人类肛门直肠正常胚胎发育及CDX1TCF4与先天性肛门直肠畸形发生关系的研究

人类肛门直肠正常胚胎发育及CDX1TCF4与先天性肛门直肠畸形发生关系的研究 人类肛门直肠正常胚胎发育及CDX1TCF4与先天性肛门 直肠畸形发生关系的研究 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果,也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 日期:垒生堡盘 论文作者签名:毯童 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学,且导师为通讯作者,通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密 内容除外,以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名: 指导教师签名: 日 期:目 录 一、摘要 中文论著摘要英文论著摘要二、英文缩略语三、论文 论文一 前言翮岙?”??“” 材料和方法实验结果 讨论? 结论论文二 前言刖看”“?“?”‘ 材料和方法实验结果 讨论? 结论? 论文三 前言丑吾??”““?“?”” 材料和方法实验结果 讨论”结论? 四、本研究创新性的自我评价五、参考文献 六、附录 综苤??在学期间科研成绩致谢个人简介 /删删『『『『『『脚?中文论著摘要? 人类肛门直肠正常胚胎发育及/与先天性 肛门直肠畸形发生关系的研究 刖 罱 ,删是科最常见的先 先天性肛门直肠畸形 天性消化道畸形,其发病率约为一/。由于是复杂的多基因疾病, 由环境因素和遗传因素共同作用所致,迄今为止,的发病机制仍不清楚。近 年来,虽然的诊疗水平有一定提高,但仍有近%的患儿术后出现不同程度 的并发症:排便、排尿及性功能障碍,严重影响患者生活质量,给患儿、家庭和 社会带来沉重的负担。因此,阐明的发病机制对于探索新的治疗方法、采取 有效预防具有极其重要的意义。 尽管近年来国内外学者应用人类胚胎和致畸的动物模型标本对肛门直肠正常 和异常的发育过程进行了初步研究,认为肛门直肠畸形的发生是胚胎期直肠发育 发生障碍的结果,但是至今仍没有完全阐明人类正常肛门直肠胚胎发育的演变规 律,对胚胎发病机制更是知之甚少。胚胎期肛门直肠的形态演变和构型改变 依赖于细胞定向分化、增殖及细胞凋亡的协同作用,前人研究显示,在小鼠肛门 直肠的胚胎发育过程中,细胞增殖/凋亡在泄殖腔分离、肛膜及尿生殖膜崩解中发 挥了重要的作用。然而在人类肛门直肠的胚胎发育过程中,细胞增殖/凋亡是否参 与其中,发挥了何种作用尚未得到明确。 揭示的发病机制关键在于明确的基因调控和胚胎发生机制,普遍 认为是一组受多因素影响的,涉及多个基因的复杂畸形。目前国内外对 的实验研究多采用乙烯硫脲、维甲酸等致畸建立动物模型,观察其胚胎发 生的病理改变和基因表达规律及模式。有研究显示,是调控胚胎尾端发育的 重要基因之一,胚胎早期表达于尾端的间质和粘膜,生后主要表达于粘膜,调控 粘膜上皮细胞的分化和增殖。此外,在聊基因敲除小鼠表现出严重的肛门直肠畸形,如:后肠缺如、尾端发育不良等,上述研究提示、在肛门直肠的 胚胎发育过程中起重要作用。然而在胚胎发育过程中,、表达模 式是否存在异常,表达模式的变化是否与的出现存在关联,二者如何调控 消化道末端发育,这些问题均未得到满意的解决。 发病机制和病理改变十分复杂,多伴发其他畸形,其遗传方式和外显率 尚不清楚,涉及的相关基因繁多,至今尚未对相关基因定位。人类基 因候选基因的研究尚处于起步阶段,尤其尚无明确的有义基因突变的报道,因此 从分子水平探索人类的发病机制具有十分重要的意义。 本研究应用至周人胚标本,通过染色后连续动态观察肛门直肠的形 态变化过程并结合及免疫组织化学染色细胞增殖/凋亡的时空 分布规律,揭示肛门直肠的胚胎发育过程,初步探讨的细胞增殖/凋亡在肛门 直肠 胚胎发育中的作用。同时,本研究应用乙烯硫脲,致畸的 大鼠的动物模型,分析及蛋白和在正常及 大鼠胚胎肛门直肠的时空分布规律,探讨及在大鼠胚胎肛门直肠发育 过程中所发挥的作用;研究及聊与胚胎发生机制的关系。此外,我 们采用基因测序的方法筛查基因外显子的突变,应用生物信息学技术分析 突变位点可能引起的功能改变,并结合应用免疫组织化学、定量和蛋白印记 研究在人类的直肠末端的表达,目的在于初步探讨与发 病之间的关系。 材料和方法 一、实验材料 一人类胚胎标本 收集因意外妊娠进行人工流产, 发育正常的人类胚胎标本例每例标本 人胚胎形态发育 均取得产妇本人同意。根据产妇末次月经时间、 特征和超声所测胎儿头臀长、双顶径等确定胎龄为周。 二临床组织标本 收集我院年手术的患儿直肠末端标本例,男例,女 例,平均年龄.个月,其中高位畸形例,低位畸形例。对照组由例 死于非胃肠道疾病患儿的直肠末端标本,男例,女例,平均年龄.个月。 取直肠末端后壁组织,放入经处理后的无菌管中,立即置于液氮中速 冻后置于.?