十二烷基磺酸钠对山羊精液冷冻效果的影响.doc

十二烷基磺酸钠对山羊精液冷冻效果的影响.doc 十二烷基磺酸钠对山羊精液冷冻效果的影响 摘要 在山羊冷冻精液稀释液中添加浓度分别为0.05%、0.10%、 0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的十二烷基磺酸钠(SDS)，探讨SDS对山羊 精液冷冻品质的影响。结果明，在冷冻精液稀释液中添加SDS可显著提 高山羊精子活率、顶体完整率和质膜完整率，添加量为0.10%时精子活率 最高，为73.90%;添加量为0.20%时顶体完整率最高，为58.46%;添加量 为0.10%时精膜完整率最高，达54.13%。随着SDS添加浓度的增加，冻后 精子质量也随之改善，但添加量至0.20%时，冻后精子质量显著下降 (P<0.01)。本次试验SDS的最佳添加量为0.10%。 关键词 山羊;冷冻精液;十二烷基磺酸钠(SDS);精子活率;顶体 完整率;质膜完整率 中图分类号 S827.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2015) 19-0286-01 Abstract In this experiment，the goat sperm was frozen in extrender containing 0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30% SDS respectively. The best results about semen motility，aerosome intact and membrane integrity were obtained with SDS at 0.10%(73.90%)，0.20%(58.46%) and 0.10%(54.13%) respectively.The quality of goat sperm after thawing decreased siginficantly with 0.20% SDS(P<0.01). In the experiment，the suitable addition of SDS was 0.10%. Key words goat;frozen semen;SDS;semen motility;aerosome intact;membrane integrity 我国的养羊业具有悠久的历史，山羊品种资源非常丰富。养羊业的发展关系着国民经济的发展和全国人们生活水平的提高。在广大的牧区、山区和丘陵地区，养羊业都有着巨大的发展潜力[1]。我国在山羊品种良种化方面与发达国家相比仍然存在较大差距。要解决这些问题，关键在于迅速提高山羊品种的良种化程度，因而需要优秀种公羊。目前在实际生产中，用鲜精进行人工授精可以提高优秀种公羊的利用率，但是这种方法受到很多因素制约，不能充分发挥优秀种公羊的作用和潜能。精液冷冻保存技术是人工授精技术的一大革新。这种方法将精子存放于-196 ?低温环境中，以暂时停止其新陈代谢，而升温后又能使精子恢复活力。此种方法由于限制较少，有利于提高优良种公羊的利用率，促进品种改良[2]。山羊精液冷冻保存技术始于1950年[3]，20世纪60年代，一些国家才开始应用山羊冻精进行人工授精。然而现如今在大多数应用中山羊精子的活率都无法稳定超过50%[4-6]。十二烷基磺酸钠(SDS)具有提高精液活力的作用[7]。本试验拟研究安徽白山羊精液冷冻保护液中添加SDS的效果。 1 材料与方法 1.1 试剂 主要试剂:十二烷基磺酸钠(上海试剂公司)、葡萄糖(天津石科密欧化学试剂开发公司)、hepes(Sigma)、二水柠檬酸钠(天津市福晨化学试剂厂)、青霉素(华北制药股份有限公司)、链霉素(华北制药股份有限公司)、甘油(天津市化学试剂三厂)等。 1.2 仪器 生物光学显微镜(XSJ-2型);相差显微镜(Olympus);热点鼓风干燥箱(HG101-2型);电子分析天平(JA1003型);自动双重纯水蒸馏器(SZ-93型);精子品质自动分析仪(CASA，Windows XP)。 1.3 溶液的配置 冷冻稀释液基础液:葡萄糖3 g，柠檬酸钠1.6 g，hepes 1.6 g，甘油5 mL，卵黄20 mL，青霉素10万IU，链霉素10万IU，蒸馏水定容至100 mL。福尔马林磷酸盐固定液:称取Na2HPO4?12H2O 2.25 g和NaH2PO4?2H2O 0.55 g置于100 mL容量瓶中，加入0.89% NaCl溶液30 mL并溶解。加入甲醛MgCO3饱和液8 mL后，用0.89% NaCl溶液冲洗装过甲醛的量筒并倒入容量瓶中，定容至100 mL。姬姆萨原液:称取Giemsa染料1 g、甘油66 mL、甲醇66 mL，将Giemsa染料置于研钵中，加入一定量60 ?的甘油，研磨至浆糊状。再将剩余甘油倒入，于56 ?保温2 h。再用甲醇清洗容器并于棕色瓶中保存。精子低渗液:果糖0.675 6 g(75 mmol/L)，二水柠檬酸钠0.367 6 g(25 mmol/L)溶于50 mL双蒸水中。 1.4 试验动物及精液的采集 试验用山羊精液取自安徽博大牧业种羊场，取精山羊为4头繁殖能力优良的2,3岁安徽白山羊种公羊。