菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质的研究（可编辑）

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质的研究（可编辑） 菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质的研究 谨以此献给尊敬的导师焉翠蔚教授 ~~~随建强菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 学位论文完成期 指导教师签字 答辩委员会成员签字 幕 摹独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作段取得的 研究成果。据我所知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包 含其 他入已经发表或撰写过的研究成果,也不包含束获得 ?丝翅超要基些藿蔓挂型巨盟鲤,奎拦互窒或其他教育机构的学位或证使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:《建瑟。签字日期:。年月;日 学位论文版权使甩授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定.有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。 本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索.可以 采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术 信息 研究所将本学位论文收录到《巾国学位论文全文数据库》.并通过网络向社 会公 众提供信息服务。保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师签字 学位论文作者签名 随龟臻、 翻蔚 签字日期 签字日期:年月 厶一年月,拍黄 ’ 唾 舞 遗 ? ~ 妻 :., ? 掣 粤 博 蓦 。 一 ‘ 蚺 口 。丢菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 摘要 碱性磷酸酶 ,是生物体内一种重要的调控酶, 可催化各种磷酸基团的水解和转移反应。在生物体内,广泛参与鱼类葡萄 糖、脂类、无机磷及钙的吸收,维持适当的钙磷比例.并且在贝类动物贝壳形 成 过程中起到重要作用。纯化后的被广泛应用在酶免疫分析和基因工程领域。 目前应用的主要是从大肠杆菌、牛、肠中分离纯化得来,但其理化性质存 在局限性,如大肠杆菌最适反应温度为,在?条件下没有酶活力;牛小 肠在克隆和扩增中不易热失活等,促使研究者不断探索、发现新来源 的。。 鉴于海洋生物其独特的生活环境,海洋生物遥渐成为新型活性物质的珍贵材 料来源。本课题对海洋软体动物菲律宾蛤仔的进行分离纯化,优化分离 纯化工艺,并进一步研究其酶学性质。相关研究内容及结果如下: 菲悻宾蛤仔体内组织性差异研究表明,酶活性顺序由大到小依次为内脏 闭、鳃、斧足和外套膜。对菲律宾蛤仔内脏团活性的季节性差异研究表 明.四个季节中酶活性均较高,但以春节活性最高,夏季次之。 采用硫酸铵盐析沉淀、? 离子交换层析和 一凝胶过滤层析等步骤.从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到,提纯倍数 为,比活力达到 /。?显示为单一条带,亚基分子 量约为 。 菲律宾蛤仔最适反应温度约为,最适反应约为.,在?条 范围内 件下具有较高的酶活性.而且具有较高的耐受性,在娟 均具有较高的酶活性和稳定性。三【为底物.用法作图, 得到菲律宾蛤仔动力学参数为::./.‰。 曲。 / 金属离子对酶活性的影响研究表明.、、、对酶活力均 有不同程度的激活作用,其中.、对酶活力的激活作用最显著。口 和在低浓度时。对酶具有激活作用,随着在反应体系中浓度的增大,埘 酶又其有不同程度的抑制作用。此外,、一对也具有一定的抑制有机溶剂对 酶活性的影响研究表明。甲醇、乙醇和异丙醇对酶活力具有 很强的抑制作用,并且随着浓度的增加,抑制作用增大?当浓度达到%时’ %和.%。可见,有机溶剂的非极 实验组相对酶活力分别为.%、 性越大对的抑制作用越大 .对菲律宾蛤仔功能基团进行化学性修饰,发现组氨酸和二硫键是其必需 功能基团,而丝氨酸、赖氨酸、色氮酸和巯基不是其必需功能基团。 关键词:菲律宾蛤仔.碱性磷酸酶:分离纯化:酶挚生质 / 唱,, ’ ,? ? .厅 .? ,, : , ,? 缸/ ’“ “? 酏:墨 /,,“ / .. ”, , . ,.%,% %.%. 砷 ,, 帅:/? :目录第一章前言??一 碱性磷酸酶研究概述??.,.的结构研究?. .一 的催化机理研究. .的分离纯化研究 日的理化性质研究?.? 的功能基团研究. 的同工酶研究的检测方法研究..比色法??~ .荧光法?.. 发光法 .电化学法. 的应用研究一? 在基因工程中的应用一. .】. 在医学领域中的应用? ..在食品工业中的应用一. 菲律宾蛤仔研究概述??.. ? .菲律宾蛤仔的简介??.菲律宾蛤仔营养成分分析?... .菲律宾蛤仔酚氧化酶的提取? 菲律宾蛤仔金属硫蛋白的提取 菲律宾蛤仔多糖的提取? 立项依据 选题依据与背景情况?“? .课题研究的目的与意义一 第二章菲律宾蛤仔组织性差异与季节性差异研究.