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人子宫内膜中S100A11调节胚胎着床的分子机制研究(可编辑)

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人子宫内膜中S100A11调节胚胎着床的分子机制研究(可编辑)
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的儿子,这个牵动我心底最柔软部分的男孩,是他,给我源源不尽的前行动力。 我只愿他日后长成如我正在相遇的这些人那样??快乐、进取和阳光。 天边流云在际,此刻,离歌声在耳畔回响,而我依然在这里,在紫金港湾的 某个角落里,不曾离去,不会离去。感谢岁月,让这些年,这些人,这些事,如 花般一一开落在心中。 我想说,这四年,很幸福,很精彩,很难忘刘欣梅 公元年月杭州 中文摘要 浙江大学博士学位论文 人子宫内膜中调节胚胎着床的分子机制研究 浙江大学医学院 妇产科学 级博士研究生刘欣梅 导师 黄荷凤教授 中文摘要 胚胎着床是指胚泡进入子宫腔后与子宫内膜粘附,并逐渐埋入子宫内膜的过 程。近年来,众多学者从细胞因子、粘附因子及其配基、免疫、激素等方面对胚 胎着床进行了广泛而深入的研究,取得了巨大的成功,发现了许多新的因子和新 的信息。本实验室在进行“蛋白质组学研究策略在早期妊娠流产以及卵泡发育潜能 研究中的应用”相关研究时,发现早期妊娠丢失的绒毛组织中表达水平显 著降低。该结论后被免疫组织化学证实。该研究暗示,可能在早期胚胎 着床中扮演重要角色。是蛋白家族的成员之一。该家族成员是是一 组低分子量的钙结合蛋白,与钙调蛋白及其他手型钙离子结合蛋白具有高度同 源性。 本文从临床调查、靶向性斟干扰的动物模型以及细胞学水平三 方面,分别对子宫内膜中钙调蛋白表达、分布,以及其在胚胎着床中上 下游调控机制进行研究。我们发现:分泌中期的子宫内膜中,大量分布 于腔上皮,腺上皮;临床调查中发现,在难免流产的蜕膜组织中、不明原因不 孕 患者子宫内膜组织中,表达降低.而在管性不孕行.治疗之后妊 娠失败的患者子宫内膜调查结果中,表达显著性降低.为进一步分析子 宫内膜中在胚胎着床过程中的作用,我们利用在体小鼠动物模型和体外 细胞培养,结合靶向性干扰技术,发现的低表达水平能够直接影 响胚胎的种植率,以及滋养细胞的粘附率。在对与胚胎种植息息相关的子宫 内膜 细胞容受和免疫耐受等的分子标记物的研究中,我们发现,低表达水平的 能够使子宫内膜容受和免疫耐受相关的重要的标记分子发生显著性地改变, 从而 不利于子宫内膜容受及免疫耐受的形成。 在对介导的胚胎着床分子机制 浙江大学博.卜学位论文 中文摘要 研究中,我们发现,子宫内膜中的并不受雌激素、孕激素以及促绒毛膜 性腺激素等的调控,相反表皮生长因子能够上调的表达。而该 现象的生物学意义在于,能够促进诱导产生的胞内钙离子的升高。 具体机制是:定位于细胞内内质网区域的作用于内质网钙库中钙离子通 道,参与了调控内质网钙池中钙离子的释放和摄取,从而使内膜细胞维持在 一个 动态的钙平衡状态,有利于胚胎种植。 第一部分在人子宫内膜组织中的表达、分布 目的:确认在人子宫内膜细胞上的表达及分布,分析难免流产病人蜕膜 组织中表达;分析不同妊娠结局的管性不育施.治疗的病人中 表达水平;分析不明原因不育患者子宫内膜中表达水平。 方法:用免疫组化法在子宫内膜的定位,用 法半定 量检测的表达水平,用.