2010CB945600-组织干细胞的干性维持、分化控制和免疫调节研究

2010CB945600-组织干细胞的干性维持、分化控制和免疫调节研究 项目名称： 首席科学家： 起止年限： 依托部门： 一、研究内容 1 研究干细胞静息和活化状态的转换，评价其分化的多潜能性，以认识组织干 细胞的干性维持机制。拟应用已知的可能的组织干细胞的标志，制备组织干细胞 遗传标记小鼠模型或进行离体标记，以显微切割系统进行单细胞水平的分离，利 TM用已建立的组织干细胞长期培养观察系统进行培养观察，借助SOLiD技术平台对组织干细胞进行单细胞达谱分析，以识别和鉴定组织干细胞，识别静息和 活化的组织干细胞的特征，发现不同状态下组织干细胞的特异性分子标志，掌握 静息和活化状态转换的分子机制；研究免疫因子对组织干细胞干性维持的影响及 其机制；通过比较不同阶段的多潜能干细胞和单潜能前体细胞的mRNA和蛋白质表达谱以及表观遗传学谱，确定组织干细胞在遗传及表观遗传方面的特性标 志，分析维持组织干细胞多潜能性的遗传和表观遗传作用机制，揭示组织干细胞 干性维持的规律。 2 研究分化启动关键因子、抑分化因子和促分化因子平衡、免疫因子与分化的 相关性、分化过程的阶段特性，以及异位再殖的分化特性。拟采用活体组织中干 细胞遗传标记及其谱系示踪模型小鼠，制备组织干细胞分化模型，在不同的时间 点（即不同的分化阶段）直接从活体中采取标记细胞和组织标本，采用原位和离 体的方法对组织干细胞分化活动的过程及其调控进行具有时空特性的综合研究， 其中包括：组织干细胞分化进程中结构空间特性的认识、不同分化阶段特征的鉴 别、分化启动和分化定向关键调控因子的鉴定。在此基础上，也进行不同胚层来 源的组织的组织干细胞之间的比较研究，以认识分化事件调控的基本规律。 3 研究与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制，加深对 组织干细胞分化调控基本规律的认识。拟采用遗传学和表观遗传学研究体系，探 讨已知的表观调控因子（包括组蛋白修饰分子、染色质重塑分子和microRNA） 的生物学功能和作用机制；发现和鉴定新的表观遗传调控因子及其作用机制；研 究免疫因子对组织干细胞分化的遗传及表观遗传调节的影响及其机制；运用生物 信息学方法，整合不同层次的数据（mRNA、转录因子、microRNA和表观遗传 调控相关分子），探索组织干细胞分化调控规律，为干预组织干细胞的分化提供 依据。 4 研究组织干细胞的免疫生物学特性及机体免疫因素对组织干细胞的调控。拟 利用功能基因组和蛋白质基因组高通量平台分析不同状态和阶段的组织干细胞 免疫相关分子表达差异，明确组织干细胞免疫相关分子及其功能的识别和鉴定标 志，研究免疫因子对组织干细胞干性维持、分化和免疫功能的影响，发现关键的 免疫调控因子及其作用机制。进而在组织损伤和疾病动物模型中，研究机体微环 境免疫因素对植入和内在的组织干细胞的激活、动员、向损伤靶组织定向迁移、 分化、生长和凋亡的作用及其机制，发现干预调控靶点。研究组织干细胞移植对 组织损伤和疾病动物的免疫影响和损伤修复作用，同时也研究间充质干细胞等移 植可能产生的副作用，并研究组织干细胞移植的免疫排斥及可能的干预手段，探 讨组织干细胞移植修复治疗及再生医学的新策略。 二、预期目标 以发现组织干细胞生物学的基本规律，发展精准调控组织干细胞的新策略， 并将其应用于修复组织和治疗疾病为最终目标。 本着“突出我国领域优势，着重解决符合重大需求的关键问题、瞄准国际基 础理论前沿”的原则，立足于中国科学院干细胞重点实验室和上海干细胞研究所， 并在我们研究已取得重要突破的基础上，利用项目组具有特色的技术平台和研究 体系，研究组织干细胞发育的多潜能性、分化调控过程及其与机体免疫的交互作 用，多层次地分析组织干细胞干性维持，分化启动及分化调控、免疫调控等关键 制动节点。以期阐明组织干细胞干性维持、分化启动和分化定向的关键分子机制， 确定其干预调控靶点，深入理解组织干细胞调控网络。认识组织干细胞与机体免 疫交互作用的规律，为组织干细胞安全有效地应用于组织修复和疾病治疗，提供 重要理论基础和技术支撑。进一步加快我国干细胞研究与再生医学、免疫和分子 遗传等领域的衔接和交叉，形成高水平的学术研究人才梯队。 1 建立组织干细胞静息和活化状态的指纹图谱，确定组织干细胞的细胞编程差 异及干细胞静息与活化状态的识别标志，发现组织干细胞共性及特性标志。研究 并发现调控组织干细胞静息与活化状态的关键因子及多潜能性维持的遗传及表 观遗传规律。并揭示不同组织的组织干细胞及其在体外和体内环境下干性维持的 异同。通过对组织干细胞活化异常的干预研究，为干细胞疗法提供新的药物靶标。 