冰箱中保存。 三血样标本 无血缘关系的中国北方汉族健康个体名,其中男名,女名,平均年龄 .岁,经询问病史及体格检查,排除先天性畸形。无血缘关系的中国北方汉族 患者,男例,女例,平均年龄.岁,样本来自年至年中国医 科大学附属盛京医院、科,经手术确诊,均符合诊断。 四实验动物 大鼠体重,由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。 五实验试剂: ?购自德国罗氏公司;窑、、多克隆抗体购自美 垂 公司;?免疫组化超敏试剂盒购自福州迈新生物 技术开发有限公司;二步法山羊免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥公 司; ?乙烯硫脲购自德雪公司;?逆转录 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司;?总蛋白抽提试剂盒购自凯基公司; 聚合酶及其反应缓冲液公司;?实时定量试剂盒购 自公司。 二、实验方法 一人类后肠及肛门直肠胚胎发育的研究 .周胚胎取整个胚胎,周胚胎取其盆部,标本经. 液冲洗后立 即置于%多聚甲醛中固定小时小时,常规脱水,石蜡包埋。石蜡标本进 行矢状面连续切片,厚度,在显微镜下观察未染色切片,在观察到泄殖腔或 直肠膀胱出现时连续保留切片,连续的张切片分别进行、和 的免疫组化染色。 二【爪在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中时空性表达的研究 在成熟健康孕鼠妊娠第天,按/经胃管给予孕鼠 浓度为%,以生理盐水做溶剂,制作大鼠动物模型;对照组给予等量 的生理盐水。分别在大鼠.时剖宫取胎,部分取完整胚胎或胚胎盆部, 经%多聚甲醛固定、脱水后制成蜡块,行矢状面或横断面的连续切片,进行 /的免疫组化染色连续动态对比观察/在正常和畸形大鼠胚胎泄 殖腔及肛门直肠发育过程中的表达。常规制备胎鼠冰冻切片,解剖显微镜下 手工 显微切割方法准确切取泄殖腔标本,从中提取总和总蛋白,通过与 和蛋白在正常以及畸形大鼠胚胎泄殖腔 方法研究、 及肛门直肠的表达。所有数据均以表示,差异比较采用 .统计软件进 行各胎龄正常组与组检验,.表示差异有统计学意义。 三蹦基因与人类关系的研究 采用抗凝外周静脉全血,用苯酚.氯仿法提取全基因组,进 行基因外显子扩增,产物进行测序分析。人类正常及直 肠末端标本进行的免疫组化、 及定量实验,对其表达进 行定位和定量,并比较分析。 结果 一、人类后肠及肛门直肠胚胎发育的研究 第周时,可以在尾端背侧区观察到边界清晰的泄殖腔结构,由泄殖腔 膜将其与羊膜腔分隔。第.周时,随着胚胎尾端向背侧伸展和旋转,尿直肠隔 进一步向泄殖腔内延伸、突出,其尖端与泄殖腔膜距离逐渐缩小,但未观察到尿 直肠隔与背侧泄殖腔膜的融合。泄殖腔膜由垂直位转型呈水平位生长,背侧泄殖 腔膜逐渐变薄。第周时,肛膜破裂,肛门直肠与外界相通,肛门直肠区的上皮 的差异性开始出现,尿直肠隔转向腹侧和头侧生长,其尖端与腹侧泄殖腔膜距离 逐渐缩小,可以观察者之间仍存在潜在的狭窄腔隙。第周时,尿直肠隔进 一步向腹侧生长,尿直肠隔与泄殖腔膜的内胚层上皮发生融合,之前裂隙消失, 生殖结节的间质深入腹侧泄殖腔膜之中,继续延展参与尿道的组成。 第周,凋亡细胞主要位于肛门直肠、尿直肠隔及尿生殖窦的上皮;尤 其是在肛门开口区周围分布着大量凋亡细胞;第周,凋亡细胞大量分布于直肠 末端和直肠背侧间质区;第周,直肠及肛管上皮中可以见到凋亡细胞,而在尿 直肠隔背侧与泄殖腔膜内仅观察到少量的凋亡细胞。 第周,肛门直肠、尿生殖窦及尿直肠隔上可以观察到微弱的增殖细胞; 散在的增殖细胞位于背侧泄殖腔膜;第周,尿直肠隔间质中可见增殖细胞出 现, 这些细胞大部分位于肛门直肠和尿直肠隔腹侧的间质内;第周,增殖细胞主 要 分布于尿道和肛门直肠的上皮中,同时在尿直肠隔与腹侧泄殖腔膜的和融合 区域 内有大量增殖细胞聚集。 二、爪肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中时空性表达的研究 /在大鼠发育过程中正常胚胎泄殖腔中表达,在天和天主要表 达于尿直肠隔和泄殖腔膜,胚胎天时在尿直肠隔与泄殖腔膜融合处/ 表达较强,天时肛膜破裂,肛门直肠与外界相通,/在直肠粘膜层表 达。/在胎鼠泄殖腔和直肠粘膜层表达较弱或呈现阴性表达。 和半定量检测结果:在发育期的后肠中/和刀拚 的表达表现出时间依赖性的特点:在肛门形成的关键时期/的表达水平 达到高峰,一旦肛门形成其表达量随即开始降低,畸形组与正常组相比较, 蛋白蛋白半定量分析结果... ...天, .. ....天,.. ....天;蛋白半定量分析结果.士. ...天,... ....天, ... ..天。刀拚的表达在一明显降低, 半定量分析结果.士. ...天,... ... 半定量分析结果.士. 天; ..天,.. ....天,.士. .. 天,有统计学差异.。 