法检测的表达水平。 结果:.免疫组织化学结果显示,主要定位于子宫内膜细胞的腺上皮和腔 上皮,间质细胞上有弱表达。 .免疫组织化学的结果显示,在难免流产患者蜕膜组织中,表达较弱。 不明原因不育患者内膜组织中 的水平低于对照组,其中有例 患者明显 水平明显低于平均值。 管性不孕的妇女接受.治疗后治疗失败组 ,例的中 分泌期子宫内膜中蛋白的表达明显水平低于治疗成功组 ,例的妇女尸.。 结论:表达于人子宫内膜上皮细胞中。在难免流产患者的蜕膜、不明原 因患者的分泌中期内膜中,均呈现低水平,在接受.治疗后妊娠失 败的患者子宫内膜细胞中,的表达较低,这些临床资料均有力地暗示了 在胚胎着床中发挥重要作用 关键词:钙调蛋白 子宫内膜 体外受精.胚胎移植 浙江人学博’:学位论文 中文摘要 第二部分对胚胎种植的调控作用研究 目的:应用体外粘附模型和在体州干扰的动物模型来进一步验证是 否参与对胚胎粘附和着床的调控,并利用体外干扰技术,观察对 子宫内膜容受性标志性因子及免疫耐受相关细胞因子的直接调控作用。 方法:.建立靶向性干扰的在体小鼠胚胎种植模型,以特异性 州干扰受孕小鼠子宫内膜蛋白的表达,观察对胚胎种植结 局的影响。 .以心和细胞构建体外粘附模型,通过州干扰子宫内膜细胞中 表达观察滋养细胞球粘附率的变化,评价在滋养细胞球粘附到 子宫内膜细胞中的作用。 .利用子宫内膜细胞为体外模型,以特异性 干扰内膜细 胞中的表达,和 检测内膜容受相关因子、 血、.和等及免疫耐受相关细胞因子的变化。 结果:.在体的动物胚胎种植模型显示,子宫内膜中表达被敲减之后, 胚胎着床率显著性地低于对照组.。 .体外粘附模型中,与对照组相比, 靶向性组的滋养细胞球粘附 率显著降低。 .子宫内膜细胞中,在蛋白表达明显降低的情况下,, ,, 和等重要内膜容受相关因子的表达水平发生显 著性变化,胚胎着床时调控母胎免疫耐受的重要细胞因子表达发生显著性改 变. 结论:子宫内膜细胞中能够直接调节胚胎种植时重要的内膜容受相关基 因的表达,进而影响胚胎粘附、着床。 关键词: 胚胎种植率 子宫内膜容受性 免疫耐受 一 中文摘要 她 第三部分调控胚胎着床的分子机制研究 目的:调控胚胎着床的信号调节机制 方法:.应用 和法检测雌激素、孕激素、人 绒毛膜促性腺激素以及表皮生长因子对子宫内膜细胞中 是否存在直接调控作用。 .应用激光共聚焦显微镜及免疫电镜方法对子宫内膜细胞中进行亚细胞 定位。 .应用显微荧光测定法联合靶向性干扰技术检测子宫内膜细胞中 的浓度变化和、之间的关系。 结果:.子宫内膜细胞中的表达不受,以及的调控,但是, 的刺激能够显著性上调子官内膜细胞中的表达。 .激光共聚焦显微镜观察结果显示,大量分布在内质网标记物 区域,通过免疫电镜的方法同样发现,在内膜细胞的内质网区域有分布。 .钙离子检测结果显示,促进了引起的胞内钙离子的释放,但细胞中 被敲减后,这个作用被抑制。 .促进了由唱和引起的内质网中钙库的钙离子释放,但 是,如果细胞胞内被特异性 ?干扰后,该现象受到抑制。 结论:胚胎着床时,子宫内膜细胞中的能够应答内源或外源性的的 刺激,显著性上调。能够促进刺激引起的胞内钙离子的升高。定位 于细胞内内质网区域的可能参与了调控内质网钙池中钙离子的释放和摄 取,从而使内膜细胞维持在一个动态的钙平衡状态,有利于胚胎种植。 关键词:“ 内质网钙库浙江大学博上学位论文 英文摘要 ? “, : :’. 啪 .锄州 , .