2 建立组织干细胞的遗传标记和分化谱系示踪的技术体系，实现分化阶段的划 分及其mRNA、microRNA和蛋白质水平指纹图谱的建立，发现分化启动及其后续各主要分化阶段的关键调控因子，并绘制可以反映主要分化方向和主要分化等 级的分子“分化树”，以丰富组织干细胞的分化过程及其分化调控分子基础方面的 知识体系，进而为活体中组织干细胞分化行为人为干预体系的建立提供理论基 础。 3 阐明与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制；发现和 鉴定新的表观遗传调控分子；整合不同层次的数据（mRNA、转录因子、microRNA 和表观遗传调控相关分子），认识组织干细胞分化调控网络。为干预组织干细胞 的分化提供依据。 4 筛选并确定组织干细胞特异性表达的免疫相关分子，建立组织干细胞免疫学 功能的识别鉴定体系，发现调控组织干细胞免疫功能的关键因子。建立研究组织 干细胞迁移的技术体系，认识组织干细胞迁移的特征。阐明组织干细胞与机体免 疫因素的相互作用及其分子机制，发现免疫干预调节的关键靶点，提供免疫调节 新策略。 基于以上目标，本项目将发表SCI收录的学术论文100篇以上，其中在相关领域的国际权威刊物上发表论文30篇以上，申报发明专利30项，取得具有国际影响的原创性成果3-5项，培养硕博士研究生30-50名；并形成组织干细胞领域的杰出人才梯队。 三、研究方案 本项目针对制约组织干细胞研究和应用的理论瓶颈问题，以“确定组织干细胞静息状态、活化状态及分化过程的识别标志、揭示组织干细胞干性维持的规律、 认识组织干细胞分化启动和分化定向的机制、阐明组织干细胞分化的调控网络及 其遗传和表观遗传机制和建立组织干细胞移植修复治疗中免疫影响的评价和调 控体系”为研究目标，集成细胞和分子生物学、表观遗传学、基因组学、转录组 学、蛋白质组学及生物影像学、免疫学、生物信息学等优势学科力量，开展多学 科交叉综合性研究，集中攻关关键科学问题。依据组织干细胞生物学活动的过程， 以研究组织干细胞静息和活化状态的转换及多潜能性为起点，探索组织干细胞分 化启动和分化定向的关键分子和靶点、分化调控网络及其遗传和表观遗传调控机 制，进而研究组织干细胞与机体免疫的相互作用，以深入理解组织干细胞分化调 控的基本规律以及组织干细胞移植的免疫调控机制，为组织干细胞临床应用奠定 重要理论基础。 1. 利用相关组织干细胞的分子标志，建立组织干细胞遗传标记的基因工程小鼠 品系，以形成活体组织遗传标记和分化谱系示踪的研究平台。 2. 采用已建立的细胞显微成像技术、单细胞激光捕获技术和单细胞表达谱研究 分析平台系统，在单细胞水平对组织干细胞进行识别鉴定、静息与活化状态 转换和多潜能性维持机制的研究。 3. 利用组织干细胞遗传标记的基因工程小鼠品系，制备相应的分化模型，在不 同的时间点直接从体内采取标记细胞及相应的组织标本进行mRNA、 microRNA、蛋白质、细胞及组织水平的分析。进而利用RNA干扰和基因敲 除的技术体系，研究所发现的关键分子在组织干细胞分化中的作用。 4. 采用ChIP-chip (seq)、MeDIP-chip (seq)技术和microRNA深度测序技术分析 不同组织干细胞表观遗传差异，建立它们的表观遗传指纹图谱，进而达到对 其进行识别和鉴定的目的。 5. 通过DNA甲基化检测、染色质免疫共沉淀、组蛋白密码分析、染色质重塑 分子基因敲除等方法，探讨DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等表观 遗传调控在组织干细胞分化中的作用。 6. 运用生物信息学方法，整合不同层次的数据（mRNA、转录因子、microRNA 和表观遗传调控相关分子），认识组织干细胞分化相关的调控网络。 7. 利用功能基因组和蛋白质组高通量分析平台，建立组织干细胞免疫学功能的 识别鉴定体系。运用趋化因子及其受体分析平台，研究组织干细胞的迁移特 征与分子调控机制。 8. 利用多种组织损伤和疾病动物模型，研究组织干细胞移植的免疫影响和损伤 修复作用，同时研究组织损伤和疾病状态时，机体免疫因素对组织干细胞的 免疫相关分子表达、动员、激活、趋化迁移、分化、生长和凋亡等的影响。 以上各研究内容相对独立，而同时密切配合，交叉互用，形成一个有机整体。 本项目针对组织干细胞的干性维持、分化启动、分化定向和组织干细胞与机 体微环境之间的相互影响等关键科学问题进行系统研究，其在理论上和技术上的 创新与特色，主要体现在以下几个方面： 1。采用已建立的组织干细胞遗传标记技 TM术体系，结合先进的细胞成像技术、单细胞激光捕获技术，以及SOLiD单细胞表达谱研究分析平台系统，构建静息与活化状态的组织干细胞的指纹图谱，探 寻可用于其识别和鉴定的特异性分子标志，以此进一步探讨和阐明组织干细胞静 息和活化状态相互转换和组织干细胞多潜能性维持的分子基础与调控机制。