三、基因及其表达产物与人类剐?关系的研究 一通过对例个体进行删基因外显子测序,在编码区共发 现个个体携带种不同的突变位点.%,/,包括例直肠会阴瘘, 例直肠前庭瘘,例直肠尿道瘘,例肛门狭窄。上述突变位点的高度保 守的同源结构域中,例发生于第外显子的结合区.,: .,;例位于特异性结合区.,;另外一个 位于第外显子. ,.。 二在应用免疫荧光化学法检测/的表达研究中,畸形组患儿与 对照组直肠末端组织粘膜层、表达较强,而在畸形组中、 表达明显减弱。 三末端肠壁 相对表达量,高位组..和低位 组.士.均明显低于正常对照组.士..。不同畸 形之间,高位组和低位组之间差异存在统计学意义.。 四蛋白印迹结果显示,高位组.士.低位组 ..蛋白表达水平均明显低于正常对照组.士..。 不同畸形之间,高位组明显低于低位组.。 结论 、在人类胚胎发育过程中,尿直肠隔与背侧泄殖腔膜并未发生融合,背侧泄 殖腔膜和背侧泄殖腔在肛门直肠发育过程中发挥了重要作用;肛门开口后, 尿直 肠隔继续向头腹侧移位,与腹侧泄殖腔膜融合,腹侧泄殖腔膜在泌尿生殖道 和会 阴的胚胎发育中具有重要的意义。 、细胞凋亡促进了肛门的崩解,使得肛门直肠与羊膜腔相通,在人类肛门直 肠的胚胎发育过程中有重要的意义;胎龄第.周尿直肠隔,腹侧泄殖腔膜发生 的细胞增殖和凋亡促进了尿直肠隔的头腹侧移位,在尿直肠隔与腹侧泄殖腔 膜融 合过程中发挥了重要的作用。 、大鼠胚胎肛门直肠的发育过程中,/可能发挥了重要的作用。 、致畸的大鼠胚胎肛门直肠发育过程中/的表达存在着时 间.空间不均衡性的特点。致畸的大鼠胚胎期泄殖腔/后肠瓜表达模式 的改变可能引起的发生,/表达下调可能与的发生有关。 、患者中存在删外显子的突变,表达产物在肛门直肠畸形直 肠末端表达下调,蹦,可能是的易感基因,在人类的发生中可能 具有重要作用。 关键词 肛门;直肠;畸形;;人类;大鼠;,陀?;细胞凋亡;细胞增 殖;胚胎发育:泄殖腔;基因突变 ?英文论著摘要/ .. . ,谢 ,. , . , ./, ./ , / ? .. , , . :, , 回, ., .,,弱, . , . . . , ,., . ., , ..,. : . , 斗 ,., ,嬲嬲 也. .. . ..,/, // . / . / ,. ,. ,. , .,, . . .,, 龇. . , .. . ./ . . . .. . .., . . . . .. . ,, ..。 。 ;要 .,;.? .,;., ? . ? . . . ., .. ? . . . . ,、, , ,谢 ,. , . . , ,. , /“ . ., ,删, ,;. , , . , ; ,. , . ;, ..? :. . . , , . , .? , ., , : . , ; ,. . 蝴.., ,. ,. .? , . . 删.士. ..士.,.士. ..士.,. ..士.,.士. ..士.,. ,.. ,. . 谢 , . . .../ . /.,.. . .., . ;;;;;;;; . ;;; ?英文缩略语论文一? 人类后肠及肛门直肠胚胎发育的研究 刖 吾 ,是常见的消化道畸 先天性肛门直肠畸形 形,发生的病理机制十分复杂,多年来,许多学者对动物和人类胚胎肛 门直肠正常以及异常的发育过程进行了研究,目前仍没有完全阐明正常肛门 直肠 胚胎发育的演变规律,对具体的胚胎发生机制更是知之甚少【】。经典的肛门 直肠胚胎发育理论认为,在胚胎第周,尿直肠隔将泄殖腔分为背腹侧两部分, 腹 侧为尿生殖窦,背侧为后肠。随着胚胎发育,尿直肠隔不断下降并与泄殖腔膜 融 合,同时泄殖腔膜也被分为腹侧的尿生殖膜,背侧的肛膜。第周时,肛膜破裂, 形成肛门。然而,随着研究的进展,很多学者对此提出了质疑【.刀。 胚胎期肛门直肠的形态演变和构型改变依赖于细胞定向分化、增殖及细胞凋 亡的协同作用。前人研究显示,在小鼠肛门直肠的胚胎发育过程中,细胞增殖/凋 亡在泄殖腔分离、肛膜及尿生殖膜崩解中发挥了重要的作用【。而细胞增殖/凋亡 是否也参与了人类肛门直肠的发育,至今未见相关的研究报道。有鉴于此,本研 究应用至周人胚标本,经过染色后连续动态观察由泄殖腔向肛门直肠的形 态变化过程,结合免疫组织化学及技术染色分析细胞增殖/凋亡的时 空分布规律,初步探讨细胞增殖/凋亡在肛门直肠胚胎发育中的作用。旨在更深入 地认识肛门直肠胚胎发育过程,为进一步阐明的发生提供实验依据。 材料和方法 一、标本和试剂 一标本来源 本研究遵守赫尔辛基宣言,并得到中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批 准.。收集因意外妊娠而进行人工流产,发育正常的人胚胎标 本例每例标本均取得产妇本人同意。根据产妇末次月经时间、 人胚胎形态发育特征和超声所测胎儿头臀长、双顶径等确定胎龄为周表。 标本经%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定.