曲, 拶 , 孤 、他 ?,、. 叫。一. 缸. . , ,、? ,浙江人学博.卜学位论文 英文摘要妙 ;眦 / 硼 , 仃.,? ;.啪, 啪 .啪 , “巧 , . : “:’’ , , 印锄 ?仃, 吼英文摘要 浙江人学博:仁学位论文 、? , . 恤嘶. ?鲥向 . : . 印 巧 : .:仃 : 仃啪, 啪.“之 :.啪 . 切,. 巧 、?.、? 加加.. 舭 . 叙 啪. . 、代. 嬲 啪,浙江大学博十学位论文 英文摘要 . . ‰.. . 、? ,, ., , ’ , , ,, , ,一 , . :巧 /. ,锣 : , 觚 印够 :蜥: 叮 础 :.,,啪 们, 、. . .墒咖浙江人学博十学位论文 英文摘要 . :.、, . ; .啪 . 此 姗.. . 培 . 一十,廿 啪 . : ; . , , 叮 . : ?缩略词表 浙江大学博.卜学位论文 缩略词表 中文全称 缩略词 英文全称 雌二醇 孕酮 .胎牛血清 磷酸盐缓冲液 牛血清白蛋白 聚丙酰胺凝胶电泳锄 锄 乙二胺四乙酸笨甲基磺酰氟 ?‘ 。 ‘‘ 汀. 盯. 逆转录.聚合酶链反应 逆转汞一聚合酶链反应 ? 小片段干扰 仃 种植窗 .白血病抑制因子 ?相关蛋白 文二 . , 蛋白二硫异构酶 啪 内质网 / 内质网钙.酶 . 三磷酸肌醇受体受体 锄 日次 浙江大学博十学位论文 目次 谢. 致 中文摘要.. 缩略词表. 目影?? 弓?一 第一部分在人子宫内膜中的表达、分布?. 弓?.. 材料和方法 结果??.. 讨论? 第二部分在胚胎着床中的作用? 引言? 材料和方法??. 结果? 讨论? 参考文献.. 第三部分子宫内膜细胞介导诱导胚胎着床的分子机制研究??. 引言. 材料和方法??. 结果? .寸论? 综述? 作者简介及在读期间所取得的科研成果??./浙江大学博上学位论文 引言 钙调蛋白在胚胎着床中的分子机制研究 浙江大学医学院 妇产科学 级博士研究生 刘欣梅 导师 黄荷凤教授 引言 胚胎着床是指胚泡进入子宫腔后与子宫内膜粘附,并逐渐埋人子宫内膜的过 程。调控胚胎着床的机制十分复杂,需要母体与胚胎的协同作用,涉及多种物 质 的参与,包括激素、细胞因子、粘附分子、免疫因子、酶等【,】。胚胎埋入 子宫内 膜的过程中,既需要胚胎自身的准备,也需要母体子宫提供一个容纳的微环境, 只有当胚胎和子宫内膜形成一种正常的良性的对话之后,胚胎才有可能成功植入 母体体内,使女性受孕成为可能,】。 近年来,众多学者从细胞因子、粘附因子及其配基、免疫、激素等方面对胚胎 着床进行了广泛而深入的研究,取得了巨大的成功,发现了许多新的因子和新的 信息【】。在胚胎着床过程中,子宫内膜的变化以及达到接受胚泡着床的“容受性状 态”与哪些基因表达及其产物相关,还需要进一步探索。随着不孕不育患者日益剧 增,她们对于生育迫切需要使我们对于揭开胚胎植入这一生理过程的神秘面纱有 了更深层次的渴望,而且了解胚胎着床相关分子的作用机理,对于不孕不育症、 习惯性流产的诊治以及胚胎着床特异性避孕疫苗的研制具有十分重要的意义。 在胚胎植入子宫内膜的过程中,子宫内膜细胞中的钙离子的变化是子宫内膜处 于容受状态的一个重要指征,钙离子作为细胞内一个重要的信使,通过调动一系 列与其相关的蛋白发挥作用,然而,钙调蛋白种类繁多,其作用机制及其引发的 一系列下游事件复杂难述。本实验室对早期妊娠丢失的绒毛组织, 和正常妊娠绒毛组织的比较蛋白质组学研究发现,在早期妊娠丢失的 绒毛组织中表达水平显著降低。