同时 结合上述研究，采用组织干细胞体外培养体系，进一步探讨组织干细胞体内及体 外的生物学行为异同性。 2。采用基于Cre-loxP的基因工程小鼠技术体系，进行组织干细胞活体内遗传标记，及其后续分化谱系的示踪。并采 用原位和离体的分析技术，建立不同分化阶段的指纹图谱，探寻组织干细胞分化 启动和分化定向的关键调控因子，绘制组织干细胞“分化树”，从时间和空间的角度，解析组织干细胞分化过程及其调控作用的分子基础。同时也进行体外组织干 细胞分化的研究，进一步分析组织干细胞体内、体外分化行为的特点。 3采用遗传学、表观遗传学和生物信息 学的研究体系，探讨调控组织干细胞分化启动和分化定向等的关键因子及作用机 制。进而整合不同角度的研究数据（mRNA、转录因子、microRNA和表观遗传 调控相关分子），认识组织干细胞分化调控网络，探索组织干细胞分化调控机制 的基本规律，为干预组织干细胞分化提供依据。 4。结合研究组织干细胞对机体修复 和免疫调控作用，同时观察机体局部微环境对前者分化发育和功能的调控影响， 是本项目的又一新特色。在此基础上，进一步围绕免疫微环境对组织干细胞的迁 移和募集作用，研究病生理状态下，趋化因子及其受体以及黏附分子等对组织干 细胞的动员和招募调控机制，构建组织干细胞趋化因子受体表达谱，以此进一步 分析组织干细胞的靶向趋化效应。 通过上述几个关键问题的研究，若达预期目标，本项目不仅突显了在组织干 细胞生物学研究领域的原创性，也将丰富和充实干细胞生物学的知识体系，为组 织干细胞在细胞治疗和再生医学中的应用奠定新的理论基础。 本项目依据组织干细胞最新研究动态和发展前景，立足于已有工作基础和 技术平台，围绕“组织干细胞的干性维持、分化控制及免疫调节”的重大科学问题，经过充分科学论证，展开系统研究，从而保证该项目的立项和实施的可行性。 1本项目组成员均为来自国家及部门干细胞等重点实验室的科 研一线优秀中青年专家，已在干细胞、免疫学、细胞和分子生物学以及结构和功 能基因组学研究等方面取得了具有国际影响力的学术成绩。拟推荐的首席科学家 时玉舫教授是中央组织部首批“引进海外高层次人才”，各课题负责人也都在组织干细胞领域有突出成就，承担和完成了多项国家、省部级的相关研究课题，有深 厚的研究造诣和丰富的课题管理经验。 2本项目组成员多年从事干细胞及相关领域的系统研究，具有 较丰富的工作积累和取得了一批重要的创新突破，为本项目的实施奠定了坚实的 基础。在国际上首次分离培养了鼠肝干细胞系，证明了其具有肝向和胆向分化的 潜能，以及再殖损伤肝脏的能力（Stem Cells. 2006, 24: 322），在此基础上，进一步发现和提出了其肝向分化启动的“开关效应”学说；首先在侧脑室的室管层中发现了处于分化上游（静息活化期）的神经干细胞的存在，并确定其特异性的分 子标志（Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008, 105: 1026)；采用构建基因剔除动物模型和基因芯片等方法，发现了一批干性维持、自我更新和分 化相关基因（Blood. 2009, 113: 1455；Frontiers in Bioscience. 2007, 12: 1691； Journal of Cellular Biochemistry. 2009, 106: 16）。发现人的胚胎干细胞的基因拷 贝数指纹图谱在体外培养和分化中可以保持稳定（Stem Cells. 2008, 26: 1484）。这些工作积累为本项目的课题设定和深入研究提供了科学保障。 发现影响不同的人胚胎干细胞株分化方向的不同表观遗传特征（Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007, 104: 13821）。利用遗传和表观遗传技 术平台，揭示了细胞凋亡调控基因TIP30调控下游基因表达的分子机制 （Hepatology. 2008, 48: 265；Cancer Research. 2008, 68: 4133；Clinical Cancer Research. 2008, 14: 7405）。通过对神经元中甲基化CpG结合蛋白MeCP2的功能研究，首次确定其结合靶基因—脑源性神经营养因子基因BDNF（Science. 2003, 302: 890）。这些表观遗传领域的研究成果为本项目的实施提供了丰富知识积累。 首先发现间充质干细胞免疫调控的体内作用机制（Cell Stem Cell. 2008, 2: 141）及免疫因子诱导干细胞产生细胞生长因子（Stem Cells. 