前言??一?. 实验材料??.. 实验仪器实验药品?一试剂配制?一 实验方法一‘?引酶活性测定 蛋白质浓度测定? . 菲律宾蛤仔组织性差异研究一 租酶液的制备 . 酶活性和蛋白质浓度测定??~ . 菲律宾蛤仔季节性差异研究..租酶液的制备?一 . .酶活性和蛋自质浓度测定实验结果 . 菲律宾蛤仔组织性差异??’菲律宾蛤仔季节性差异讨论 第三章菲律宾蛤仔内脏团的分离纯化??“ ,前” 实验材料二??’ .实验仪器实验药品“试剂配制 实验方法? .】酶活性测定??’ 蛋白质浓度测定 ..粗酶液的制各 硫酸铵盐析??一. 透析 离子交换层析?口 凝胶过滤层析 .. 纯度鉴定及其亚基分子量测定 . 制各分离胶和浓缩胶. .电泳??..染色、脱色 . 数据处理?. 实验结果??..一 . 硫酸铵盐析 透析.. .? ? 离子交换层析.凝胶过滤层析?.纯度鉴定及亚基分子量测定?.. 讨论第四章酶学性质研究前言 .实验材料.? 实验仪器??一 实验药品??一试剂配制. 实验方法. 最适反应温度??.. .温度稳定性研究. . 最适反应卜 稳定性研究?.. . 酶的动力学参数测定? .? 金属离子对酶活性的影响 .有机涪剂对酶括性的影响 实验结果?.??. . 最适反应温度.温度稳定性研究最适反应? 口稳定性研究” 的动力学参数测定?一金属离子对酶活性的影响 .,有机溶剂对酶活性的影响? 讨论第五章功能基团研究‘”.】前言??一 实验材料 .实验仪器 实验药品”?’ ..试剂配制实验方法“ 化学修饰剂对酶活力的影响 不同浓度化学修饰剂对的化学修饰作用??’? 实验结果?叫化学修饰剂对酶活力的影响??‘不同浓度化学修饰剂对的化学 修饰作用 . . ~对丝氨酸的修饰?“. 对赖氨酸的修饰. 对色氨酸的修饰 ..对组氮酸的修饰‘ . . 对二硫键的修饰. 对巯基的修饰?’一 讨论“ 全文总结?” 研究展望参考文献’ 致谢??‘菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的丹离纯化和性质研究 第一章前言 碱性磷酸酶研究概述 碱性磷酸酶 ,是』‘。泛分布在植物、动物和微生 物体内的一种重要调控酶,可催化各种磷酸基团的水解和转移反应【。在龟 类体 内,参与葡萄糖、脂类、无机磷及钙的吸收;在甲壳动物体内.参与 钙质的吸收、磷酸钙的形成及甲壳素的分泌【:在贝类体内,还与维待钙磷 比例及角蛋白的分泌直接相关,在贝壳形成过程中起到重要作用”。经过纯化 的 用途也十分广泛,常被应用于基因工程、医学、食品等领域。的结构研究 由于大肠杆菌撮易操作和获得.所以被作为一种研究的模 型,其结构和功能被广泛的研究‘“。年,首次研究了的晶体结 构,如图所示,是一个同型二聚体酶,每个单体由个氢基酸组成 并宙有一个活性中心,每个活性中心包含两个和一个。完整的 分子包括:中心个哳叠、上部个小的目折叠以及周围个不同长度的 ?.螺旋。此外.还研究了活性中心金属离子的结合配基。如图一所示, 与结合的配基分别为驯和凶的咪唑基氩原子,,的两个羧基氧 原子以及磷酸基团的一个氧原子:与“结合的配基分别为和的羧 基氧原子、,的咪唑基氮原予以及磷酸基团的一个氧原子;与结合的配 基分别为的第二个羧基氧原子、?的羟基、的一个羧基氧原予以 及三个水分子。 图卜 三维空间结构 一 ? 菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 图 活性中心另一个研究比较多的是人胎盘。研究者发现,人体内的同工 酶有四种.其中有三种是组织特异性,分别是:人胎盘、生殖 细胞。和肠,这三种具有%一%的同源性.它们 的基因位于同一个染色体上。第四种是非组织特异性的,存在于人 体的骨骼、肝脏和肾脏组织中,与其它三种的结构相此,具有大约%的 相似性.它的基因位于其它染色体上?。年.研究了的晶体结 构.如图所示,也是同源二聚体酶,每个单体由个氨基酸、个 金属离子、一个磷酸基团和个水分子组成【“。的表面可以分为个区 域:.末端?.螺旋、“ ”区域和金属结合区域。其中,“” 区域由两个亚基的各个氨基酸组成,并形成两个小的相互作用的晰叠。金 属结合区域由个氧基酸组成.并形成两个晰叠,日折叠的侧面有两个 螺旋。的每个单体具有两个二硫键,一个位于,另一个在附 近。与相比较,活性中心只有丝氨酸、个金属位点、和 及它们的配基相同,周围大部分氨基酸是不同的。此外,还比较了人体 内四种同工酶的结构,研究表明和结构晟相近,只有个氨 基酸发生了替换:和有个氨基酸发生了替换,约占总氨基酸的 %:和结构差异最大,有个氨基酸发生了替换。菲律宾蚺仔碱性磷酸酶的分离 纯化承性质研究 图一 三维空间结构 一 年,研究了北极虾的晶体结构,结果表明为× 同源二聚体酶,每个单体含有个氮基酸,其整体三雏体积为 川”。如图所示,每个单体由个.螺旋和个.折叠组成,形状类似 三明治:个晰叠处于中间位置,上面有个一螺旋,下面有个。一螺旋, 个折叠中有个为平行结构,一个为反平行结构。每个单体含有两个二硫 键,其中一个位于?和之间,另一个位于如和之间。在 聚体中,单体各自的.折叠形成延伸的.折叠,在口一折叠上部并且与.链柏 垂直,形成一个小的区域,该区域由个小的.链组成,与人胎盘的“ ”结构类似,如图.。与其它生物结构不同,的活性中心由 个一组成,、啦之问及啦、之间的距离都是.,、之间 的距离为 。与连接的配基分别为和埘&的殊唑基氪原子, 的羧基氧原子:与连接的配基有个.分别为和的羧基氧原于、 的昧唑基氨原子、的羟基氧原子:具有个配基.