精液采集方法为假阴道采精法。 1.5 试验 采用单因素试验设计，设7个处理，分别在山羊精液冷冻液中分别添加浓度为0.05%(A)、0.10%(B)、0.15%(C)、0.20%(D)、0.25%(E)、0.30%(F)的SDS，以不添加SDS为空白对照(CK)，检测冷冻―解冻后精 液品质等指标，以明确SDS的最佳添加量。 1.6 检测指标与数据处理 精子活率、直线速率和曲线速率用精子品质自动分析仪进行测定，顶体完整性采用姬姆萨染色法测定，精膜完整性采用低渗肿胀试验测定。所有指标测定3次，取平均值，数据均以Mean?SD表示。采用SSPS 18.0软件LSD法进行平均数间显著性检验，以0.05作为各项结果的差异显著性。 2 结果与分析 2.1 SDS对冻后精子运动参数的影响 由表1可以看出，在冷冻稀释液中添加一定浓度的SDS，能显著提高冻后羊精子活率。其中，为B、C组精子活率最高，B组明显高于对照组(P>0.05);A组略低于对照组(P>0.05);F组精子活率最低，明显低于对照组(P0.05);E组运动参数直线速率最低(P0.05)，其中B组最高(P>0.05)。C、E、F组曲线速率均低于对照组(P<0.05)。 2.2 SDS对精子顶体完整性及精膜完整性的影响 由表2可以得出，顶体完整率随SDS添加量的增加逐渐上升，添加量达到0.2%时顶体完整率最高，达58.46%。但随着SDS添加量的进一步增加，顶体完整率呈下降趋势。各组顶体完整率大小依次为D>C>B>E>A>F。其中，A、B、C、D、E组均显著高于对照组(P<0.05)。 SDS对于精膜完整率也有积极作用。添加量达到0.1%时，精膜完整率最大达到54.13%。添加组的精膜完整率均高于对照组，各组大小依次为B>A>F>E>C>D。其中A、B、F组显著高于对照组(P<0.05)。 3 结论与讨论 在山羊卵黄精液冷冻液中SDS的最佳添加量为0.1%，能有效提高冷冻精液解冻后精子运动参数、顶体完整性和精膜完整性。Dewit等[8]、Pursel等[9]、Pontbriand等[10]研究表明，在动物精液稀释液中添加十二烷基磺酸钠能保护多种物种的精子细胞在冷冻过程中免遭损伤。本研究与之一致，试验结果表明在精液冷冻稀释液中适当添加SDS能有效改善冷冻后精子质量[11-13]。SDS对于冷冻精液的保护作用值得肯定。 4 参考文献 [1] 呼格吉乐图，旭日干.我国山羊业的发展现状及趋势[J].草食家畜，2005，129(4):1-8. [2] 王建辰，章孝荣.动物生殖调控[M].合肥:安徽科技出版社，1998:197-217. [3] SMITH JT. The method of freezing ram semen[J].Dairy Sci，1951，39(2):552-560. [4] 田亚丽.稀释液中添加海藻糖对波尔山羊冻精品质的影响[D].太谷:山西农业大学，2005. [5] 金花，王志斌，王国华，等.绒山羊精液冷冻保存技术及受胎试验[J].新疆畜牧业，2003(4):30-31. [6] 毛凤显，赵有璋，张明忠.波尔山羊精液稀释液配方的优化研究[J].中国草食动动物，2004，24(4):21-23. [7] TSUTSUI T，HASE M，HORI T，et al. Effect of addition of Orvus ES paste to frozen canine semen extender on spermacrosomes[J].Vet Med Sci，2000，62(5):537-538. [8] DEWIT M，MARLEY WS，GRAHAM JK.Fertilizing potential of mouse spermatozoa cryopreserved in a medium containing whole eggs[J].Cryobi-ology，2000，40:36-45. [9] PURSEL VG，SCHULMAN LL，JOHNSON LA.Effect of Orvus ES Paste on acrosome morphology，motility and fertilizing capacity of frozen-thawed boar sperm[J].J AnimL Sci，1978，47:198-202. [10] PONTBRIAND D，HOWARD JG，SCHIEWE MC，et al.Effect of cryopr-otective diluent and method of freeze-thawing on survival and acrosomal integrity of ram spermatozoa[J].Cryobiology，1989， 26:341-354. [11] 赵有璋，陈亚明，孙照刚，等.提高绵、山羊颗粒冻精品质的研 究[J].中国草食动物，2003(1):1-3. [12] 刘玉峰，李武，兰翠.乙二醇对绵羊冻精效果的研究[J].中国草 食动物，2002(6):9-11. [13] 马毅，曹斌云，姬云涛.山羊除精浆冷冻精液的研究进展[J].国 外畜牧科技，2001(4):33-35.