【doc】急性重复性缺氧小鼠脑组织中儿茶酚胺类神经递质含量变化的…

【doc】急性重复性缺氧小鼠脑组织中儿茶酚胺类神经递质含量变化的… 急性重复性缺氧小鼠脑组织中儿茶酚胺类 神经递质含量变化的… l一 1995 第16卷第3期 廖袈{躬缸按争;中弘遁镌芩畦 首都医学院 JournalofCapitalInstituteofMedicine Vo1.16No.3 1995 急性重复性缺氧小鼠脑组织中 儿茶酚胺类神经递质含量变化的研究 ,K7o2,(,) 首都医学院生化教研室:!!兰潘颖李爱华 提要阳高教液相一电化学检测器测定急性重复性缺氧小鼠脑组织中DOPA,DA,NE和Ep等儿茶酚胺 类物质的含量.结果发现:与空白对照组(A组)比较.缺氧1次的实验对照组(B组)及急性重复缺氧4次实验 组(c组).随缺氧次敦增加,小鼠脑组织中的DA含量显着上升<0.o1).NE,DOPA 含量明显降低(P< 0.05或<0.01)}A组与急性重复4次缺氧后饲养2d的实验对照组(D组)小鼠脑组织中儿茶酚胺类含量接 近,没有统计学意义(P一23.77).结果提示脑组织中儿茶酚胺类物质可能参与急性重复缺氧小鼠的耐缺氧能 力的形成.而且是一个可逆的快反应. 关键调:重复缺氧}儿茶酚胺类高教蔽相色谱分析 分类号:R593.2 儿茶酚胺类物质是神经系统中的一类重 要的神经递质,它的含量变化与神经系统的 功能状态密切相关,与多种病理状态有密切 联系但是,至今有关急性重复性缺氧对儿茶 酚胺类神经递质含量影响的报道不多".本 实验选择急性重复性脑缺氧小鼠作为动物模 型n,研究在急性重复性缺氧情况下脑组织 中儿茶酚胺类神经递质含量的变化,缺氧次 数与儿茶酚胺类神经递质含量的关系.通过 这些实验"期了解急性重复性缺氧对动物的 儿荣酚胺类神经递质影响的规律,为进一步 全面阐明急性重复性缺氧所致的耐缺氧机制 提供实验依据. 1与方法 1.1实验动物 随机选择18g左右的昆明小鼠,雌雄不 限. 1.2仪器和试剂 Waters600E高效液相色谱仪,Waters 460电化学检测器(Waters,美国),C色谱 柱(天津试剂二厂). 主要品及试剂:3.4-二羟基苯丙氨 酸(DOPA),去甲肾上腺素(NE),肾上腺素 (Ep),多巴胺(DA),5-羟吲哚乙酸(5一 HIAA),3,4-二羟基苯胺(DHBA),以上试剂 均为Sigma公司产品.辛烷基磺酸钠(B.8) 离子对试剂(G.R天津化学试剂二厂),乙酸 钠(A.R北京化工厂),柠檬酸(A.R沈阳市 试剂一厂). 0.1mol/L柠檬酸一乙酸钠缓冲液流动 相:21.0g柠檬酸,8.2g乙酸钠,372mg乙 二胺四己酸二钠,4.0mLB.8离子对试剂, 溶于900mL的重蒸馏水中,用0.imol/L NaOH或磷酸调pH至3.7O,定容至1L,经 0.45m的滤膜过滤,滤液与甲醇按9:I混 匀待用,使用前需超声脱气. 1-3实验方法 13.1建立动物模型口将体重18g左右 的小鼠随机分为4组,以正常未经缺氧的动 物为空白对照组(A组),缺氧1次者为实验 对照组(B组),急性重复4次缺氧者为实验 组(c组),重复4次缺氧后再饲养2d为实 验对照组(D组). 1.3.2儿茶酚胺类神经递质含量的测定 1)组织样品的制备上述各组动物均 于实验后立即断头,1mill内取出全脑(置液 ?l85? 氯冷冻.可贮存,测定前将组织融化).称重, 置于预冷的0.1mol/L高氯酸溶液,冰浴中 匀浆lmin.匀浆后4?1.5万r/rain,离心 30min,取上清液进样. 2)JL茶酚胺类神经递质含量的测定0] 色谱条件:YWG—CI.H(9,llm)的色谱 柱,150mm×3.9mmID.流量:1.0mL/ min.电化学检测器输出电流为1nA,工作电 压750mV.流动相:0.1moI/L柠檬酸一乙酸 钠缓冲液(pH3.7). 3)回收率,精密度回收率:以内标法定 量,内加法测定相对回收率,取已测定浓度的 5个脑组织匀浆(正常小鼠的)离心上清藏. 