2009, In press）促进了对干细胞的全新认识。早在1989年即提出了激活诱导细胞死亡的重要学说 （Nature. 1989, 339: 625）。首次成功地在体外用胚胎肝造血干细胞诱导分化了 树突状细胞（dendritic cells，DC），并发现胚胎时期DC和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）细胞分化途径和可逆性转变及其关键调控因子（Blood. 2000, 95: 138）。首先通过趋化因子直接招募大量DC前体细胞以制备疫苗，开拓了趋化 因子研究的新领域（Journal of the National Cancer Institute. 2004, 96: 201；Journal of Leukocyte Biology. 2008, 84: 1549）。发现骨髓干细胞移植后的GVHD病程发展与异体反应T细胞表达的趋化因子受体的调控作用密切相关（Journal of Immunology. 2008, 181: 7581）。这些是组织干细胞免疫特性及其与机体免疫 交互影响研究的重要学术思想源泉和进一步取得创新突破的基石。 在生物信息学方面，建立了多种生物信息学模型(Bioinformatics. 2003, 19: 2161 )，并将生物学信息学成功地应用到了生物具体问题中 (Journal of Biological Chemistry. 2004, 279: 2719；Human Mutation. 2009, In press等)。这些为本项目的跨学科合作提供了经验和基础。 3本项目组拥有较成熟的技术平台和先进的仪器设 备。如基于转基因/基因剔除模型、RNA干扰技术、自动DNA测序仪和高通量芯片的基因功能组学平台；原位遗传标记技术、单细胞水平高通量显微分离和 TMSOLiD单细胞表达谱研究平台；DNA甲基化分析系统、ChIP-chip (seq)、 MeDIP-chip (seq)技术和microRNA深度测序技术；活体荧光成像仪，激光共聚焦显微镜、投射/扫描电镜等细胞影像分析平台；多色高速流式细胞仪、SPF级 的动物研究室、干细胞培养室。 4瞄准战略目标，追求持续发展，开展系统化研究。项目组织 管理和运作体制分项目和课题两个层次。项目设一名负责人，负责整个项目的组 织和实施。项目负责人聘请各相关科学领域成就卓著的专家组成项目专家组，参 与项目的组织、运行领导和管理，协助项目负责人，审核和确定项目的学术思想、 技术路线以及研究，指导协调各课题的工作，督促并考核各课题的进展情况。 实施整体性运作方案，集成发展技术平台，充分发挥项目各课题组及承担单位的 学科优势和关键研究实力，形成功能配套、布局合理、机制灵活、锐意进取的研 究体系。 根据本项目的总体研究方案，以研究组织干细胞的干性维持、分化过程及其 与机体免疫的交互作用为核心，针对关键问题选择突破点，将项目设臵为四个课 题。课题一，利用活体内干细胞遗传标记和分化谱系示踪技术以及单细胞分离和 分析平台系统，建立静息及活化的组织干细胞的分子标志系统，研究调控组织干 细胞静息与活化状态转换和多潜能性维持的机制，揭示组织干细胞干性维持的规 律；课题二，利用特定的分化模型，研究组织干细胞分化启动及其分化定向的分 子基础，探索关键因子在分化命运决定中的作用；课题三，利用染色质免疫共沉 淀芯片、甲基化DNA免疫沉淀芯片等技术，研究组织干细胞分化调控的遗传和 表观遗传调控机制，并利用生物信息学手段，构建组织干细胞的调控网络模型， 阐明组织干细胞分化的规律；课题四，利用活体示踪体系及组织损伤和疾病动物 模型，研究组织干细胞体内迁移模式、组织干细胞与机体免疫系统的交互作用及 调控靶点，并进一步探讨组织干细胞移植治疗和再生医学的新策略。 1 本课题拟利用高分辨率显微分离系统、活细胞显微成像和单细胞深度测序技 术，对组织干细胞进行单细胞分离和表达谱分析，以识别和鉴定组织干细胞的静 息与活化状态，建立指纹图谱，进而建立静息和活化的组织干细胞的分子标志系 统；比较肝脏、间充质、神经和乳腺等不同组织的组织干细胞共性与特性。进行 mRNA和蛋白质表达谱以及表观遗传学谱分析，揭示组织干细胞在静息和活化 状态之间转换和多潜能性维持的关键因子及其作用机制。进一步还将研究不同组 织的组织干细胞及其在体外和体内环境下干性维持的异同。本课题将为调控组织 干细胞的静息和活化状态提供理论基础，并为干细胞替代疗法和药物研发提供新 思路。 研究干细胞静息和活化状态的转换，评价其分化的多潜能性，以认识组织干 细胞的干性维持机制。