分别为 的第二个羧基氧原予、的咪唑基氮原子、的羟基基团、瑚及水分 子。律宾蛤仔碱性磷酸酶肋分离纯化和性质研究 ? 图三维空间结构 一 图? 黄色、红色和蓝色三维空间结构的叠合 ?一 ? 年,研究了南极细菌的晶体结构,如图所 示,也是二聚体酶,每个单体含有个氨基酸。二聚体的核心是 个平 行和反平行的一折叠,周围被螺旋所包围“。结构与其它结构域 大的不同是没有“”结构.取而代之的是两个比较长的环。活 性中心具有两个和一个,在活性中心以外,还有两个.这两个金 属离子具有结合底物及稳定构象的作用。与连接的氢基酸分别是小、 和啦与连接的氨基酸分别是、阳船和;与鼬连 接的氨:譬酸分别是、?、和个。此外.与、和菲挚宾蛤仔碱性磷酸酶的分离 纯化和性质研究 ???????????????、??????????????????’??????????????~ 不同,没有二硫键。 图一三维空间结构 ?卜 年,研究了北大西洋弧菌的晶体结构,如图一 所示,也是同源二聚体酶,每个单体含有个氨基酸,并含有两个一 。的‘: 和一个 ”结构区域较大.类似干和, 井具有一个短的反平行?折叠。与前面所述的四种结构不同,具有四 个特征片段:,?.?和.。每个活性中心含有两个 和一个,与连接的氨基酸分别是 、和?与 连接的氨基酸分别是、和吲与连接的氨基酸分别是 、、“和个。上述五种金属离子结盒配基组成总结见 表.。 图?三维空间结构】一? 菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 ? “ ,‰ ‰阻 , ,? 。 & :“删 ? ? , ?的催化机理研究 年,在两种大肠杆菌晶体结构的基础上。首次研究了的 催化机理吼在的理论中,活性中心的、和“原子直接参与底物的结合、 产物的释放以及亲核体的形成.但是没有指出原子在催化反应中的作用。之 后,年,在研究的基础之上.又进一步完善了催化机理聊。 如图所示.的催化反应可以分为四步,第一步:自由酶结合磷酸 单酯,形成米氏酶底物复合物?。在自由酶状态,个水分子 占据着活性位点,的羟基基团与连接在原子上的氢氧根之间形成氢键。菲律 兵蛤仔碱性磷酸船的分离纯化取性质研究 ~??????????~ 第二步:的。脱质子化.并进攻酶一底物复合物中的原子,同时释放。 基团,形成共价丝氨酸一磷酸中间体.与原予配位的氧氧根接受质子. 形成一个水分子。第三步:与配位的亲核氢氧根离子攻击原子.水解共价 丝氮酸一磷酸中间体?形成非共价酶?磷酸产物复台体?,并再生亲核‘。 第四步:与原子配位的水分子传递‘一个质子到亲核’ ,。?质子化,同 时释放磷酸根离子.晟后形成自由酶。当磷酸受体浓度较低时 /或 /缓冲液,测 定的是水解酶的活力;当磷酸受体浓度较高时 .或 缓冲液,测定的是转移酶活力和水解酶活力之和。在的酸性条件 下,磷酸丝氨酸共价复合物的水解是反应的限速步骤;在的碱性条件下. 非共价磷酸复合物的觯离是反应的限速步骤。 . 。 ?,麓‖ 口、 ‘.。 参??殳一参:西,“” 鑫? “? ?? ? “旷: 卜。 . ?. 专.拶 ? ~参。。爿” 父?“ 人’一 工一 』~。 七。 图?催化机理 ?菲律宾蛤仔碱性磷腌酶的分离纯化和性质研究 . 【的分离纯化研究 警令,国内外已有大量有关.分离纯化的研究报道,不同生物来源的 结构和性质不同.具体分离纯化工艺也有所不同。一般来说,的分离纯化 工艺为:正醇抽提、硫酸铵分级沉淀盐析或有机溶剂沉淀、纤维素离子 ’’体。”。经过以上四个步骤的处理?可以纯 交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析 化倍左右,得到电泳为单一鍪带的纯酶。 随着生物科学和材料科学的发展,新的葡聚糖凝胶和离子交换剂相继被开发 是 、霸 应用.如曲由次甲基双丙烯酰胺交联丙烯基葡聚糖制备而成的一种部分大网 孔型凝胶,具有 较高的硬度,分离速度快,分辨率高,化学稳定性也比传统葡聚糖凝胶高很 多。 .具有离子交换和分子筛的双重作用,对生物太分子有很高的分辨率, 与.纤维素相比较,具有更大的电荷密度和交换容量.其交换容量是离子 是具有更多交联键的新一代凝 交换纤维素的倍。. 肢.优点是化学、物理性能稳定,流速快四。随着这些凝胶在分离纯化中 的应用.纯化倍数也有了明显的提高,可达到.倍“。 近年来,亲和层析在生物丈分子的分离纯化中的作用,越来越受到研究者的 重视,亲和层析的应用也越来越普遍。亲和层析是一种利用生物分子之间的专一 性或特异性的亲和识别进行分离的拄术。这些亲和识别包括酶和底物.抗体和抗 原、激素和受体、染料和酶、凝集素和糖蛋白等之间的相互作用。起初.研究者 利用的抗体等天然配基来纯化,但是,费用比较昂贵,步骤比较繁 多。同时将配基连接在介质上.并使它们保持高生物活性也非常困难,而染料配 基可以消除这些缺陷。染料亲和层析的发现,应归功于东德莱比锡大学的 教授,他在~次偶然的试验中发现活性蓝染料 .可以吸附丙酮酸激酶,发现这个现象后,教授很快联想到 ?固定在琼脂糖介质上,便可以吸附并纯 如果将活性蓝染料 化激酶.于是诞生了染料亲和层析技术,随后,许多研究者叉研究了不同染料 和 蛋白质结合的情况,打开了染料亲和层析的应用之门【”。年,等 采用三嗪染料配基纯化牛小肠,纯化倍数为倍口?。年 的尾基苯环 等用羧基、硼酸基和磷酸基连接到恬性蓝染料非律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离化和性质研究 上,得到一系列活性蓝染料 ?