加入定量的标准液,混匀进样,计算即得回收 百分率. 精密度:同一个样品ld内多次进样测 定,测得批内变异系数;同一样品在数天内进 行数次测定.得到批间变异系数. 2结果 2.1小鼠耐缺氧时间 随着耐缺氧次数的增加,实验组小鼠的 耐缺氧时间显着地增加.缺氧l,2,3,4次(各 组n=30)的耐缺氧时间分别为(1.83士 2.46),(28.7l士5.20),(46.56士6.60), (61.2l士7.10)min.经统计学处理,各实验 组小鼠耐缺氧时间比较都有显着性或极显着 的差异(P<0.05或P<0.01).这结果与有 关文献报道一致.". 2.2儿茶酚胺类神经递质含量的测定 1)鼠脑样品中儿茶酚胺类神经递质经 HPLC—ECD测定实验动物共1J8只.其中 A组30只,B组28只,C组29只,D组31 只,测定结果见附图. 2)儿茶酚胺类神经递质的标准曲线各 标准品浓度在o.2,1.ong的范国内,选取5 个不同浓度点重复3次进样进行检测,发现 在这一浓度范围内检测器的响应(峰面积)与 浓度有良好的线性关系,各标准物的回归和 相关系数r分别为; NE:;一0.248+2.322,r一0.998 Ep:一0.178+2.860,r=0.999 DOPA:一0.160+L333,T-=0.997 DAi;0.059+0.830,r=O.999 为待测峰与内标DHBA峰面积的比 值,Y为质量(ng). 3. 2. 捌 2. 1. 1. usl?ls2? t/mln 附圉HPLC—ECD测定鼠脑中 儿茶酚驻类神经递质 3)回收率,精密度详见l(n一2),其 值与有关文献报道相一致"]. 寰1儿蓑酚胺类神经递质回收卓,精密度 4)小鼠脑组织儿茶酚胺类及其代谢物的 测定在本实验室条件下,实验BC组和空 白对照A组相比较,其中单胺类神经递质 DA含量显着上升,NE,DOPA含量明显下 降,而Ep则无显着性变化;而实验B,C组与 实验对照D组比较则无显着性差异.详见表 2.空白对照组与文献报道一致,模型组与有 关报道相吻厶[. ? l86? 3讨论 衰2吝组小暖脑组织中儿蓑酚胺粪递质含量值ng/g湿咕重士 互118A组30,B组28,C组29,D组31?和A组比较有曼着性差异(P<0.05) ?和A组比较有非常显着性差异(P<0.O1)?与B组比较有非常显着性差异(尸 <0.01) 十罟堡E 急性重复性缺氧可以造成动物体液中氧 含量[以p(O:)表示]降低,导致组织细胞中 氧分压降低,使这些细胞中对氧敏感的有关 酶类活性改变,最直接的表现是酶底物和 (或)产物含量的变化.从急性重复性缺氧小 鼠脑组织中儿茶酚胺类神经递质含量的检测 和统计分析来看,在A,B,C3组比较中发 现:DOPA,NE显着下降,DA显着升高,而 Ep则无变化'实验对照D组与正常对照A 组比较无显着性差异.从上述结果可看出小 鼠经过急性重复性缺氧,其脑组织中的儿茶 酚胺类递质的含量发生了很大改变,而且与 缺氧适应(耐缺氧时间)能力的产生关系密 切,表明急性重复性缺氧使儿荼酚胺类逮质 代谢酶活性改变,从而使儿茶酚胺类神经递 质的含量变化. 儿茶酚胺的代谢去向蛆下: 酪氨酸DOPADA (十表示含量升高,表示含量下降) 酪氨酸羟化酶是这一合成过程途径的限速 酶,是一个混合功能氧化酶,需分子氧(0:) 的参与.在脑缺氧的情况下,神经系统供氧也 受影响,如p(O:)较低,势必影响需氧参与的 羟化酶的活性,而此酶活性的降低,造成产物 量的下降,同时引起酶底物的积累0],与本实 验结果相符.由此可以看出:急性重复性缺氧 降低儿荼酚胺代谢过程中羟化酶的活性.本 研究的实验对照D组小鼠,在经4次缺氧后 再饲养2d,发现儿茶酚胺类递质的水平基本 恢复到正常对照A组的水平,小鼠活动也与 正常组一样,没有显着性的差异.可能是经过 急性重复性缺氧的过程,有关儿荼酚胺类神 经递质代谢的羟化酶受缺氧的影响,其活性 受到抑制,但是这种改变是可逆的,,旦环境 恢复正常,酶活性很快就恢复到原来水平.