该结论后被免疫组织化学证实【】。这个引言 浙江人学博一:学位论文 发现暗示了,在胚胎植入期可能发挥重要角色。 属于蛋白家族成员,蛋白二级结构见图【】。蛋白是 一类多基因家族的低分子量蛋白,参与多种不同类型细胞和组织的多种生物行为 【】。包括在内的众多该家族成员的编码基因均位于号染色体区带。, 这个区域编码众多与生长和分化有关的蛋白质的基因如鲥 】【 “,。 ,嘶 在细胞增殖和分化中的作用因此倍受关注。 一 董 ’。 ?‰ ‰照支?黜双心屯熨“型夏州 雏,. 矗嘲瞪雠甜苎。碍? 鑫 ? 黟 , .巨。 矗。 翻 髓?曛话越鼗蝴嬲 , 锄 渊 ’?勃 。. 秭 .王】? 黔嘶.?彻略 畦 乞 墨 ., 晒】烈赫. 辩:; 题虎 嚣节?哇剐窄 ? 箩.量泌 饿 娜。 《?也触瑚? 图 首先是从鸡砂囊中发现的,命名为钙囊素,之后在其 他器官和组织中,如人胎盘、猪心脏、兔肺中都有发现。【】等从人细胞的 文库中筛选得到的片段,对于不同组织中的矾水平 进行了检测。 杂交分析结果表明, 矾在胎盘中最高,心、 肺、肾和骨骼肌组织中表达水平中等,脑中的表达水平最低。和同家族 其他相关蛋白相似,有多种生物学功能,其主要功能是转导钙依赖性的细胞 调节 信号,参与细胞的增殖、分化、细胞凋亡和癌症的形成和进展相关【.】。 研究显示,与钙结合后,蛋白的构象发生改变,暴露出疏水区,然 后与靶蛋白结合。的结构包括个阿尔法螺旋.,通过和’, 和?’之间相互接触,形成一个同型二聚体,组成了一个独立的反平行式结 构。螺引言 浙江人学博十学位论文 旋内的残基和另一个单体的’结合,他们在一个合适的位置上,形成一 个分子间的二硫键。实际上,由二硫键交联形成的二聚体处于非还原性 状态【】。在成纤维细胞和角质细胞中,大多数分布在细胞质内,和肌动 蛋白同区域。当细胞在受刺激的情况下, 如细胞钙离子浓度增加,的分 布会发生变化,导致两个明显的重定位: 分布于细胞周围和细胞核】。 的一级结构研究表明, 能够通过与/ 近年来,对 结合,与膜融合。其机理是,结合释放了 蛋白螺旋的末端,从 而使它能够和膜或结合【,】。因此,分布在周围和 有关,微管形成时, 和共定位,分布在细胞周围,参与膜转运 程序。我们前期的免疫荧光实验结果也证实了这个现象。 具有细胞核向细胞浆转移的特性,因此推测它在细胞的增殖过程中 起调控作用。有学者发现能够由细胞浆向细胞核进行钙依赖性转移。这 个移动涉及到磷酸化并与负责胞浆与核间物质转移的核蛋白 的相互作用,引起细胞周期依赖性激酶抑制剂的表达增加,最终导致细胞 增殖的抑制。但是,也有学者在较多肿瘤组织细胞中发现的表达水平增 加。因此,对细胞增殖的调控可能存在其他的机制】。 现有的资料显示:在调节细胞生长的过程中,表现出双重身份:在 一些典型的生长抑制因子、高浓度钙离子以及等的作用下,作为一 种必要的介导因子,参与抑制细胞生长这一生理活动。然而,当通过自 分泌或旁分泌方式作用于细胞时,通过诱导及其相关受体的表达促 进细胞的生长图.】。 浙江人学博上学位论文 引言 图: 、矾 目前,国内外针对在妊娠过程如胚胎植入、子宫内膜容受等领域中 的探究罕见报道,特别是作用机制的研究尚未见报道。这为我们进行深 入研究提供了机会。基于我们前期研究工作的结论,我们认为,极有可 能是胚胎种植过程中一种重要的调控因子,它既可能通过内源性作用,对子 宫内 膜容受性进行调节,同时,它还能通过自分泌或旁分泌方式,分别对子宫内膜 的 增殖和胚胎的黏附产生影响。