拟应用已知的可能的组织干细胞的标志，制备组织干细胞 遗传标记小鼠模型或进行离体标记，以显微切割系统进行单细胞水平的分离，利 用已建立的组织干细胞长期培养观察系统进行培养观察，借助SOLiD TM技术 平台对组织干细胞进行单细胞表达谱分析，以识别和鉴定组织干细胞，识别静息 和活化的组织干细胞的特征，发现不同状态下组织干细胞的特异性分子标志，掌 握静息和活化状态转换的分子机制；研究免疫因子对组织干细胞干性维持的影响 及其机制；通过比较不同阶段的多潜能干细胞和单潜能前体细胞的mRNA和蛋 白质表达谱以及表观遗传学谱，确定组织干细胞在遗传及表观遗传方面的特性标 志，分析维持组织干细胞多潜能性的遗传和表观遗传作用机制，揭示组织干细胞 干性维持的规律。 经费比例： 20% 承担单位： 同济大学 课题负责人： 刘小青 学术骨干： 吴昊、陈炳官、袁琼兰、罗玉萍、杨胜东、李惠萍 2 本课题拟采用组织干细胞的遗传标记和分化谱系示踪的手段，利用特定的分 化模型，在不同的时间点上直接采取标记细胞和组织标本，从RNA、microRNA、 蛋白质、细胞和组织等不同层面或角度，对组织干细胞分化启动及其分化定向的 分子基础进行探讨，发现决定分化命运的关键分子及其相互关系，并绘制反映主 要分化方向和分化等级的分子“分化树”，以丰富组织干细胞生物学中关于分化启 动与分化定向的调控机制、分化阶段的判断，以及组织干细胞异位分化的调控因 素等方面的知识体系。 研究分化启动关键因子、抑分化因子和促分化因子平衡、免疫因子与分化的 相关性、分化过程的阶段特性，以及异位再殖的分化特性。拟采用活体组织中干 细胞遗传标记及其谱系示踪模型小鼠，制备组织干细胞分化模型，在不同的时间 点（即不同的分化阶段）直接从活体中采取标记细胞和组织标本，采用原位和离 体的方法对组织干细胞分化活动的过程及其调控进行具有时空特性的综合研究， 其中包括：组织干细胞分化进程中结构空间特性的认识、不同分化阶段特征的鉴 别、分化启动和分化定向关键调控因子的鉴定。在此基础上，也进行不同胚层来 源的组织的组织干细胞之间的比较研究，以认识分化事件调控的基本规律。 经费比例： 25% 承担单位： 中国人民解放军第二军医大学、上海交通大学 课题负责人： 胡以平 学术骨干： 诸江、谢志芳、余宏宇、陈美珏、李文林 3 阐明与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制，发现和 鉴定新的表观遗传调控分子，整合不同层次的数据（mRNA、转录因子、microRNA和表观遗传调控相关分子），构建不同胚层来源的组织的组织干细胞分化调控网 络模型，为干预组织干细胞的分化提供依据。 研究与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制，加深对 组织干细胞分化调控基本规律的认识。拟采用遗传学和表观遗传学研究体系，探 讨已知的表观调控因子（包括组蛋白修饰分子、染色质重塑分子和microRNA） 的生物学功能和作用机制；发现和鉴定新的表观遗传调控因子及其作用机制；研 究免疫因子对组织干细胞分化的遗传及表观遗传调节的影响及其机制；运用生物 信息学方法，整合不同层次的数据（mRNA、转录因子、microRNA和表观遗传调控相关分子），探索组织干细胞分化调控规律，为干预组织干细胞的分化提供 依据。 经费比例： 20% 承担单位： 中国人民解放军第二军医大学、中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人： 赵健 学术骨干： 沈百荣、张岩、陆斌、刘祖梅、周娟、王建永 4 本课题拟着重研究组织干细胞与机体免疫的交互作用及其分子机制。基于已 建立的功能基因组和蛋白质组高通量技术平台，筛选并明确不同阶段组织干细胞 免疫识别相关的特异性分子标志，发现调控组织干细胞免疫功能的关键因子；采 用细胞示踪技术，研究组织干细胞的体内迁移模式；在组织损伤和疾病动物模型 体内研究免疫因素与组织干细胞的交互作用及其影响。以期建立组织干细胞免疫 学功能的识别鉴定体系和组织干细胞迁移及功能示踪的技术体系，阐明组织干细 胞的免疫调控分子机制，发现干预调节的新靶点和提供免疫调控的新策略。 研究组织干细胞的免疫生物学特性及机体免疫因素对组织干细胞的调控。拟 利用功能基因组和蛋白质基因组高通量平台分析不同状态和阶段的组织干细胞 免疫相关分子表达差异，明确组织干细胞免疫相关分子及其功能的识别和鉴定标 志，研究免疫因子对组织干细胞干性维持、分化和免疫功能的影响，发现关键的 免疫调控因子及其作用机制。进而在组织损伤和疾病动物模型中，研究机体微环 境免疫因素对植入和内在的组织干细胞的激活、动员、向损伤靶组织定向迁移、 分化、生长和凋亡的作用及其机制，发现干预调控靶点。