基因芯片鉴定大肠细菌

基因芯片鉴定大肠细菌 【摘要】本组实验分次完整练习了基因芯片测定大肠杆菌的过程，包括大肠杆菌培养、提取 大肠杆菌基因组DNA、PCR扩增其HSP70基因，电泳检测扩增产物、扩增产物与 基因芯片杂交并检测杂交信号等过程。 【关键词】基因芯片 大肠杆菌 荧光标记 基因片段 【引言】基因芯片是指将特定的DNA或寡聚核苷酸片段通过物理化学固定于玻璃、尼 龙甚至塑料片上,使多基因可同时进行的一种装置。 基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经PCR扩增和荧 光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检 测到这些杂交信号(带有荧光标记的双链核酸)，杂交信号出现在某物种的探针位 点上，说明样品来自于该物种。 鉴于基因芯片的特异性不强和需要待检测物质荧光标记的特点，所以利用基因芯 片鉴定特定物种，需要提取其DNA并进行PCR扩增及荧光标记，再使扩增产物 与基因芯片杂交，利用基因芯片扫描仪检测杂交信号。 【实验材料及方法】 一、实验准备 试 剂 1、TE:10mmol/L Tris?HCl，1mmol/L EDTA 2、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)/ NaCl:将4.1g NaCl溶解于80ml水中，缓慢加入10g CTAB，定容至100ml。 3、苯酚/氯仿/异戊醇混合液:水饱和酚 : 氯仿 : 异戊醇 = 25 : 24 :1(体积比)。 4、氯仿/异戊醇混合液:氯仿 : 异戊醇 = 24 : 1(体积比)。 5、10μg/μl RNase A 10% SDS 20 mg/ml 蛋白酶K 5mol/L NaCl 3mol/L NaAc 无水乙醇 75%乙醇。 6. 20×SSC:在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴HCl溶液调pH至7.0，加水定容至1000ml，分装后高压灭菌。 7.杂交液:6μl 100,甲酰胺，0.24μl 10,SDS，1.8μl 20×SSC和4μl荧光标记的PCR扩增产物。 8.洗液?:2×SSC，0.2% SDS 9.洗液?:0.2×SSC 仪 器 基因芯片扫描仪 摇床 离心机 二、实验步骤 第一部分:细菌培养 配制100ml LB液体培养基，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，加重蒸水100ml， 用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。 将大肠杆菌单菌落接种于LB培养基中，37?恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为 280r/min。 第二部分:提取纯化大肠杆菌基因组DNA 1、取培养的菌液10ml，4000r/min离心10min，除去上清液。 2、加入1ml TE，使细菌沉淀充分悬浮。 3、加入0.2ml 10% SDS 溶液，再加入10μl 20 mg/ml 蛋白酶K， 37?水浴中温育1h。 4、取出离心管，加入0.2ml 5mol/L NaCl 溶液，混匀后再加入0.2ml CTAB/NaCl 溶液，65?水浴中温育20min。 5、加入与菌液等体积(1.6ml)的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀，4000r/min离心10min。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。 6、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀，4000r/min离心10min。 7、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入2μl RNase A，37?水浴中温育30min。 8、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，抽提残留在水相中的苯酚。4000r/min离心10min。 9、将上清液移至新的离心管中。 10、加入上清液1/10体积的3mol/L NaAc溶液，以及上清液2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀DNA。室温下静置10min，DNA形成白色(或淡黄色)絮状沉淀。 11、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装 有适量75%乙醇的1.5ml离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。7500r/min离心5min。 12、去上清液，沉淀干燥后溶解于100μl TE中。 第三部分: PCR扩增 加入组分如下: 组 分 剂 量(μl) 基因组DNA 10-100ng 10×PCR缓冲液 3 4×dNTP(各10mol/L) 0.5 Mg++ 2.5 上游引物(HEX标记) 1 下游引物(HEX标记) 1 Taq DNA聚合酶 0.5 dH2O 21(随模板体积变化) 总体积 30 PCR反应程序: 阶段 温度 时间 起始变性 94? 3min 变性 94? 30s 退火 60? 30s 循环40次 延伸 72? 45s 最后延伸 72? 10min 第四部分:基因芯片杂交和检测 因为获得的大肠杆菌DNA及其PCR产物没有用荧光标记，所以实际用于与基因芯片杂 交的DNA为购买的带有荧光标记的DNA商品。 (1)准备芯片:去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽 中，胶面朝上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用手捏着芯片上贴有标签纸的一端， 将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面(贴有标签纸)朝下放入模具。在芯 片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围栏紧贴在芯片上。 (2)往杂交盒底部凹槽中均匀加入少量蒸馏水(约200μl)，以防止杂交过程中杂交液大 量挥发。把芯片有杂交围栏的一面朝上放入杂交盒中，按芯片摆放方向盖上盖片，注 意使盖片上的凸面朝下。 (3)杂交:将杂交液用移液器混匀后3000r/min离心30s，95?热变性3min。冰浴骤冷 1min。用移液器将杂交液注入盖片上的小孔。盖上杂交盒的盖板，两侧用两个卡子扣 上，确保杂交盒的密封性。在42?水浴中杂交2小时。 (4)清洗:洗液先预热至42?。将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面朝上，放在 水平摇床上清洗。依次在洗液?、?中各清洗4分钟。然后放在50ml锥形离心管中 (标签纸端朝下)，1500 r/min离心1分钟以除去芯片表面的水分。 (5)扫描及结果测定:启动微阵列芯片扫描仪系统，进行芯片扫描，保存检测结果。 【实验结果与讨论】 一 、实验结果 以下是我们使用同一基因芯片的四个小组的实验结果。因为有一个阵列没有扫描到结果，实际获得三组实验结果。 黄单胞菌的检测结果 黄单胞菌的检测结果 大肠杆菌的检测结果 二 、实验讨论 ?PCR反应注意事项 1、PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。所有试剂都应没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 2、试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子。 3、PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。 ? 基因芯片操作注意事项 1、精确的控制温度 :基因芯片的杂交过程对温度要求很高，要希望严格按照说明的要求控温，也要特别注意室温的控制。 2、芯片的显色结果会随着时间的延长而发生变化，而且，其变化并不是线性的，即有些点的信号会变弱，而另外一些的信号反而可能增强，在芯片显色结束后要尽快(2个小时之内,)进行扫描并分析保存结果。