我们需要更深入的研究,去探究在胚胎着 床中是如何去执行这多重的功能,这不仅能为揭示胚胎着床的精巧调控网路 提供 多方面的线索,同时,通过对在子宫内膜中活动机制的调查,我们能够 将着床前子宫内膜增殖和黏附性能变化、子宫内膜容受、胚胎黏附种植等多 种生 理现象结合在一起,更加立体和客观的解释胚胎种植的科学现象,为临床治 疗不浙江人学博:学位论文 参考文献 参考文献 . 【】 .. 巧 :. .?.口甜陀耙?博刀,记只, 【】. ., .锄, ..行 : .够‖幽&把刀邸. ,. . 】.胁玎砌.,.【】彻 ,.., : ,,,锄 诧.朋台讲玎口,口彤把坦, .. , ,?. 【】.., ,, . , , , 】 , , . 砌 . .面,尺伽 , .,锄 , ,、 【】 .砌,.,砌馏锄烈 , .. 【】 ,锄 , , . 姗觚, , 盯:.爿姑,叩口历,秒 ,?. .啪 【】 , , 位 斟撕一 . .胁办所.少,鹕足强为脚聊“即. , .【】虹, , , ,.砌 浙江大学博.:学位论文 参考文献 口玎,.也,. , ’ .、?一 】 ,】 谢 ?.,加口刀? 强,?., 【】锄, , . 锄觚 .协砌砌以一. 撕 协?甜 .咖 , 【】 , /啪.,胸,施矗 印 ,...“ 巧 【 】 】 .缸甜,?. ,?. , 【】 , ,吗 , 锄 ,’锄 ,? , . 似 王 舶.砌 ? . 如甜口,厂&盯舶,缈 , 【】,..,,.., ,.. . 量 ?衄.... , , 【 】 , , , 锄一. , ,狐 , 巧 印 晰咖 . 硒,. 锄 嘲 ” 饧,.,.. , , , 【】 . , 锄?. . 盯硒,秒 ,? / ,狄 ,., 【】 ,.砌印 ,劢 浙江人学博十学位论文 参考文献 如删口,矿刀,舌. ,?. ,城她, ,锄 【】 .,舭 , ,锄 砌., ,锄、 ”.朋胞甜,『厂面,‖矿砌 ,.,?. . 诧 【】妯, ,锄 , , . /加 叭啪 .” .,,:?. . 鲫乃办. .舭 】 ,. 第一部分在人了宫内膜中的表达、分布 大学博士学位论文 第一部分在人子宫内膜中的表达、分布 引言 蛋白属于蛋白家族成员。蛋白家族是一组低分子量的钙结 ,其氨基酸序列在脊椎动物中高度保守, 合蛋白,相对分子质量为~× 与钙调蛋白及其他手型钙离子结合蛋白具有高度同源性。目前共发现有种 结构与功能相似、存在于不同部位的可以调节细胞内和细胞外?的蛋白【, 】。 首次从鸡砂囊中发现,命名为,或百枷。随 后人们在哺乳动物的其他组织和器官中均有发现,如人胎盘等均呈稳定表达 状态 【】。等从人细胞的文库中筛选得到的片段,对于不 同组织中的水平进行了检测。 杂交分析结果表明, ?在胎盘中最高,心、肺、肾和骨骼肌组织中表达水平中等,脑中的 表达水平最低【】。有学者发现,在成纤维细胞和角质细胞中,大多数分 布在细胞质内,和肌动蛋白同区域。当细胞在受刺激的情况下,如细胞钙离子浓 度增加,的分布会发生变化,导致两个明显的重定位:分布于细胞周围 和细胞核】。 作为钙绑定蛋白,依据对钙离子的结合能力,在角状上皮细胞发挥不 同功能。但是,直至目前,国际上对于在生殖系统的功能研究开展较少。 因此,我们无法得知它是否会对胚胎种植及妊娠产生影响。本实验室对早期妊娠 丢失的绒毛组织和正常妊娠绒毛组织的比较蛋白质组学研究发现,在早 期妊娠丢失的绒毛组织中表达水平显著降低【】。