的衍生物,用这些衍生物作为 配基纯』七牛小肠,发现,与苄基磷酸连接到尾基苯环』删,对的纯化 效果虽好,一步纯化倍数为倍”。年.杨青等合成了一种含有碱 性磷酸酶抑制剂一对氮基苄基磷酸的化学配基,并将其偶联判琼脂耱凝胶上,用 以纯化牛小肠。结果显示,仅亲和层析步,纯化倍数即可达到倍, 活力回收率达%以上‘”。年,王静云等又合成了一种含有碱性磷酸酶抑 制剂对氩基苯磷酸的染料配基.将其偶联到琼脂精凝腔上,分离纯化牛小肠 ,一步纯化倍数达到倍,活力回收率为%”。然而.亲和层析比常规 的层析方法成本高,因此在实验及生产应用中,要综合考虑目标产品的价值和生 产成本,选择合适的分离纯化方法。的理化性质研究 随着不同物种的分离纯化,它们的理化性质也得到了广泛的研究。 理化性质的研究内容主要包括:酶昂适反应温度、最适反应、温度和稳 定性、米氏常数。、抑制荆、激活剂、金属离子和有机溶剂对酶活力的影响 等。 研究结果表明.不同物种的,其理化性质相差很大。其中陈定福等对南方 鲇的理化性质研究表明,该酶展适反应温度为,最适反应为, 以磷酸苯二钠为底物,其‰值为 ×/,?、对酶有激活作用, 、、、和对酶有抑制作用”“。陈清西等对锯缘 青蟹的理化性质研究表明,酶最适反应温度为,晟适反应口为., 以对硝基苯磷酸二钠为底物,米氏常数如值为 。/,对酶有 显著的激活作用,、抖以及有机溶剂甲醇、乙醇、乙二醇对酶有不同程度 的抑制作用”。李兴暖等对长牡蛎的理化性质研究表明.其最适反应温度 为?,最适反应为 ,以对硝基苯磷酸二钠为底物,米氏常数岛值为 .对该酶有明显的激括作用,、斗、对该酶有明 显的抑制作用【。谢丽薄等对合浦珠母贝理化性质研究结果表明,最适反 应温度为。壤适反应值为 ,硝基苯磷酸二钠为底物,米氏常数 ‰值为 /,‰。值为 /。产物类似物。、。对该 酶有明显的抑制作用.抑制类型为竞争性抑制。金属离子对该酶的催化活力 有不 同的影响,其中正一价金属离子对该酶活性无影响,十对该酶有明显的抑制 作菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 用,斗、”、》对发酶有激活作用”。 近年来,研究者发现了有些生物体内的耐热性非常强,最适反应温度 为..,超嗜热古菌摄适反应温度甚至达到口“。等对酒曲 菌属细胞内和细胞外的理化性质进行了研究,它们的分子量分跏为 和,最适反应温度都是.虽适反应都是.。嘲酶在条件 下处理仍非常稳定。以.硝基苯磷酸为反应底物.朱氏常数矗,值分别为 .和 /,、和剐两种都具有激活作用.而” 和只对细胞外具有激括作用”“。等研究了一种新的栖热菌属 ,并从中分离纯化出了耐热,理化性质研究表明.该酶是由两个 的亚基组成, 最适反应温度是?,最适反应是 . .酶的催化活性依赖于金属离子,其中,十,和是主要的激 活剂,而激活作用最显著,并且在高温条件下具有独特的激活作用【”】。 等报道了一种超嗜热古菌耐热.研究结果表明, 。该 其分子量约为 ,最适反应温度在以上。晟适反应约为 酶的抗热能力非常强,在条件下处理.仍具有%的酶活力,在 条件下处理 仍具有%的酶活力,此外 对于该酶的稳定性和酶活性 都有增强的作用“。 目前,开发应用的一主要是从大肠杆菌和牛小肠中分离纯化得来,但它 们和耐热.理化性质相似,即都具有较高的抗热能力,而这也正足其开发应 用的局限性:如低温下酶活性低,克隆和扩增中不易热失活【坤等,促使 研究者不断探索、发现新来源的。现在,广大研究者己经从嗜冷生物体内 分离纯化出低温,这些在低温条件下就具有较高的酶活力. 而且容易在高温条件下热失活,选在克隆和扩增中具有广阔的应用前景。 等从一种南极细菌体内提取的.其最适反应温度为, 最适反应为.。分子量约为. ?。等从大西洋沿海筛选出 了一种海洋弧菌,它能产生一种热不稳定的,该酶是约为?的单体 酶,展适反应是 ,?时的半衰期是,?时的半衰期是? 蛀后,部分物种的理化性质总结见表?。菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和 性质研究 表部分物种的理化性质 ???竺兰竺竺:竺竺竺竺竺竺塑 海洋弧苗? 仉 、磷酸盐 酒曲菌属’栖热茁属州 超嗜热占菌 双峰驼吲 】 、苯丙氧 酸 链孢霉属四 钒酸盐、磷酸盐 】 镊缘青蟹 北 . ”、‘ 牡蛎” % “、“、『“ 鲍鱼四 四 ”、”、“ 黄鲒肝脏? 家蚕 ;呈 鸭肝删 帅 】. “ 南方鲇圳 九 、 合浦珠母贝 . “、矿、“ 背角无齿蚌【州 、疏基乙 ” 醇、 菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究的功能基团研究 探明酶活性中心功能基团的性质.对于进一步研究酶的结构和功能的关系, 以及酶的催化作用机理有重要的参考价值。而应用化学修饰法研究酶活性中心功 能肇团,是一种简单而又行之有效的方法。目前,已对多个物种的活性中 心功能基团进行了研究刊。其中,张洪渊等研究了背角无齿蚌的功能基 圃,采用、、、、、、和等化学修饰 剂选择吐修饰各种氢基酸残基,并测定酶活力变化。结果表明,酶活性随 作用时间的延长而下降,在修饰后,酶活性下降一半,后完 全失活.并且失活过程为一级反应.由此推断丝氨酸是酶活性中心必需功能基团 此外.赖氨酸、色氨酸和部分二硫键电被认为是酶活性中心必需功能基团【舶】。 与张洪渊的研究结果相同,研究者对于白蜡虫和黄鳝内脏活性中心功能基 团的研究结果也表明,赖氨酸、色氨酸和部分二硫键是酶活性中心必需功能基团 。部分物种活性中心的功能基团总结见表?,从表中可以看出赖氨酸、 丝氨酸、色氨酸和二硫键在大多数物种中都是必需功能基团。