至 于其有关的生理学意义还有待于深入研究. 参考文献 1吕国蔚,史美棠,李凌,等.急性重复性缺氧 对小鼠缺氧耐受性的影响及其机制的初步 探讨.中国病理生理杂志.1992.8(4):425 2史美棠,吕国蔚,李凌.等.急性重复性缺氧 小鼠脑组织中必需微量元素古量的变化.中 国病理生理杂志,1993,9(3):426 - 187- 3吕国蔚.缺氧适应的组筝{机制.见;潘世崴主 编.病理生理学进展.北京:人民卫生出版 杜,1963.196 4WarnhoffM.SEmutaneousdetermlnadonof NE,DA.5-HTandtheirmainmetabolites inratbrainusinghighper{ormanceliquid chromatographywithelectrochemicalde— teetlon.JChromatogr,1984,307:271 5EllsabethMT,RiehardR.Catecho]amine metabolitetsinmousebrain usingHPLC—ECDinmethodsinenzymo]o?- . sanDiego:Ca][forniaAcademicPress Ine.1987.64 6CooperR.Bi0omE.RothH.Thebiocheml— calbasisofneuropharmaeology.15thed. NewYork:MareelDekkerIne,l986.173 (收稿:l99412o2) StudiesofCatecholamineTransmittersinAcute RepetitiveHypoxiaofMouseBrain HuangRuhin,YangDianer,PanYing,LiAihua DepartraentofBiochemistry,CapitalInstituteofMedich~e Kunmingmousewaschosenastheexperimenta1anima1.The1evelsofDOPA,DA,NE andEpinbraintissueweremeasuredbyhigh-rperformanceliquidchromatographyundera-r cuterepetitivebypoxia.AscomparedwiththegroupAofblankcontrolwithoutexposedto hypoxia,groupBofexperimentalcontrolwasexposuredtobypoxiaonlyonce,andgroupDof anotherexperimenta1contro1wasexposedacutelyandrepetitivelytohypoxiafor4timesand thenfedfor2days,thelevelsofDAincreasedsignificantlyandthatofDOPA,NEdecreased markedlyinexperimentalanimals,groupC,acutelyandrepetitivelyexposedtohypoxiafor4 times}whilethelevelsofcatecholaminesweresimilarbetweengroupAandD.Therewasno significantdifferences.Theresultsindicatedthatcatecholaminesinbrainmightbeinvolvedin thedevelopmentoftoleranceinanimalsexposedtoacuteandrepetitivebypoxia,andthepro— cessmightheafastreversibleresponse. Keywords:repetitivehypoxialcatecholamines}HPLC ?l88-