该发现暗示了 在生殖过程中可能发挥着重要作用。结合钙离子对于生殖调控的重要信使地位, 我们对和胚胎种植及妊娠的关系产生了兴趣。 国内有相关学者发现, 在子宫内膜癌组织中表达明显高于 子宫内膜组织【】。而对于它在人子宫内膜的定位,目前尚未见报道。因此, 浙江人学博:学位论文 第一部分在人子宫内膜中的表达、分布 部分的实验中,我们拟对临床正常女性分泌中期子宫内膜中的表达及其 定位进行观察。同时,本研究聚焦于临床上常见三种生殖相关疾病包括难免流产、 不明原因不孕及管性不育,调查其蜕膜或子宫内膜组织中表达与疾病自 身以及相关妊娠结局之间的关系进行研究。从临床调查中,企图寻找表 达水平和胚胎及其妊娠之间的关系直接证据,从而确定表达水平是否对 胚胎着床产生重要影响 浙江大学博士学位论文 第一部分在人予宫内膜中的表达、分布 材料和方法 、研究对象 本研究中所采集的人子宫蜕膜组织及内膜组织标本均获得患者本人或家属知 情授权。 本实验纳入的早期难免流产患者,均经确诊为妊娠后出现无任何诱因的阴道多 量流血,超过正常月经量,并有血块排出,伴阵发性下腹部疼痛,妇科检查发现 子宫颈口已开大,可见胚胎组织堵塞于子宫口。孕周豇周,年龄~岁。患 者排除其他感染性疾病的患者,无服药史,无不良生活环境如全封闭低氧环境、 新装修的有毒有害环境。同时男方精液正常,夫妇染色体核型正常,无遗传病史, 无产道异常及免疫系统异常,无既往自然流产和死胎死产史。以正常人工流产患 者的蜕膜组织作为对照组蜕膜,患者孕周乱周,年龄岁。 选择在年月至年月期间,于浙江大学医学院附属妇产科医院 就诊的管性不育患者共例,不明原因不孕患者例。不明原因不孕患者依据临 床诊断标准诊断为不明原因不孕。两组平均年龄约岁,无其他内、外科疾病。 既往月经规律,周期天,治疗前个月未用何激素类药物治疗。不孕年限 ?年,于?.前一周期行宫腔探查术时月经周期第天,体温升高后第 ,撕,获取子宫内膜标本。 ?天用吸管, 以上所取标本均经浙江大学医学院附属妇产科医院医学伦理委员会的同意, 患者 均已签署知情同意书。标本分期均经组织病理证实,无黄体功能不全。取材 后标 本分为二份,一份迅速放入液氮中保持,尽快移入实验室于液氮中保存,用于 提 取蛋白,一份放入%甲醛中固定,用于做免疫组织化学。 、主要试剂及配制 主要试剂 细胞裂解液:公司产品。 兔抗人多克隆抗体:公司。 公司。 鼠抗人阳单克隆抗体: 浙江大学博::学位论文 第一部分在人了宫内膜中的表达、分布 辣根酶标记羊抗鼠抗体:北京鼎国生物技术有限公司。 辣根酶标记羊抗兔:北京中杉公司。 蛋白定量试剂盒:公司产品。 膜:公司。 显色试剂盒:美国公司 显色试剂盒:北京鼎国生物技术有限公司。 二抗试剂盒:北京鼎国生物技术有限公司。 为.缓冲液:北京鼎国生物技术有限公司。 染色试剂伊红、苏木素:北京鼎国生物技术有限公司。 %过氧化氢溶液:北京鼎国生物技术有限公司。 溶液配制 溶液在双蒸水加, ., ., .,调值至。,加水定容至。 % 双蒸水中加入电泳级,加热至?助溶,调节值 至.,加水定容至叫。 ×丽春红溶液在双蒸水中溶解丽春红,三氯乙酸,璜基水杨酸 ,使用时,稀释成×的工作液。 %多聚甲醛.多聚甲醛溶于×中,定容至,?水浴中溶解, ?保存。 主要仪器 台式恒温振荡器:上海跃进医疗仪器厂。 紫外可见光自动分光光度仪:美国‰公司。 蛋白质电泳仪及电转槽美国:?公司。 一电热恒温水浴箱:上海医用恒温设备厂。 