具有较高的保 守性。 表.部分物种活性中心的功能基团’ 物种 必需功能基团 背角无齿蚌 、、和部分二硫键 白蜡虫“ 、、和部分二硫键 瘦肉型猪】 、、和巯基 黄鳝叫 、、和部分二硫键 、、和部分二硫键 日本沼虾哪 长毛对虾川 、、 家蚕目 、、巯基和二硫键 中华蜜蜂工蜂口 、和部分二硫键 僧帽牡蛎 、和都分二硫键菲律宾蛤仔碱性磷酸酶匀分离纯化和性质研究的 同工酶研究 同工酶是指催化梢同的化学反应.但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性 能等方面都存在刚显差异的一组酶。同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、 杂交育种、个体发育、组织分化和疾病诊断等。其中研究比较多的同工酶是 人同工酶。研究者发现,人体内的同工酶有四种.分别是:人胎盘 、生殖细胞、肠和非组织特异性。 前三种是组织特异性,这三种其有%.%的同源性,它们的 基因在同一个染色体上。第四种州是非组织特异性的,存在于人体的 骨骼、肝脏和肾脏等组织中,与其它三种的结构相比。具有大约%的相 似性,而且,它的基因位于其它染色体上【. 。目前,人同工酶在医学上 的研究进展迅速,作为许多疾病的标志物正在为人们所认识,如对肝胆消化 疾病、 骨骼疾病、肾脏疾病和恶性肿瘤方面的研究。正常人血液中存在一定量的肝 脏 同工酶,当肝脏受到损害时,同工酶升高水平与其严重程度有正比例 关系。同时,肝细胞受到损害时还会出现一种高分子量型的,它属于肝脏 同工酶的一种,在胆汁淤积时高分子量型明显增高,它的分子量比较大, 含有肝细胞膜成份,而且还与脂蛋白复合物有关.因此可以作为肝细胞膜遭 受损 害的指标”“。正常入血清中存在一定量的骨骼.并且随年龄变化很大.年 龄越小,哥骼含量越高,常是成年人的数倍。临床上常用于骨疾病和癌的 骨转移诊断以及恶性骨肿瘤病人的术后随访观察.并收到了良好的效果。 小肠型存在于小肠粘膜上皮细胞内,多种肠道疾病可引起血中小肠型 明显升高,如,泛的急性小肠梗阻、粘膜损伤、坏死性肠炎等。但是,正 常、血型的人群血循环中也可以存在少量的小肠型,高乳高脂类的饮食 也可以引起其它血型人群血中腑型增高。 碱性磷酸酶同工酶作为肿瘤的一个标志也逐渐为人们所认识。有研究报道 在肝转移癌病例中出现频率很高,比一谷氨酰转酞酶的敏感性更高,有 时总仍在正常范围阿,而 ?却明显增高,因此.如果不作同工酶分 析,就不能发现 ?水平增高【“。许多研究者发现胎盘型与恶性肿瘤 关系密切。胎盘型的主要特点是耐热性很强.主要存在于胎盘脉络膜绒毛 上皮细胞内,它主要见于妊娠木期的妇女血清中,而正常非妊娠人群不存在胎盘菲律寅蛤仔碱性磷酸雕的分离纯化和性质研究 型。恶性肿瘤患者血清出现的耐热性与胎盘型很相似,称为变异 性胎盘型。这种热稳定性强的常出现在卵巢癌、肺癌、膀胱痛、子富 癌及结肠癌等病人中。的检测方法研究 由于底物特异性比较差.因此。用于检测酶活性的底物有很多, 比如磷酸苯二钠、对硝基皋磷酸、磷酸苯酚、葡萄糖.一磷酸、甘油磷酸钠等。 比较常用的检测方法有比色法、荧光法、发光法、电化学法.现就这几种检测方 法简述如下: 比色法 在比色法当中,使用较多的两种底物是对硝基苯磷酸二钠和磷酸苯二钠,它 们在的作用下.水解为酚和磷酸,通过在不同波长处检测酚的生成量,测 定酶活力高低。其中,以对硝基苯磷酸二钠为底物的方法中,酶和底物反应之后. 用氢氧化钠终止反应,然后在处比色,进一步计算酶活力;而以磷酸苯 二钠为底物的方法又叫金氏法,酶和底物反应之后.用铁氰化钾终止反应,然 后 在处比色,进一步计算酶活力。 荧光法 等开发出了一种荧光法测定酶活性,该方法以商业 为底物,其测定的原理为:以非荧光的芳香单磷酸酯为底物,在的作用下. 水解产生一种高荧光产物。在?条件下, 内荧光测定活性四。与 比色法相比.荧光法其有灵敏度高、选择性强、用样少等优点。 .发光法 该方法的原理为通过测定承解产物的光激活度来测定酶活性。其发光 物质为,二氧环己烷衍生物 ,它是生物化学领域中一 种晟新的超灵敏的底物,它的特点是反应速度快,能够在很短的时问内提 供正确可靠的结果。等采用此方法对不同种类的乳品进行了联合测定,并 对发光法进行了评价,结果显示此方法检测限大约为/,可以有效的应用 于巴氏杀菌乳酶活性的测定吲。 ..电化学法 等使用石墨一聚四氟乙烯树脂混合的酪氢酸酶生物传感器快速测定菲律宾 蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研宄 活性。它的原理是:水解底物磷酸苯酯,产生苯酚,苯酚被酪氨酸酶氧化 生成苯醌苯醌移动至电极表面又被还原成邻苯二酚,酪氨酸酶将邻苯二酚氧 化 生成苯醌。于是,在酪氨酸酶底物与电活性产物之间产生循环,使反应放大, 从 而可以更加灵敏的检测括性。该方法与比色洼相比不需要孵育的步骤, 而且操作简单、快速。的应用研究‘ .在基因工程中的应用 基因工程中常用的有大肠杆菌、牛小肠和北 极虾三种。它们的主要用途为催化单链或双链和 ,端磷 酸残基的去除,形成羟基端。而’羟基端可以作为多核苷酸激酶催化的放射 性标记反应底物州。此外,、和还有另外两种用途:去除 片段’端磷酸残基,以防止自身连接。这种去磷酸反应主要用于抑制载体分子的 自身连接,从而减少克隆过程中“空心”克隆产生的数目;其次可以作为非放射 性系统中的报道酶,以检测、定位核酸和蛋刍。