时,常规脱水制成蜡块,行矢状 面连续切片。 表, 不同胎龄的标本分布 二实验试剂及仪器 、主要仪器 石蜡切片机:德国产. 医用微波炉:中国产 光学显微镜:日本产.. 光学显微镜: 型,日本 、主要试剂 购自德国罗氏公司 多克隆抗体购自美国 公司 超敏试剂盒,多聚赖氨酸、显色剂等购自福州 迈新生物技术开发有限公司。 二、实验方法 、标本制备 液冲洗后立 .周胚胎取整个胚胎,周胚胎取其盆部,标本经. 即置于%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定.小时,常规脱水,石蜡包埋。 、石蜡切片 石蜡标本进行矢状面连续切片,厚度,在显微镜下观察未染色切片,在 观察到泄殖腔或直肠膀胱出现时连续保留切片,连续的张切片分别进行、 和的免疫组化染色,免疫组化实验采用法。 、染色: 按常规染色方式进行。 、法免疫组化染色操作步骤 石蜡切片逐步脱蜡至水,.,.冲洗次,每次分钟。 分钟; 抗原修复,以..枸橼酸缓冲液微波热修复 自然冷却至室温;冲洗次,每次分钟。 除去液,每张切片加过氧化物酶阻断溶液,室温下孵育 分钟;冲洗次,每次分钟。 除去液,每张切片加正常非免疫动物血清山羊血清,室温 下孵育分钟。 除去血清,每张切片滴加 抗体:稀释,阴性对照标本 ,。 小时。 滴加. 冲洗次,每次分钟;除去液,每张切片加生物素标 记的第二抗体,室温下孵育分钟。冲洗次,每次分钟。 除去液,每张切片加链霉菌抗生物素.过氧化物酶溶液,室温 下孵育分钟;冲洗次,每次分钟。 除去液,每张切片滴加新鲜配制的溶液,显微镜下显色。 自来水终止显色,苏木素复染秒钟,自来水冲洗返蓝分钟,梯度 酒精脱水,二甲苯透明,中型树胶封片。 成像系统拍照。 、法标记凋亡细胞操作步骤 待染石蜡切片?烤箱烤小时,二甲苯脱蜡,梯度酒精复水, 冲洗次,每次分钟。 /蛋白酶,。孵育分钟;冲洗次,每次分钟。 %室温处理切片分钟,冲洗次,每次分钟。 滴加反应混合溶液酶浓缩溶液:标记溶液:置样品于湿 盒中,过夜,冲洗次,每次分钟。 擦干样品周围的液体,加入转化剂一,在湿盒中。孵育, 冲洗次,每次分钟。 除去液,每张切片滴加新鲜配制的溶液,显微镜下显色。 自来水终止显色,苏木素复染秒钟,自来水冲洗返蓝分钟,梯度 酒精脱水,二甲苯透明,中型树胶封片。 成像系统拍照。 、图像处理 采用. 多媒体彩色病理图像分析系统连续对比观 察不同胎龄人胚的泄殖腔、尿直肠隔、直肠、膀胱和尿道发育情况及其相互 间的 关系。对、的表达进行定位观察分析,每张切片分别观察倍, 倍及倍视野图像,来判定阳性细胞的分布区域及大体变化趋势。 结果 一、不同胎龄后肠/肛门直肠的形态学特点 根据形态学特点,我们将后肠/肛门直肠的的发育分为三个阶段:泄殖腔发 育期胚胎.周;尿生殖窦与肛门直肠发育期胚胎周;肛门及会 阴形成期胚胎周及以后,其发育特点按胎龄阐述如下表: 第周时泄殖腔发育特征:可以在尾端背侧区观察到边界清晰的泄殖腔结构, 由泄殖腔膜将其与羊膜腔分隔;于背侧可以观察到略向腔内突出的型结构即 早期 的尿直肠隔图,;在第周末,随着尾部伸展,尿直肠隔呈现型,并将 泄殖腔分为腹侧的尿生殖窦和背侧区的后肠两部分,此时可以观察到泄殖腔 膜腹 侧部分明显厚于背侧部分图,。 第周时,随着胚胎尾端向背侧伸展,尿直肠隔进一步向泄殖腔内延伸、突出, 形状近似型,随之,尿直肠隔进一步向泄殖腔膜延伸。泄殖腔膜呈垂直位,由 数层内胚层上皮组成图,。 第周时,尿直肠隔继续向下延伸,其尖端与泄殖腔膜距离逐渐缩小,直肠与 尿生殖窦间共同相通的泄殖腔管变得越来越狭小,但未观察到尿直肠隔与泄 殖腔 膜的融合。同时,可见背侧泄殖腔膜逐渐变薄图。 图,第周初时,正常的人类胚胎泄殖腔形态发育特征;,泄殖腔;, 。 尿直肠隔;,泄殖腔膜;图 图 图,第周末时,正常的人类胚胎泄殖腔形态发育特征;,泄殖腔;, 。 图 ;图 尿直肠隔;,泄殖腔膜;,直肠; 第周时,尿直肠隔继续向下生长,尿直肠隔与背侧泄殖腔膜越来越近,此期 背侧泄殖腔膜呈水平位,进一步变薄仅由几层鳞状上皮细胞组成,在此过程 中, 仍未观察到尿直肠隔与泄殖腔膜发生融合图,。 第周时,肛膜已经破裂,肛门直肠与外界相通图,肛门直肠区的上 皮的差异性开始出现,直肠粘膜主要由不规则的复层柱状上皮组成。肛管粘 膜主 要由复层鳞状上皮组成,平滑肌层已经可以清晰分辨。平滑肌增厚并终止于 齿状 线水平图。尿直肠隔转向腹侧和头侧生长,其尖端与腹侧泄殖腔膜距离逐 渐缩小,可以观察者之间仍存在潜在的狭窄腔隙图。 , 图,第周时,正常的人类胚胎泄殖腔形态发育特征;,泄殖腔; 尿直肠隔;,泄殖腔膜;,直肠;,尿生殖窦; 图 ;图 。 图,第周时, 正常的人类胚胎肛门直肠形态发育特征。, 尿直肠隔; ,泄殖腔膜;, 直肠;,尿生殖窦; 图 ;图 。 表,后肠/肛门直肠的的发育胚胎发育特点 第周时,尿直肠隔进一步向腹侧生长图,尿直肠隔与泄殖腔膜的内 胚层上皮发生融合,之前的腔隙消失其间质成分也相互融合图,生殖结节 的间质深入腹侧泄殖腔膜之中,继续延展发育形成尿道。