研究组织干细胞移植对 组织损伤和疾病动物的免疫影响和损伤修复作用，同时也研究间充质干细胞等移 植可能产生的副作用，并研究组织干细胞移植的免疫排斥及可能的干预手段，探 讨组织干细胞移植修复治疗及再生医学的新策略。 经费比例： 35% 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、中国人民解放军第二军医大学 课题负责人： 时玉舫 学术骨干： 张雁云、杜艳芝、卫立辛、张晓玲、于凤海、金敏、刘强 四、年度计划 第1、 以显微切割系统分离CD133基1、建立和完善不同来源的多种 一因位点带GFP遗传标记的不同CD133+组织干细胞的筛分方法。 年 来源的多种组织干细胞。 2、确定不同组织来源的CD133+细2、 对单个CD133+细胞进行长期培胞中组织干细胞的比例。 养观察，测定克隆形成的过程，3、在单细胞水平上建立组织干细胞 并结合免疫荧光染色对子代细在静息、活化状态转换的转录图 胞的去向进行可能的标签跟踪，谱以及表观遗传谱，以识别和鉴 确定CD133+中组织干细胞的比定组织干细胞，发现可用于鉴别 例。 不同状态下的组织干细胞的特异3、 借助SOLiDTM技术平台对性分子标记，从而为揭示组织干 CD133+组织干细胞进行单细胞细胞的静息和活化状态转换的分 表达谱系统分析，包括建立转录子机制提供重要信息。 图谱以及表观遗传谱。 4、得到组织干细胞遗传标记的小鼠4、 建立组织干细胞特异分子标志品系； 基因（如肝干细胞的Foxl1）的5、实现组织干细胞从分化模型中的 启动子所驱动的GFP的转基因分离、富集及其表达谱分析； 小鼠品系； 6、建立干预分化模型小鼠的慢病毒 5、 建立干细胞动员和分化的小鼠干扰系统； 模型，比较分析分化前后表达谱7、获得抑分化因子与干细胞分化启 差异，筛选抑分化基因； 动的相关性信息； 6、 构建慢病毒干扰载体，以用于分8、建立研究转录和转录后调控机制 化模型小鼠的干预处理，观察抑的相关实验体系和技术平台； 分化基因被knock-down后对活9、建立NanogLoxP/＋小鼠模型为 体组织中干细胞动员的影响； 探讨Nanog在组织干细胞分化调 7、 观察抑分化候选因子在组织干控中的作用奠定基础； 细胞分化进程中的表达特点，分10、 初步探讨Mll5染色质重塑 析抑分化因子与干细胞分化启分子在组织干细胞分化中的作 动的相关性。 用； 8、 利用已经建立的肝干细胞、神经11、 筛查与组织干细胞分化相关 干细胞、间充质干细胞分离和鉴的关键miRNA分子； 定的技术平台，探讨Hes1、12、 建立组织干细胞体外和体内 FoxL1、Fbxw7、Xbp1、Nestin、分析系统，为后期分析组织干细 GFAP等重要转录因子在组织干胞在不同阶段的免疫相关分子的 细胞分化中的转录和转录后调表达情况建立技术平台； 节机制； 13、 了解组织干细胞对DC分 9、 建立NanogLoxP＋/＋小鼠模型； 化、成熟和功能的调控作用，为 10、 对已经构建成功的Mll5基进一步了解其作用机理奠定基 因敲除小鼠进行初步分析，利用础。 组织化学与免疫生物学等方法，14、 发表SCI收录的学术论文14 检测Mll5基因敲除后肝、神经、篇，其中在相关领域的国际权威 间充质、乳腺等组织干细胞的变刊物上发表3篇，培养研究生8 化； 名。 11、 通过大规模、高通量的深度 测序（Deep-sequencing）的方式 分析肝、神经、间充质等若干重 要组织干细胞的small RNA表达 谱式, 运用单细胞Real-time PCR的方式验证分析miRNA在 不同类群组织干细胞中的表达 分布特征。 12、 利用功能基因组平台和蛋白 质组平台，建立组织干细胞体外 和体内分析系统； 13、 将不同状态和阶段的组织干 细胞加入到DC培养系统中，观 察组织干细胞对DC分化、成熟 和功能的调控作用。 14、 研究间充质干细胞移植的副 作用 第1、建立在表达图谱上有重大或特异1、确定组织干细胞干性维持、静息 二差异的基因的功能缺失或获得模和活化状态的关键因子。 年 型。 2、揭示机体微环境对组织干细胞的 2、对以上建立的模型进行静息、活静息与活化状态相互转换及其多 化状态的鉴定，确定特异表达的潜能性的调节机制。 分子标签是维持组织干细胞功能3、得到干细胞遗传标记和其分化谱 所必须的关键因子。 系示踪的小鼠品系； 3、利用体内各种基液(如脑积液)对4、绘制组织干细胞各个分化阶段的 不同来源的组织干细胞处理，研指纹图谱； 究其对组织干细胞静息与活化状5、完成可反映组织干细胞主要分化 态的相互转化及潜能性的维持的方向和主要分化等级的分子“分 作用机制。 