在医学领域中的应用 在现代医学领域中,的应用主要体现在以下两个方面: 一方面在医学常规的临床检测中,血清活性的检测是一种重要的指标, 它可以为肝、骨骼和癌症等方面的疾病提供丰富的医学信息。所有形式的胆汁郁 积都可以显著增加酶话性;~些骨骼疾病如佩吉特氏病、骨软化症、骨折 和佝偻病也可以引起酶活性升高:此外,血清酶活性的升高也会暗示 恶性肿瘤的发生,如肺癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌和结肠癌等“州。 另一方面作为酶免疫分析最常用的标记酶之一,已被广泛的 应用在免疫分析中‘“旬。年,等通过检测胎盘的含量.辅助治 疗睾丸精原细胞瘤州:年,等在大肠杆菌体内表达重组,免疫 检测人,检测限达/级别,已达到世界卫生组织的规定删。 年,等以作为标记酶,免疫分析人绒毛膜促性腺激素、生长激素、 雌二醇和船儿球蛋白,检测限分别为./、/、 /和 ./【“。年,等以抗坏血酸一磷酸为底物,采用流动注射分 析系统,免疫分析人绒毛膜促性腺激素.检测限为. /次。人绒毛膜促性腺菲 律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 激素是一种糖蛋白.产生于胎擞和恶性肿瘤,可用于诊断阡孕和绒毛膜癌等 忡。 鉴于具有相对分子量小、灵敏度高、稳定性好和价格低廉等优点,其 已被广泛的应用。此外。的底物选择性低,许多底物都可以与其进行反应, 从而产生了底物不同的众多榆测方法,如苯基磷酸‘”、蔡基磷酸、二茂铁 氨基苯磷酸衍生物四和吲哚磷酸衍生物‘训、氪基苯磷酸’埘、轻基萘基一. 磷酸”等.均己被研究应用于标记的免疫分析中。 .在食品工业中的应用 在乳制品工业中,巴氏杀菌后检测的含量。是一种重要的卫生安全指 标。是乳中天然存在的一种酶,它的温度稳定性比乳中存在的瘴原菌略高. 因此,巴氏杀菌后若显阴性.则说明乳中的致病微生物均已被杀死;如果 巴氏杀菌后显阳性,则说明巴氏杀菌不彻底‘”州。 菲律宾蛤仔研究概述 菲律宾蛤仔的简介 菲律宾蛤仔俗称蛤蜊、蚬子,盔生物学分类系统中,隶属于软体动物门、瓣 鳃纲、帘形曰、帘蛤科、蛤仔属。拉丁学名或 其生产速度快、肉 。菲律宾蛤仔广泛分布在我国南北各海区. 质鲜美,相对其它海珍品具有价格低廉、资潍丰富和养殖产量高等特点。 菲律宾蛤仔营养成分分析 年,李晓英等研究了菲律宾蛤仔的营养成分,研究表明水分、灰分、 %、 %、 %和 粗蛋白、粗脂肪和碳水化合物含量分别为%、 .。其获分和粗蛋白含量均高于褐石玛瑙螺、西施舌及马氏珠母贝的含量?。 菲律宾蛤仔贝内中含有种氨基酸,其中含有人体所需的全部种必需氨基酸 和种半必需氨基酸。种氮基酸当中,谷氨酸的含量最高.在菲律宾蛤仔中 高选 /。菲律宾蛤仔第一限制氨基酸为缬氨酸,第二限制氨基酸为苯丙 氨酸十酪氨酸。菲律宾蛤仔贝肉总氪基酸含量为 贝阿必需氨基酸占 总氨基酸的比例为.%,远高于推荐的模式 %。而跟据 /标准,蛋白质比较理想的必需氨基酸占总氨基酸的比例为%左右,非必非律 宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化平?性质研究 颈氨基酸占总氨摹酸的比例为在%以上,这说明菲律寅蛤仔是一种理想的蛋 白 源。 菲律宾蛤仔酚氧化酶的提取 石莹等从菲律宾始仔血淋巴中分离纯化出了酚氧化酶,研究表明,酚氧化酶 原的分子量为 左右.在实验过程中易发生降解或自身降解,变成有活 性的酚氧化酶,分子量大小约 圳。酚氧化鞲是无脊椎动物体液免疫系统 中的主要成员之一.在免疫防御巾起着作常重要的作用。已往的研究表明,酚氧 化酶原激活系统在无脊椎动物中起着重要的异物识别和防御功能。一般情况下, 酚氧化酶在生物体内以酚氧化酶原的形式存在。当有外来物入侵时,外来物按一 定顺序最终撤括没有活性的酚氧化酶原而成为有活性的酚氧化酶,进一步诱导有 关底物由酚变成醌.最终产生黑色素,沉积到外来物上,黑色素通过包被和黑化 将外来物隔离和茉死,从而达到免疫的效果。有研究报道,黑色素及其代谢中间 产物还可以抑制病原菌胞外蛋自质和几丁质酶的活性,从而杀死微生物和寄生 虫.起到免疫防御作用。 菲律宾蛤仔金属硫蛋白的提取 金属硫蛋白是生物体内的一种金属结台蛋白,当生物体吸收金属离子时.可 诱导金属硫蛋白的产生,因此,金属硫蛋白可作为水环境重金属污染评估的生物 标志物。而菲律宾蛤仔由于自身用于代谢的混合氧化系统存在缺陷.因此在 其生命活动过程中,体内污染物的释放速率大大低于鱼娄和甲壳类,使得海水中 重金属离子容易在菲律宾蛤仔体内富集,并诱导产生大量的金属硫蛋白.因而菲 律宾蛤仔可作为金属硫蛋白的重要生物来源”。 菲律宾蛤仔多糖的提取 王娅楠等从菲律宾蛤仔体内提取出糖胺聚糖,采用法和动物移植性肿 瘤模型检测体内、体外抗肿瘤活性,测量正常小鼠和免疫抑制小鼠的胸腺指数, 脾指数和碳粒廓清指数。结果表明,菲律宾蛤仔糖胺聚糖可以抑制体外培养的人 肝癌 肿瘤细胞的生长,同时显著抑制移植性 肉瘤的生长.对环磷 酰胺造成的小鼠胸腺和脾赃萎缩有抵抗和修复作用『删。此外,范秀萍等研究了 菲律宾始仔耱瞎聚糖的免疫活性,结袋表胡,糖胺聚糖具有增强小鼠免疫菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质聊究 ????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????一一 功能的作用【“。张莉等从菲律宾蛤仔体内分离提取了蛋白聚糖和?