而尿直肠隔与腹侧 泄殖 腔膜融合的区域将发育成为会阴图。直肠与肛管的粘膜上皮有显著的增生。 直肠背侧部分的深部结构也开始发育,可以观察到内括约肌形态。已经可以 清晰 的分辨出齿状线。柱状上皮与鳞状上皮的分界已经分界清楚图。 图,第周时,正常的人类胚胎肛门直肠形态发育特征;,泄殖腔;, 。 图 ;图 尿直肠隔;,泄殖腔膜;,直肠;,尿道; 图,第周时,正常的人类胚胎肛门直肠形态发育特征;,尿直肠隔; 。 ;图, ,腹侧泄殖腔膜;,直肠;,尿道;,耻骨;图图,第周时,正常的人类胚胎肛门直 肠形态发育特征;, 尿直肠隔; ,腹侧泄殖腔膜;,直肠; ,尿道;,耻骨; 主图,嵌图。 二、人类肛门直肠胚胎发育中细胞增殖/凋亡的时空分布特点 第周,凋亡细胞主要位于肛门直肠、尿直肠隔及尿生殖窦的上皮;尤其是 在肛门开口区周围分布着大量凋亡细胞图;第周,凋亡细胞大量分布于 直肠末端和直肠背侧间质区图;第周,直肠及肛管上皮中可以见到凋亡 细胞,而在尿直肠隔背侧与泄殖腔膜内仅观察到少量的凋亡细胞图。 第周,肛门直肠、尿生殖窦及尿直肠隔上可以观察到微弱的增殖细胞;散 在的增殖细胞位于背侧泄殖腔膜图;第周,尿直肠隔间质中可见增殖细 胞出现,这些细胞大部分位于肛门直肠和尿直肠隔腹侧的间质内图;第 周,增殖细胞主要分布于尿道和肛门直肠的上皮中,同时在尿直肠隔与腹侧 泄殖 腔膜的融合区域内有大量增殖细胞的聚集图。图,胚胎?周时,凋亡细胞在肛 门直肠区的时空分布特点:,第周;, , 第周;,第周。, 尿直肠隔;,腹侧泄殖腔膜;,直肠; 尿道主图×嵌图,染色。 图,胚胎.周时,增殖细胞在肛门直肠区的时空分布特点:,第周;, , 尿直肠隔;,腹侧泄殖腔膜;,直肠; 第周;,第周。, 尿道主图×嵌图,免疫组化染色。 讨 论 是小儿外科常见的先天性消化道畸形,其发生率/./,是世界 卫生组织常规监测的先天畸形之一。其病理类型极其复杂,从单纯的肛门闭 锁到 严重的泄殖腔畸形等,给患者带来极大的痛苦,引起各国研究者的高度重视。 为更好的理解的胚胎学发生机制,首先要明确肛门直肠的正常胚胎发育 过程。传统理论为】,在人类胚胎第周末,后肠末端膨大与前面的尿囊相交通, 形成泄殖腔。泄殖腔的尾端被外胚层的一层上皮细胞所封闭,称为泄殖腔膜, 与羊膜腔相隔。第周泄殖腔与后肠间的中胚层皱璧形成,并向尾侧生长,同时泄殖 腔两侧壁的内侧间质增生形成皱璧,向腔内生长,这些构成尿直肠隔。尿直肠隔 将泄殖腔分为腹侧的尿生殖窦和背侧的原始直肠。二者间以泄殖腔管相通。随着 胚胎发育,尿直肠隔不断下降与泄殖腔膜的距离越来越小,逐渐与泄殖腔膜融合, 同时泄殖腔膜也被分为前后两部分,前者为尿生殖膜,后者为肛膜。从第周开始, 外胚层向肛膜的外表面发展,形成肛凹,肛凹逐渐加深接近肠管,第周时,肛膜 破裂,使起源于外胚层的肛凹与起源于内胚层的直肠相通,肛门形成。虽然对肛 门直肠胚胎发育过程新学说不断产生,如局部信号分子机制【、毗邻结构的信号 诱导四、神经支配理论【】等;多生物学因素的引入为探讨肛门直肠的正常胚胎发 育提供了新思路,但目前仍有许多争议。在本研究中,我们通过连续动态观察肛 门直肠的发育过程,提出了一些新观点,如尿直肠隔与泄殖腔膜的关系;背侧及 腹侧泄殖腔膜分别与肛门直肠和尿生殖窦及会阴发育的关系;细胞凋亡/增 殖在肛 门直肠发育中的时空分布特点等。 尿直肠隔与泄殖腔膜在泄殖腔向肛门直肠发育过程起到了重要的作用,而尿 通过对猪和 直肠隔是否与泄殖腔膜融合是目前争论的焦点之一【。 人的胚胎形态学研究发现【】:泄殖腔分隔过程中,泄殖腔背侧连同其间质成份向 尾沟移动,上皮细胞和泄殖腔膜向腹侧延伸的同时,背侧泄殖腔膜逐渐变薄破裂, 形成肛门直肠对外界的开口。 认为泄殖腔正常发生过程中产生了尿直肠隔 这一结构,但未观察到尿直肠隔与泄殖腔膜的融合,并且强调在此过程中泄殖腔 构型变化的重要性【】。认为尿直肠隔与泄殖腔膜的距离的进行性减小是泄 殖腔构型变化的结果,伴随着胚胎的生长,伸展,旋转,尿直肠隔和泄殖腔膜距 离不断减小,未观察到尿直肠隔和泄殖腔膜的融合】。在本研究中,我们注意到 肛门直肠的生长发育与其毗邻组织的形态、空间位置之间存在着密切的联系。本 研究显示胚胎.周,尿生殖窦周围的间质与肛门直肠区间质的不对称性发育,泄 殖腔发生位置和构象的重大改变;同时使得尿直肠隔在发育过程中不断接近 泄殖 腔膜,其间隙变得越来越狭小图.。而在胚胎?周时,随着背侧泄殖腔 向尾沟的不断接近,泄殖腔逐渐缩小图.;背侧泄殖腔膜在第周时崩解, 直肠自此与羊膜腔相通,这清楚的表明在人类胚胎肛门直肠发育过程中并未发现 尿直肠隔与背侧泄殖腔膜的融合图。同时我们还发现,泄殖腔膜腹侧部分 较之背侧部分明显为厚,此结果提示在泄殖腔膜的整个胚胎发育过程中存在着不 均衡性的特点。由此我们推测,人胚泄殖腔的发育严格遵循着时空动态变化的规 律:在早期胚胎发育中,背侧泄殖腔膜对于正常肛门直肠的发育发生发挥着极其 重要的作用。 