制冰机:公司。 微量天平:.型,公司。大学博:学位论文 第一部分在人了宫内膜中的表达、 分布 高纯水机: 、 酶标仪:.,公司。 高温灭菌器:公司。 、实验方法 .免疫组织化学 .载玻片准备:载玻片经清洁液处理后冲洗干净,?.?烤箱烘烤小时备用。 .蜡块制备及切片:将放入%多聚甲醛中的组织,于?固定 后,石蜡包埋, 冰箱预冷后,以厚度切片并固定于载玻片上。 .脱蜡、水合:石蜡切片于?烘箱烘烤过夜后迅速投入二甲苯溶液中各脱蜡 ,再经无水酒精、%酒精、%酒精、%酒精分别透明。最后将 切片放至大量清水中冲洗。 .抗原修复:将切片置于高压锅中已沸腾的为.缓冲液中,继续加热 至喷气,分钟后自然冷却后取出切片,放入氯化按溶液中分钟, 再用含%和.%明胶的冲洗三次各。 .染色: 每张切片滴加相应的一抗,稀释度为:,室温下孵育后?过夜。 冲洗次,每次,擦干净载玻片。 与辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育, 冲洗次,每次,擦干净载玻片。 每张切片加?新鲜配制的显色溶液,显色时间?。 苏木精染色?后,自来水冲洗;%盐酸酒精分色。 .脱蜡及透明:梯度酒精%酒精、%酒精、%酒精、无水酒精中依次浸泡, 以脱水促进片子干燥。然后用二甲苯透明。 .封片:干燥后,中性树胶封片。 .免疫组织化学分析:用.提出的组织学积分.方法进行半 定量分析,计算公式:??。其中代表每种组织的免疫组化染色范浙江人学博 上学位论文 第一部分在人子宫内膜中的表达、分布 围内同一染色强度的阳性细胞数占待测细胞总数的百分比,即阳性细胞数/ 待 测细胞总数。为染色强度,用,,分别代表、、十卜十时,染色阴 性,组织学积分为,不计,.最大值为,为纠正系数。 .免疫印记、 曲 .组织蛋白质的提取 获取冻存的子宫内膜组织用磷酸盐缓冲液冲洗后,按照质量/体积/, ‖“:加入含%蛋白酶抑制剂、的蛋白裂解液,冰浴中充分匀 浆,冰上静置。转,?离心 。将离心后的上清液转移到. 离心管中,冻存于.?备用。蛋白质含量的测定采用法。 . .聚丙烯酸胺凝胶电泳. %.凝胶的制备:安装玻璃板,灌注分离胶至梳齿下。在胶溶 液上方覆盖去离子水,防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合反应。待分离胶聚合 完 全后约 ,制备%积层胶,倾出分离胶上面的水分,灌注积层 胶,插上梳子。待积层胶聚合完全约 后,移出梳子,用去离子水冲洗 加样孔及凝胶底部,去除未聚合的丙烯酞胺。将凝胶固定在电泳装置上,上、 下槽均加入×嘶甘氨酸电泳缓冲液,排除凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 蛋白样品的变性:等待凝胶聚合的同时取相当于蛋白的提取液,加入等体 积上样缓冲液,?,使蛋白变性. 上样:微量加样器顺序加样,每板胶均设预染蛋白质诎同时上样。 因样品蛋白均已稀释成同一浓度,故嵋蛋白所需要的体积数恒定,即 每孔上样的体积相同。 电泳:先以电泳约 ,当染料进入分离胶后,将电压提高至, 继续电泳至嗅酚蓝到达分离胶底部。 转膜:卸下玻璃板,取出凝胶。按照凝胶大小剪张骱咖滤纸和 张膜,在甲醇中浸湿。将凝胶与滤膜紧贴,两侧各贴上张滤纸,边缘 对齐,驱除气泡,夹在多孔海绵中,装置电转槽。电压 ,转移。浙江大学博十 学位论文 第一部分在人子宫内膜中的表达、分布 封闭:将膜剪角标记方向,放入封闭液中,室温、水平摇床上孵育。 