并 通过体内实验研究蛋白聚精的抗肿瘤活性和对荷瘤小鼠免疫助能的影响结 果显 %,对人 示,在/浓度时对人肝癌细胞的生长抑制率为 肝癌细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性。在/浓度下.抑制效果与 的年日当“。 立项依据 选题依据与背景情况 是生物体内一种重要的调控酶,可催化各种磷酸基团的水解和转移反 应?。在生物体内,广泛参与葡萄糖、脂类、无机磷及钙的吸收【,维持适 当的钙磷比例,并在贝壳形成过程中起到重要作用在医学常规的临床检测中 血清活性的检测是一种重要的指标,它可以为肝、哥骼和癌症等方面的疾 病提供丰富的医学信息。在乳制品工业中,巴氏杀菌后检测的含量,是一 种重要的卫生安全指标。纯化后的碱性磷酸酶是酶免疫分析最常用的标 记酶之一.。此外,在基因工程领域,常被用作催化单链或双链 和 ,端磷酸残基的去除,形成’羟基端,而’羟基端可以作为多核苷酸激 还可以作为非放射性系统中的报道酶, 酶催化的放射性标记反应底物 以检测、定位核酸和蛋白【“。可见,具有巨大的研究开发价值。 目前.国内外学者对进行了广泛的研究。包括不同物种的结构、 催化反应机理、理化性质、分离纯化,功能基团、检测方法等。但是,这些物 种 多来源于陆地生物,针对海洋生物作为材料来源的研究还较少。海洋生物 由于其独特的生活环境,在生长和代谢过程中产生并积累了大量结构新、活性强 的次生代谢产物,与陆地上的生物不同,这些次生代谢产物在生物功能方面有许 多独到之处,一直受到国内外研究者的密切关注。最近几十年,研究者已经从海 洋生物体内分离出数万种新型化合物,包括蛋白质类、多糖类、生物碱类、萜类、 大环聚酯类、多肚类等瑚。其中很多化合物具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤、免 疫调节、抗病毒及治疗糖尿病等作用。由于我国海域辽阔,海洋生物资源丰富 与其它国家相比我们具有得天独厚的优势,因此海洋资源的开发是未来我国经济 和社会发展的必然趋势。 菲律宾蛤仔是我国一种重要的海洋经济贝类,广泛分布在我国南北海区。菲菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 律宾蛤仔肉蛋自质含量高.脂肪含量低,而且富含维生素和各种微量元素,是很 好的海洋生物功能食品。近几年国内外学者已从菲律宾蛤仔体内分离纯化出 多种 重要的生物活性物质,如氨基多糖、蛋白聚船、多不饱和脂肪酸、酚氧化酶 等。 但未有关菲律宾蛤仔分离纯化的研究报道,我们的前期实验结果表明. 菲律宾蛤仔体内具有较高的酶活性.鉴于此,我们开展了本课题的研究工作。 课题研究的目的与意义 现在应用的主要是从大肠杆菌、牛小肠中分离纯化得来.但其理化性 质存在局限性.如大肠杆菌的最适反应温度为,在条件下没有酶 活力【?;牛小肠在克陛和扩增中不易热失活”等,促使研究者不断 探索、发现新来源的。本课题旨在对菲律亮蛤仔酌进行分离纯化,并 研究其酶学性质,以期从海洋生物中开发低温条件下具有较高酶活性的新型 ,优化分离纯化工艺,为其在基因工程和医学等领域中的应用提供科 学依据,也为海洋生物的高值化开发利用开辟新的途径,具有较大的研究价 值。菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 第二章菲律宾蛤仔组织性差异与季节性差异研究 前言 本章以鲜活菲律宾蛤仔为材料。从其内脏团、外套膜、斧足和腮四个组织中 分别制备粗酶液,并对比四种组织中酶活性大小:选取上述四种组织中酶 活性最大的组织.进一步研究菲律宾蛤仆酶活性的季节性差异,月份分别 选择月份、月份、月份和月份。 实验材料 .实验仪器 生产单位 仪器名称 北京长安科学仪器厂 电热恒温水浴锅 电子分析天平 上海精科天平仪器厂 磁力搅拌器 上海驻荣生化仪嚣厂 高速组织捣碎机 上海标本模型厂 计 上海精密科学仪器有限公司 安徽中科中佳科学仪器有限公司 高速冷冻离心机 上海沪西分析仪器厂有限公司 电脑恒温层析柜 分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司 . 实验药品 药品名称 生产单位 公司 公司 对硝基苯磷酸二钠 考马斯亮蓝 公司 牛血清清蛋白 公司 ‘ 天律市广成化学试剂有限公司 氢氧化钠 氯化钠 天律市广成化学试剂有限公司 %乙醇 天津市广成化学试剂有限公司 浓盐酸 莱阳市康德化工有限公司 %磷酸 菜阳市康德化工有限公司非律竞蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化审性厦 研北 . 试剂配制 .,古 ./?缓冲液 /:称取. ,溶解于三燕水中,加入. /龄酸,晟后定 容至,取放于?冰箱中预冷。 /:称取 ,溶于三蒸水中.待完全溶解后, 定容至,存放于冰箱中,日内使用。 %乙醇中, .考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝一溶于 加入 %磷酸,用去离子水稀释至,滤纸过滤。 . 标准蛋白质溶液:称取/ 牛血清清蛋白,溶于 溶液中,配制成/标准蛋白质溶液。 实验方法 】酶插性测定 参考文献叽并略有改动:取缓冲液.于试管中。加入. , ,?水浴,加入酶液,后加入/终止 / 反应。对照组先加入 .再加入 酶液。最后用分光光度 计测定处的吸光度。一个酶活力单位定义为:在此反应条件下,每毫升 溶液每分钟催化底物水解,产生 产物所需的酶量。比活力的定义为:每 毫克酶蛋白所具有的活力单位数。