此外,在本研究中,还有一个现象值得密切关注:在背侧泄殖腔膜崩解后, 尿直肠隔进一步向头侧及腹侧移位,向生殖结节延展,与腹侧泄殖腔膜融合,直 接参与了尿道近.远轴的建立,其间质参与了会阴体的形成图。值得注意 的是,到目前为止,尽管在泌尿生殖道研究领域有研究指出腹侧泄殖腔膜参与了 尿道的构成,但是均未明确的指出腹侧泄殖腔膜与尿直肠隔的融合这一重要现象 ,使得人们忽视了腹侧泄殖腔膜在参与泌尿生殖道构成中所发挥的作用。这 一发现提示腹侧泄殖腔膜在泌尿生殖道和会阴的胚胎发育中具有重要的意义,特 别是在保持尿道完整性方面发挥了不可忽视的作用。本研究观察到的现象对早期 泄殖腔发育中存在长久争议的事件提供了重要的形态学证据,进一步说明腹侧和 背侧泄殖腔膜分别在正常的泌尿生殖系统和直肠发育中发挥了至关重要的作用。 图,人胚肛门直肠发育模式图:.,分别表示胚胎?周泄殖腔向肛门直 肠发育过程;绿色区域,早期泄殖腔膜;黄色区域,腹侧泄殖腔膜;紫色区域, 背侧泄殖腔膜;红色箭头:尿直肠隔移位方向。肛门直肠形成过程众多生物学事件参与其中,如细胞分化,增殖,凋亡,转 化和粘附【二,。在本研究中,我们首先探讨肛门直肠发育中细胞凋亡所发挥的 作用。在第周时,凋亡细胞主要分布于尿直肠隔背侧间质和背侧泄殖腔膜,尿直 肠隔间质内及泄殖腔膜的凋亡细胞背侧部分比腹侧部分明显,而此时正是尿直肠 隔头腹侧旋转的关键时期,故推测尿直肠隔背腹侧不均衡的细胞凋亡是导致尿直 肠隔的头腹侧旋转潜在机制之一。而尿直肠隔的头腹侧旋转是泄殖腔构型变化重 要的一部分,是保证肛门直肠向尾沟下降的关键因素之一。在实验中,我们同样 观察到第周时图,在肛门开口区周围分布着大量凋亡细胞,使得肛膜裂 解,直肠与外界相通是凋亡作用的结果,基本与前人的研究一致【.。第周时, 凋亡细胞大量分布于直肠末端和直肠背侧间质区,进一步证实在肛门直肠形成过 程中凋亡的重要作用图 。从第周,少量的凋亡细胞分布于尿直肠隔背侧 。总之, 间质,这可能与后期的尿直肠隔向头腹侧进一步旋转密切相关图 细胞凋亡在肛门直肠的发育过程中发挥了主导作用,背侧泄殖腔膜的凋亡与背侧 泄殖腔向肛门直肠发育存在密切的关系。 细胞增殖与凋亡相辅相成共同调控胚胎形态发生。与和 甾研究相比较,在本研究中,可以观察到胚胎.周,尿直肠隔腹侧增殖较 背侧显著,促进了尿直肠隔向头腹侧的旋转,泄殖腔膜也因此出现空间位置上从 垂直位到水平位的转化,引起了背侧泄殖腔向尾沟的进一步接近图,。 到胚胎第周,增殖细胞集中出现于尿直肠隔腹侧加快了其向头腹侧的旋转,促进 了与腹侧泄殖腔膜的融合图。所以我们认为:细胞增殖不但在肛门直肠发 育中发挥了重大作用,而且对泌尿生殖道和会阴的胚胎发育也有重要的影响。我 们推测,凋亡和增殖双重作用参与了尾端器官的胚胎发生,也表明细胞凋亡和增 殖异位分布可能会干扰正常肛门直肠和泌尿生殖道的发育。目前认为,在肛门直 肠形成的关键时期众多生物分子参与了细胞凋亡和增殖的调控,如【略。、 信号通路渊、、出【以及碹‖【】等均在胚胎发育时表达于背侧泄殖 腔膜上。在调控信号异常表达的情况下,背侧泄殖腔膜在特定时间内的细胞增殖、 转化和细胞凋亡发生紊乱,导致背侧泄殖腔膜发育不良,背侧泄殖腔向尾沟的迁 移发生障碍,从而引发。 图,人胚肛门直肠发育凋细胞亡/增殖分布模式图:.,分别表示胚胎. 周肛门直肠凋亡细胞和增殖细胞分布趋势;黄色区域,腹侧泄殖腔膜;紫色区域, 背侧泄殖腔膜;箭头:尿直肠隔移位方向。绿点:凋亡细胞;红点:增殖细胞。 结合人类肛门直肠胚胎发育、动物模型及临床的类型,我们综合分 析后提出,胚胎不同阶段、泄殖腔及其毗邻结构的发育障碍/异常与的严重程 度和临床类型存在一定联系。肛门直肠畸形的胚胎发生和其他畸形的发生一样, 可能与妊娠期,特别是妊娠早期~周受到某些致畸因素如病毒感染、化学物 质、环境及营养等作用有关。胚胎期发生障碍的时间越早,所致畸形的位置越高、 越复杂。若孕期干扰因素出现在胚胎发育早期,可能会出现泄殖腔畸形、尾端发 育不良等严重畸形;在胚胎.周时,背侧泄殖腔膜发出异常的调控信号则可能使 背侧泄殖腔向腹侧移位,将引起各型泌尿生殖道瘘,同时盆底肌发育缺陷也继发 出现;若干扰因素出现在周左右,则引发的畸形会相对较轻肛门狭窄、肛门闭 锁等。干扰因素出现于周以后可能使得会阴及泌尿生殖道发育障碍,若尿直肠 隔与腹侧泄殖腔膜不能融合则可引起 畸形;腹侧泄殖腔膜向尿道的延伸异常可能引起尿道下裂等畸形。由此 我们认为,人胚泄殖腔发育严格遵循着时空动态变化的规律:在早期胚胎发育中, 背侧泄殖腔膜对于正常肛门直肠的发育发生发挥着极其重要的作用。然而由于孕 期干扰因素的出现,胚胎发育缺陷,干扰了正常的背侧泄殖腔及背侧泄殖腔膜的 发育,背侧泄殖腔膜发育异常,背侧泄殖腔构象异常,肛门直肠的开口位置异常, 而异位的后肠开口位置的不同可能与背侧泄殖腔膜发育障碍的程度密切相关。背 侧泄殖腔膜及背侧泄殖腔整体发育缺陷是出现的形态学基础,背侧泄殖腔膜 及背侧泄殖腔的发育缺陷程度决定了程度。 