肠杆菌T;启动子和转录终止信号,能够编码六个组氨酸残基,外源基因经多克隆位点插入后,表达的蛋白带有一个六聚组氨酸接头,六聚组氨酸接头对表达的蛋白的活性和结构影响非常小,但是对表达的蛋白纯化具有重要的作用,由于组氨酸的咪唑环能够与金属Ni形成?合物,因此利用Ni—NTA树脂就可以方便地将外源蛋白人细菌蛋白中分离出来.为以后制作ELISA快速诊断试剂盒以及制备安全的,高效的疫苗奠定了基础.关于重组质粒的表达正在研究之中.参考文献[1】HockingD,WebbE,RadcliffF,et.a1.IsolationofrecombinantproteciveHelicobacterPyloriantiges,InfecionandImmunity,1999;67(9):4713-4719.【2】Blasermj,Perez—Perez,Kleanthoustt,eta1.Infection,vi出HelicobacterpyloristrainpossessingCagAinassociatedwithanincreasedriskofdevelopingadenocarciomaof出estomach.CancerRes.1995;55:2111—2115.【31Internationalagencyforrasearchoncancer.Schistosomes.fiverflukesandHelicobacterPylori.LARCmonogrphsonthevealutiononcarcinogenicriskstohuman.Vo161,Lyon:IASC,1994.[4]PounderRE,NgD.TheprevalenceofHelicobacterPyloriinfectionindifferentcountries.AlimentPharmacolther,1995;9(supp12):33?39.【5】TombJF,WhiteO,kerlavageAR,eta1.ThecompletegenomesequenceofthegastricpatheogeHelicobacterPylori.Nature,1997;388(7)739—747.【6】KeenanJ,OliaroJ,DomiganN,eta1.Lmmuneresponsetoan18-kilodaltonoutermembraneantigenidentifiesLipoprotie20asaHelicobacterPylorivaccinecandidate.InfectionandLmmunity,2OOO;68(6):3337—3343.【7】MorgnerA,LehnN,Andersoneta1.HelicobacterPylori-?associatedprimarygastriclow??gradeMALTlymphoma:Completeremissionaftercuringtheinfection.Gas廿oenterologyI200;118(5):821—8.【8】KonturekPC,KonturekSJ,Starlyskaeta1.现代消化及介入诊疗2001年第6卷第3期Modem—Digestion&Interve—ntion2001,Vo1.6,No.3—4l—HelicobacterPylori—gastriclinkinMALTlymphoma.AlimentPharmacolTher,2000;14(1O):1311—8.【9】ShieshSC,SheuBS,YangHB,eta1.Setologicresponsetolowermolecular—weightproteinsofHelicobacterPyloriisrelatedtoclinicaloutcomeofHelicobacterPvloriinfectioninTaiwan.DigDisSci,2000;45(4)78l一788.【lO】钟平,吴昆祥,徐帆等-中国幽门螺杆菌CavA克隆和基因序列分折.世界华人消化杂志,1999;7(8):669.672.幽门螺杆菌感染诱导胃粘膜环氧化酶-2表达孙为豪俞谦区希龙郭庆明俞婷毛翠华钱铖1983年发现幽门螺杆菌(Hp)以来,有关Hp在慢性活动性胃炎,慢性萎缩性胃炎和消化性溃疡发病中的作用已引起国内外学者的高度重视,并且认为,}ip是胃腺癌发生的一种I类(肯定)致癌物.流行病学资料提示,p感染人群胃癌发生危险性显着高于对照人群.动物实验证实,Hp慢性感染易引起胃粘膜组织恶性转化..:,但其致癌机制尚不清楚.环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是合成前列腺素的限速酶,已知COX至少有两种亚型,即COX一1和COX一2在胃肠道肿瘤及相应的肿瘤细胞株中普遍高表达[6】.然而,感染对胃粘膜COX一2表达的影响,国内尚无报导.本研究通过检测COX一2在Hp阳必和Hp阴性的胃粘膜中表达状况,旨在探讨Hp感染在胃癌发生中的作用机制.材料与方法一,临床资料无任何症状健康检查者27例,男17例,女1o例,年龄26,82岁,平均50.8岁.常规检格检查和实验室检查结果,无呼吸,心血管,泌尿生死或消化系统异常,胃镜检查结果无肉眼可见的病变如消化性溃疡或胃肿瘤,在获得受检者许可后,胃镜下采取胃窦部粘膜组织,用于Hp检测和病理组织检查.病理检查结果示肠上皮化生者未列入本研究.二,Hp检查及组织学检查在胃窦部取3块活检组织,1块怍快速尿素酶试验(CLOtest,日本国际试药),1块作培养,作者单位:210009东南大学附属中大医院消化内科1块用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片,部分切片作Giemas染色检查Hp,部分切片常规HE染色作病理组织学检查.三项蔓p检查中任何一项阳必者诊断为Hp了性,而所有检查均为阴性时,判断为p阴性.三,免疫组织化学检查采用免疫组织化学ABC法染色.石蜡包埋的组织行层厚为4m的连继切片,常规脱蜡至水,微波加热(95cci0分钟)激活抗原,0.3%过氧化氢甲醇溶液室温下20分钟阻断内源酶.一抗为山羊抗人COX一2多克隆抗体(SantaCrux,美国),工作浓度为1:200,4cc过夜孵育.具体实验步骤按ABC试剂盒和DAB试剂盒(Vecstatinkit;VectorLaboratories,美国)所述进行.已知的COX一2表达阳性胃癌组织切片为阳性对照,以PBS替代一抗作阴性对照,细胞核用苏木素复染1分钟.四,统计方法以Fisher精确法检验(单侧检验)判断COX一2表达与Hp感染之间关系,以P<0.05为具有统计学意义.结果27例中Hp阳性者I8例,男性II例,女性7例,年龄26—82岁,平均年龄50.0岁.Hp阴性者9例,男性6例,女性3例,年龄39—82岁,平均52.4岁.所有Hp阳性的胃粘膜均可检测到COX.2表达,而所有Hp阴性者胃粘膜无COX.2二者差异有显着性(P<O.0O1;表1).图1显示COX一2在胃粘膜的表达状况,Hp阳性者COX一2主要表达于胃凹上皮细胞;此外,