化树”； 4、将携带基因Roser26R-LacZ 6、阐明转录和转录后调控在组织干 /Roser26R-GFP的小鼠与干细胞细胞分化调节中的作用； 特异分子标志基因的启动子所驱7、初步探讨Nanog基因在组织干细 动的Cre小鼠杂交，以获得可用胞损伤修复中的作用。 于干细胞标记和其分化谱系示踪8、初步探讨Mll5基因在组织干细 的小鼠品系，并制备相应干细胞胞损伤修复中的作用； 的分化模型； 9、探讨关键miRNA在组织干细胞5、在模型制备过程中的不同时间分化中的作用及其作用机制； 点，利用流式细胞技术等手段直10、 了解组织干细胞在不同阶段 接从活体组织中分离被遗传标记的免疫相关分子的表达情况； 的细胞，进而进行mRNA和11、 阐明组织干细胞对DC分 microRNA表达谱的分析，以构化、成熟和功能调控的作用机理； 建各个分化阶段的指纹图谱； 12、 了解组织干细胞与T细胞等6、收集各相应时间点的组织标本，免疫细胞的相互作用，重点阐明 进行原位分析，以追踪其组织干组织干细胞对T细胞的影响方 细胞的分化命运，并构建其干细式。 胞的“分化树”。 13、 发表SCI收录的学术论文16 7、继续对重要转录因子在组织干细篇，其中在相关领域的国际权威 胞分化中的转录和转录后调节机刊物上发表3篇，申请专利3项， 制进行研究； 培养研究生14名。 8、对建立的NanogLoxP＋/＋小鼠 模型进行初步分析，根据小鼠表 型选取不同时间段处死小鼠，收 集各种组织器官，进行表型观察 和病理切片； 9、利用手术、伽马射线或者化疗药 物制造组织损伤，检测Mll5基因 敲除后，组织干细胞在损伤修复 过程中的变化； 10、 通过过表达、基因敲低及可 诱导的miRNA转基因模型研究 组织干细胞分化过程中关键 miRNA的作用及其作用机制。 11、 利用已建立的平台技术分析 组织干细胞在不同阶段的免疫相 关分子的表达情况； 12、 针对已发现的组织干细胞对 DC分化、成熟和功能的调控作 用，进一步深入研究其中的作用 机理； 13、 在研究组织干细胞与DC细 胞相互作用的基础上，进一步研 究组织干细胞与T细胞的相互作 用，检测组织干细胞对T细胞增 殖及细胞因子分泌格局的影响。 14、 研究组织干细胞移植的副作 用 第1、 建立多潜能组织干细胞和单潜1、 揭示多潜能组织干细胞和单潜 三能前体细胞的mRNA转录图和表能前体细胞的分子指纹图谱，找 年 观遗传学谱。 出各自反应其潜能性的特异性 2、 从分化早期即发生改变的基因分子标签。 （从mRNA和microRNA水平）2、 获得候选分化启动和分化定向 着手，结合Go功能聚类和的关键因子； pathway聚类，筛选出候选的分3、 明确各候选关键因子对遗传标 化启动和分化定向的关键因子； 记细胞分化启动和分化中的作 3、 采用基因功能丢失或基因功能用； 获得等策略，从体外和体内两个4、 认识各种关键因子间的协同作 方面，逐个分析各候选关键因子用； 对遗传标记的组织干细胞多向5、 探讨DNA甲基化在组织干细胞 分化的影响； 分化中的作用； 4、 分析各种候选关键因子的不同6、 阐明Nanog基因调节组织干细胞 组合对组织干细胞分化行为的分化的分子机制； 影响。 7、 阐明Mll5基因在组织干细胞损5、 通过亚硫酸氢钠修饰、MSP和BSP伤修复中的作用及作用机制； 测序的方法，检测DNA甲基化在8、 建立干细胞在体迁移及功能示 肝干细胞、神经干细胞和间充质踪的斑马鱼技术体系； 干细胞分化中的作用； 9、 阐明组织干细胞对调节性T细胞6、 利用原位杂交，免疫组化，转化、淋巴细胞杀伤能力等的不 Real-time PCR和Western 同作用及其机理； blotting等方法分别在RNA水10、 发现若干调控组织干细胞的 平和蛋白质水平上详细分析免疫调控因子及其组合，并弄清 Nanog基因上下游相关分子表达其作用方式。 情况及其它相关重要信号通路11、 发表SCI收录的学术论文23 分子表达情况，从而确定Nanog篇，其中在相关领域的国际权威 基因在组织干细胞分化中的作刊物上发表6篇，申请专利5项， 用机制。 培养研究生17名。 7、 进一步探讨Mll5在组织干细胞 损伤修复中的作用和作用机制； 8、 构建斑马鱼重要组织如肝脏、心 脏等干细胞特异转录因子驱动 的GFP表达的转基因斑马鱼系， 通过绿色荧光蛋白示踪其组织 干细胞的分布，建立干细胞在体 迁移及功能示踪的技术体系。 9、 进一步分析比较组织干细胞对 调节性T细胞转化、淋巴细胞杀 伤靶细胞的能力等的影响； 10、 单独或联合应用各种免疫调 控因子刺激组织干细胞，检测和 比较刺激前后组织干细胞免疫 相关分子的表达差异，分析其增 殖能力变化和自身细胞因子分 泌格局。 11、 研究组织干细胞移植的副作 用。 