结论 、在人类胚胎发育过程中,尿直肠隔与背侧泄殖腔膜并未发生融合,背侧泄 殖腔膜和背侧泄殖腔在肛门直肠发育过程中发挥了重要作用;肛门开口后,尿直 肠隔继续向头腹侧移位,与腹侧泄殖腔膜融合,腹侧泄殖腔膜在泌尿生殖道和会 阴的胚胎发育中具有重要的意义。 、细胞凋亡促进了肛门的崩解,使得肛门直肠与羊膜腔相通,在人类肛门直 肠的胚胎发育过程中有重要的意义;胎龄第.周尿直肠隔,腹侧泄殖腔膜发生的 细胞增殖和凋亡促进了尿生殖膈的头腹侧移位,在尿直肠隔与腹侧泄殖腔膜融合 过程中发挥了重要的作用。?论文二? /在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中 时空性表达的研究 ??’苎‘ 吾 刖 是常见的消化道畸形之一,严重影响患儿的生活质量。 的预防和治疗的关键在于明确该畸形的基因调控和胚胎发生机制,普遍研究认为 是一组受多因素影响的,涉及多个基因的复杂畸形。目前研究较多的与 发病相关的基因主要集中在与消化道末端发育相关的基因,例如,、聊?、 勰、耽加【啦】等均不同程度的在消化道末端发育中发挥作用。当上述基因 异 常均可导致动物出现肛门闭锁、直肠尿道瘘等畸形。 最近国外学者在大鼠胚胎发育研究中发现在哺乳动物尾端发育中起到 了重要的作用,尤其是对于后肠的发育特别关键【。采用人类全基因组表达 谱芯 片技术对比分析正常和患者直肠末端组织基因表达谱系的变化,结果显示 有多个涉及在高位与正常人直肠末端组织中呈现差异表达【引。此外也 有研究发现,参与调节生物学活性的也参与了消化道末端的发育,有 证据显示敲除的小鼠出现尾端平截的发育缺陷,认为通过调节其下游基 因的活性来调控肛门直肠的发育【。在哺乳类上皮细胞中,尤其是肠上皮的 分化 过程中,表达与上皮的发育阶段密切相关。据此我们推断/可能在 泄殖腔和直肠的发育中起重要作用,与的发生相关。而在胚胎期肛门直肠 发育中爪的时空分布模式仍不明确,/在的发生过程中如 何发挥的作用仍未得到满意的解释。因此,本研究应用乙烯硫脲, 致畸的大鼠的动物模型,分析/蛋白和在正常 及大鼠胚胎肛门直肠的时空分布规律,探讨/在大鼠胚胎肛门直肠 发育过程中所发挥的作用;研究/与胚胎发生机制的关系。材料与方法 一、实验动物、试剂和仪器 、实验动物 大鼠体重 ,由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心 提供。 、试剂 、多克隆抗体购自美 , 公司 .;.抗体购刍.公司;矾口坳衙超敏试剂盒,多 聚赖氨酸、显色剂等购自福州迈新生物技术开发有限公司;碱性磷酸酶标记 的兔抗山羊抗购自公司;乙烯硫脲: ,,.:购自德国公司; 全蛋白提取试剂盒购自南京凯基公司。逆转录试剂盒购自大连宝生物 工程有限公司:聚合酶及其反应缓冲液购自公司 、主要实验仪器 石蜡切片机:型德国; 光学显微镜: 型,日本; 解剖显微镜: .型日本 医用微波炉: 紫外分光光度计:岛津型日本; 组织超声匀浆器:型德国; 电泳仪:.型美国; .垂直电泳槽: 型美国; 转印电泳槽:小型上海天能公司; 凝胶成像分析系统:.型上海天能公司 超速低温离心机:??型德国; 二、实验方法 一动物模型制作及标本制备 、动物模型制作 体重~ 健康成熟未育的大白鼠,雌雄大鼠按:午夜合笼, 上午:~:做雌鼠阴道涂片,显微镜下观察发现精子者确认已交配,此日计 ,将确认已受孕大鼠随机分成两组装入笼内单独饲养,其他饲养条件不变。 致畸组:只孕鼠于经胃管按/注入%乙烯硫脲以生 理盐水溶解,继续分笼饲养,其他饲养条件不变。 正常对照组:只孕鼠于经胃管注入等量的生理盐水./,其 他条件同实验组。 组和正常对照组大鼠分别做以下处理,于、、、、 和根据计划各胎龄选取一定数量的孕鼠,在%水合氯醛/ .型,放大倍数. 腹腔注射麻醉下,应用解剖显微镜 倍行剖宫术,取出所有胎鼠,、、、胚胎取整个胚胎,、 的胎鼠取其盆部,标本经. 液冲洗后立即置于%多聚甲醛磷酸盐 缓冲液中固定小时小时,常规脱水,石蜡包埋。另一部分胎鼠取胎后立 即置于液氮中保存,以备显微切割提取组织蛋白和。 二石蜡切片 通过显微镜观察未染色的切片确定是否存在;畸形判定标准: .参照现有文献【】中的描述,观察泄殖腔膜、尿直肠隔、泄殖腔、后肠 和尾沟的位置、形态来判断是否存在;天的胎鼠通过观察直肠 末端与尿生殖道之间是否存在瘘管来判定的存在。 .的石蜡标本进行矢状面, .的标本行矢状面、横断面的 连续切片,通过观察未染色切片,选取相应正中矢状面的直肠结构清晰的切 片留 片,横断面的切片要求结构对称完整,厚度“,每个标本尽量留取连续切片。 进一步根据镜下结果,分为正常组、组,对各组切片分别进行、 的免疫组化,免疫组化实验采用链霉菌抗生物素 蛋白.过氧化物酶.,实验方法。 三法免疫组化染色操作步骤 、石蜡切片逐步脱蜡至水,.,.冲洗次,每次分钟。 分钟; 、抗原修复,以..枸橼酸缓冲液微波热修复~。 自然冷却至室温;冲洗次,每次分钟。 、除去液,每张切片加过氧化物酶阻断溶液,室温下孵育分钟; 冲洗次,每次分钟。 