产物的摩尔消光系数按“ 计算【吼。 . 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝染色法凹,以牛血清清蛋白作为标准蛋 白。其原理是利用蛋白质染料结合的特性,定量测定微量蛋白质浓度,可以测 定?/的蛋白质。考马斯亮蓝具有红色和蓝色两种颜色形式,其 与蛋白质通过范德华力相互结台.在一定蛋白质浓度范围内.蛋白质与染料 的结 合符合比尔定律。此染料与蛋白质结台后颜色由红色转变为蓝色.摄大光吸收波 长由变为,通过测定处光吸收的增加量可知与其结合蛋白 质的量。首先标准曲线的绘制:取支试管,分组按表平行操作。菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和眭质研究 表一蛋白质浓度标准曲线 . 试管编号一. /标准蛋白溶液/,/ 考马斯亮蓝试女/ 各试剂混匀后,以号管为空白对照,在处比色。以?为纵坐 标,标准蛋白质含量为横坐标,绘制标准曲线。粗酶液蛋白质浓度的测定方法同 上,根据所测定的枷.在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量从而计 算出未知样品中的蛋白质浓度/。标准曲线公式为:菲律宾蛤仔组织性差异研究 . 粗酶液的制各 冰浴条件下.分别取菲律宾蛤仔的内脏团、外套膜、斧足和腮,称重,按 / .含 :的比例加入预冷的. 缓冲液 ,匀浆,放入?冰箱中浸提。然后.?条件下,/离心, 收集清.即为粗酶液。 . 酶活性和蛋白质浓度测定 取四种组织粗酶液,分别检测活性大小。 . 菲律宾蛤仔季节性差异研究 . 粗酶液的制备 方法参见. ,但只取上述四种组织中活性最大的组织 . 酶活性和蛋白质浓度测定 分别于月份、月份、月份和月份检测活性大小 实验结果 . 菲律宾蛤仔组织性差异 研究结果如图所示,四种组织中.话性顺序由大到小依次为内脏团、 鳃、斧足和外套膜。若咀内脏团中活性大小作为%,?鳃中活性菲律宾蜡仔碱 性磷酸酶的分离纯化和性质研究 ????????????????????~ 大小为.%斧足中活性大小为 %,外套膜活性大小?五 %。 囊~舯驰犍 削菲律宾蛤仔组织性差异 。 ? 胁伽? 菲律宾蛤仔季节性差异 根据以上研究结果,选取四种组织中酶活性最大的内脏团作为材料来源,并 研究季节性差异?结果见图.,月份活性展大,、、和月 份的活性大小依次遵减。若以月份酶活性为%.、和 月 份的相对酶活性分别为 %、 %和.%。 .? 蜒弓 嚣 图菲律宾蛤仔季节性差异 融。也 ;?口 ”非律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 讨论 根据本实验结果分析可知.菲律宾蛤仔中酶活性顺序由大到小依次为 内脏团、鳃、斧足和外套膜,内脏团酶活性是其它三种组织中酶活性 的.倍。内脏团是菲律宾蛤仔消化道和其他内脏器官集中的地方.机体内营 养物质的消化、吸收、转运等新陈代谢过程部在内脏团中进行。前人的研究 表明, 广泛参与葡萄糖、脂类、无机磷及钙的吸收.以及甲壳素和角蛋白的分泌? 维持生物体内适当的钙磷比例等生理功能。可见,菲律宾蛤仔酶活性的这 种组织性差异是与的生理功能相适应的结果。组织性差异结果.为我 们下一步的分离纯化提供了重要的参考:在整个分离纯化过程的初期阶段, 增加一个预处理的步骤,即在制备组织匀浆液之前,事先将活性较低的部 分组织去除掉,只选用菲律宾蛤仔内脏团进行接下来的分离纯化,如此可大大简 化实验过程。 对于菲律宾蛤仔内脏团活性的季节性差异,研究表明.四个季节中酶 活性均较高.但以春节活性最高,夏季次之.这说明.在春季和夏季 在菲律宾蛤仔体内得到了大量合成。春季和夏季是菲律宾蛤仔快速生长和发育的 时期,机体新陈代谢旺盛,而作为一种重要的调控酶,广泛参与的各 种生理反应,的大量合成也是菲律宾蛤仔适应环境以及生长发育的需要。 但在菲律宾蛤仔体内具体的表达及调节机理,仍有待进一步研究。菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究 第三章菲律宾蛤仔内脏团的分离纯化 前言 本章以菲律宾蛤仔内脏团为材料,采用硫酸铰盐析沉淀、. 一凝胶过滤层析等方法,对菲律宾蛤仔内 离子交换层析和 脏团进行分离纯化,并探索最佳分离纯化工艺。纯化后的,采用 .鉴定纯化效果。 实验材料 实验仪器 仪器名称 生产单位 分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司 电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂 磁力搅拌器 上海亚荣生化仪器厂 高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司 咄计 上海精密科学仪器有限公司 电脑恒温层析柜 上海沪西分析仪器厂有限公司 高速组织捣碎机 上海标本模型厂 分部收集嚣 上海沪西分析仪器厂有限公司 紫外检测仪 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 梯度混合仪 恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司 冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司 双垂直电泳仪 北京市六一仪器厂 实验药品 药品名称 生产单位公司 对硝基苯磷酸二钠蛳公司 公司 毓基乙醇公司