免疫反应:弃封闭液,加入一抗溶液为:、?为:,用 封闭液稀释,摇床上室温下孵育,放置于?冰箱内过夜。弃去一抗溶液, 用.溶液洗次,每次。加入二抗溶液均为:,室温下摇床 上均匀摇动。弃去二抗溶液,用×。溶液洗次,每次。最后以 。 洗膜次, 化学发光和显影、定影:取试剂液、液等体积混合用量视膜面积而 定,大约./,加在膜上,显影。将膜取出,以保鲜膜包裹,压上 胶片,避光红色暗房灯下曝光。胶片浸入显影液,一旦出现清晰 条带即终止显影、自来水冲洗,浸入定影液.,自来水冲洗、晾干。 .凝胶图像分析 .成像系统扫描胶片并保存图片,啪软件分析条带光密度值, 将目的条带与?的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。 .组织总的提取 .采用“一步法提取组织总酬。步骤如下: ?. ,充分匀 . 管中加入组织,加. 浆,室温孵育。 加入氯仿,剧烈振荡,室温孵育。 ?离心, ,小心吸取上层水相至新? 管。 加入等体积预冷异丙醇,振荡,室温孵育。 ?离心,,弃上清液,加预冷%乙醇.水配 制,涡旋。 ?离心,,弃上清液,空气中干燥切勿完全干燥。 .雠水溶解埘,置.?保存备用。 加入 纯度及浓度检测取总矾抽提液,.水稀释倍后采用 .紫外分光光度仪检测样品/的吸光值值,要求 浙江大学博一:学位论文 第一部分在人子宫内膜中的表达、分布 /砭.,符合此条件则计算矾浓度及核酸量。若/., 用氯仿重新抽提以去除蛋白质或%乙醇再次洗涤。 注:实验全程戴一次性帽子、口罩、手套以防外源性?污染。实验所用微 量离心管及吸头均为州一能的一次性用品。其余塑料制品用.%浸泡 ,.?烤干,实验前?高压灭菌,再.?烤干。玻璃制品泡 酸过夜,冲洗干净,.%浸泡过夜,再?烘烤。匀浆器包括剪刀、 镊子先洗净后,再高压灭菌。 .逆转录合成 逆转录反应体系组成如下。除总喇外,其余各成分按标本例数预 混,再分装入各管,分别加入总乇。反应条件:?,?,.? 保存备用。 逆转录体系 ×疵 山 肛 邺 行 ? .实时定量 反应条件: 预变性?热循环?,?,?共个循环叶终 末延伸?。 浙江人学博士学位论文 第一部分在人子宫内膜中的表达、分布 反应体系 “ ? .“ .肛 .“ .肛 引物设计 ’一’ ’’?盯、统计学分析 采用.统计软件包进行统计学分析。所有资料均用 方法检验其正态分布,方差均具有齐同性,结果用均数士标准误士 表示,独立样本检验对两组之间的差异进行比较。双侧.,差异显著, .,差异极显著。 浙江人学博.:学位论文 第一部分在人宫内膜中的表达、分布 结果 .在人子宫内膜的表达和分布 图. ?在入分泌中期子宫内膜的表达和分布 左侧:阴性对照;中间:×;右侧:× 免疫组织化学实验结果显示,定位于子宫内膜细胞的腺上皮和腔上 ‘ 皮,间质细胞上有弱表达图.。 .在难免流产患者及正常流产患者蜕膜组织中表达和分布 通过对难免流产患者和正常人工流产患者的蜕膜进行免疫组织化学分析,我 们发现,在蜕膜组织中主要分布在上皮细胞中,间质细胞中有弱表达。 但是,更为重要的是,在难免流产患者蜕膜组织中,的表达显著性降低图 .。通过.评分对其进行半定量,结果显示,正常流产患者和难免流产患 者的蜕膜中的.评分分别为.和.,两组之间存在显著性差 异,料,.图.。
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