、除去液,每张切片加正常非免疫动物血清,室温孵育分钟。 、除去血清,每张切片滴加 、抗体:稀释,阴性对照标 ,?孵育小时。 本滴加 、冲洗次,每次分钟;除去液,每张切片加.生物素标记 的第二抗体,室温下孵育分钟。冲洗次,每次分钟。 、除去液,每张切片加链霉菌抗生物素.过氧化物酶溶液,室温下 孵育分钟;冲洗次,每次分钟。 、除去液,每张切片滴加新鲜配制的溶液,显微镜下显色。 、自来水终止显色,苏木素复染秒钟,自来水冲洗返蓝分钟,梯度酒 精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 四图像处理 采用. 多媒体彩色病理图像分析系统对、 表达进行定位观察分析,每张切片分别观察倍、倍及倍视野图像,来 判定阳性细胞的分布区域及大体变化趋势。 五 检测组织中的蛋白质表达量 、取材: 器械处理 取材所用的冰冻切片刀片、载玻片、显微器械及管均经% 处理小时,双蒸水冲洗后高压灭菌,烘干备用;实验者带无菌口罩、手套以及 帽子进行操作。所有操作皆在。冷室中在冰面上操作,完成一份标本的取材 后, 立即将所取标本置入.?冰箱暂保存。 .的大鼠胚胎 矢状位冰冻切片,厚,显微镜下观察结构,至下肢消失、尾沟出现时, 用无菌针头小心刮取膀胱最高点平面以下后肠组织;小心刮取其余盆部组织 包括 尾沟部位的组织,根据取材数量,约.个标本为一组放入一管中, 置入.冰箱暂保存。组通过冰冻切片显微镜下观察确认畸形后留取标本。 .的大鼠胚胎 在解剖显微镜下,截石位固定胚胎,切除尾部,自会阴部切除皮肤,仔细剥 离取材,游离末段后肠.,置于管中;致畸组首先通过发现直 肠盲端与尿生殖道之间的瘘管来确定,然后游离组末段后肠肛管瘘管 .置于管中;用于本组实验研究,根据取材数量,约个标本 为一组放入一个管中,置入.。冰箱暂保存。 、总蛋白提取及蛋白印迹 直肠末端/盲端全层组织总蛋白提取:组织约经破碎,组织匀浆 低温离心,应用南京凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白。各取蛋白定量,其 含量按改良法测定,以浓度最低管为基准,调节蛋白浓度,。冻存。 电泳:取总蛋白,加样品缓冲液,煮沸.分钟。山羊抗大鼠、 抗体经%.;抗体:稀释经%分离胶电泳, 电泳至染料带进入分离胶后电泳小时。 分钟。 转印海绵.滤纸.硝酸纤维素膜.凝胶.滤纸.海绵, 硝酸纤维素膜在中浸泡分钟,封闭小时,洗膜两 次,每次分钟,硝酸纤维素膜在一抗溶液中浸泡。过夜。山羊抗大鼠、 抗体:稀释和抗体:稀释。 硝酸纤维素膜从一抗溶液中取出,用快速洗一次,洗膜 两次,每次分钟。 硝酸纤维素膜转到加碱性磷酸酶标记的兔抗山羊工作浓度 :, 公司二抗溶液中浸泡小时室温,洗膜两次, 每次分钟,洗膜分钟,染色至条带呈现,终止染色。 硝酸纤维素膜在滤纸中干燥保存,用.凝胶图象分析系统扫描 分析结果。对蛋白质含量进行密度分析,以相对灰度值代表蛋白表达量。 相对灰度值该组检测蛋白的灰度值/该组的灰度值 六反应 、取材:同蛋白提取 、总提取 ,以 提取在超净台上进行,将标本剪碎,约加入 注射器反复抽吸至乳状,并换用试敏针头重新抽吸;加氯仿快速震摇 ,室温放置 , ,取上清加入 异丙醇静 离心 置 , ,弃上清,沉淀经%乙醇洗一次, 离心 溶解总,暂存。提取 离心 弃上清,最后用肛 在紫外分光光度计测定/舳,二者比值超过.证实纯度良好,低于. 者重新提取。 、逆转录合成 逆转录试剂盒购于公司,逆转录条件采用试剂盒推荐方法。 取总“用于合成, 逆转录体系如下: 曩 . / /.. .. 混匀后按下列条件进行逆转录: , , 内匀速升温 至? ,? ,? 。 、、的扩增: 引物设计参考美国国立医学图书馆基因库,利用.版软件设 计引物:引物由上海生物技术有限公司合成。 ’. 上游 ’.?丸玎.’, 下游 引物, ??粥.’,扩增片断长度。反应条件:预变性 ,? ,? ,? ,个循环,?延伸。 ’..’ 引 物 , 上游 , 下 游 ’?’ 。扩增条件:预变性,,. ,? ,个循环,?延伸。 扩增反应采用.体系: .. 聚合酶. 啦..“ 上游引物 . 下游引物 .肛 内参照选用,引物引物,上游:?’,下游: ’,扩增片断长度,引 , 物由上海生物技术有限公司合成。扩增条件:预变性 ? ,?,? ,个循环,?延伸。稀释浓 度 /。 、琼脂糖电泳 将产物 , “, 混合后,加样于%琼脂糖 凝胶齿槽中,以 为分子量标准,进行电泳.., 以溴酚蓝及二甲苯蓝为示踪剂,紫外灯下观察结果,用: 凝胶 . 分析系统拍照,以 分析软件系统对产物进行半 定量分析。表达水平通过扩增条带相对亮度来对比。以内参照相对 的值,得到相对含量进行分析。 密度值标化, 七统计分析 量,所有数据均以;士表示,差异 以相对灰度值代表各组、 比较采用.统计软件进行各胎龄正常组与组的检验,.表示 差异有统计学意义。 结 果 正常组共产胎仔只,无死胎吸收胎,未见畸形,不同胎龄胎仔分布数量见。