第1、 建立潜在的反应组织干细胞的1、确定特异表达的分子标签是维持 四多潜能性的特异分子标签的基组织干细胞多潜能功能所必须的 年 因敲除或RNA表达干涉或功能关键因子。 获得模型模型。 2、明确不同来源组织干细胞的再殖2、 对以上建立的功能缺失或功能能力与再殖特点； 获得的模型进行潜能性测定。确3、明确组织干细胞再殖部位所浸润 定哪些特异表达的分子标签是的免疫细胞的类型； 维持组织干细胞多潜能功能所4、发现可以干预干细胞再殖效率的 必须的关键因子。 影响因子； 3、 将不同来源的组织干细胞分别5、探讨组蛋白修饰在组织干细胞分 植入FAH-/-小鼠，在不同时间点化中的调控； 观察植入细胞的效率、空间分布6、阐明miRNA在斑马鱼肝脏、心脏以及成熟肝细胞功能标志，评价再生中的作用； 不同来源细胞的再殖能力与再7、探索组织干细胞分化调控的基本殖特点。 规律。 4、 研究骨髓间充质干细胞在肝脏8、明晰组织干细胞免疫学功能相关 中的再殖情况，其中包括肝向分的识别和鉴定标志； 化的阶段划分、各个分化阶段的9、阐明有效免疫因子或其组合对组 指纹图谱，以及处于不同分化阶织干细胞的作用机制； 段的干细胞异位再殖潜力。 10、 建立和完善趋化因子及其受 5、 针对一些特别的因子，对拟用于体的分析技术平台，阐明组织干 移植的细胞用基因功能丢失或细胞的迁移特征与分子调控机 基因功能获得等手段处理，然后制。 再将其植入FAH-/-小鼠，评价其11、 发表SCI收录的学术论文25对再殖效率的影响。 篇，其中在相关领域的国际权威 6、 结合各组织来源的间充质干细刊物上发表10篇，申请专利10胞植入后不同时期形态学和不项，培养研究生22名。 同种类淋巴细胞的特异性免疫 学标记，分析参与免疫反应的淋 巴细胞种类，以发现主导细胞移 植免疫反应的免疫细胞类型。 7、 利用组蛋白修饰的特异抗体，进 行染色质免疫沉淀，分析肝脏、 间充质、神经和乳腺等组织干细 胞中重要转录因子启动子区域 的组蛋白修饰特征，明确这些基 因在组织干细胞分化中表达变 化的调控机制。 8、 利用miRNA芯片技术，获得斑 马鱼心脏、肝脏再生过程中miRNA的动态的表达变化谱式， 再结合敲除特异miRNA, 研究 单个miRNA对于干细胞介导的 再生过程的影响。 9、 通过动态贝叶斯网络方法建立 组织干细胞的遗传学和表观遗 传学调控网络,探索组织干细胞分化调控的基本规律。 10、 分别将不同阶段的组织干细 胞移植到组织损伤的动物体内， 研究体内的组织干细胞免疫相 关分子表达，并对比体外培养体 系中不同阶段的组织干细胞免 疫相关分子表达的差异，分析组 织干细胞在不同阶段特异性表 达的免疫相关分子； 11、 基于前期研究筛选出有效调 控组织干细胞的关键因子，并阐 明其作用机制。 12、 在组织损伤和疾病动物模型 中，分析靶组织和组织干细胞的 炎症因子、趋化因子及其受体、 黏附分子等的表达谱，研究组织 损伤后释放的免疫炎症因子对 植入和内在的组织干细胞的免 疫相关分子表达、动员、激活、 分化、生长和凋亡以及向损伤靶 组织迁移的影响作用。 第1. 利用免疫调节因子体内各种基1、揭示免疫调节因子及免疫拮抗因 五液(如脑积液)对不同来源的组织子对组织干细胞的静息与活化状 年 干细胞处理，研究其对组织干细态相互转换及其多潜能性的调节 胞静息与活化状态的相互转化机制。 及潜能性的维持的调控作用。 2、为干细胞移植克服免疫排斥提供 2. 利用免疫拮抗因子对不同来源新战略。 的组织干细胞处理，研究其对组3、认识组织干细胞分化启动和分化 织干细胞静息与活化状态的相定向的调节模块； 互转化及潜能性的维持的调控4、获得细胞的植入及增殖与免疫细 作用。 胞之间的认识； 3. 利用生物信息学，对mRNA和5、在组织损伤和疾病动物模型体内 microRNA层面的数据进行综合研究免疫因素与组织干细胞的交 分析，分析组织干细胞分化启动互作用及其影响； 和分化定向的关键因子的相互6、发现组织干细胞与机体免疫交互 关系； 作用的规律。 4. 不同组织来源的组织干细胞间7、发表SCI收录的学术论文30篇， 分化调控分子基础的横向比较，其中在相关领域的国际权威刊物 探讨组织干细胞分化启动和分上发表12篇，申请专利12项， 化调控的基本规律； 培养研究生22名。 5. 分析免疫细胞在干细胞植入和 增殖过程中的作用及其机制，并 评价人为干预的可行性； 6. 在组织损伤和疾病动物模型中， 研究分析组织干细胞移植对机 体免疫的影响作用及其机制； 7. 通过检测移植的组织干细胞在 靶组织中的存活、分化能力和向 各种靶组织细胞分化的比例，确 定组织干细胞在体内的分化状 态和对靶组织损伤的修复机制； 8. 同时研究机体对植入组织干细 胞的免疫排斥反应及其机制，探 索诱导组织干细胞移植免疫耐 受的新手段； 9. 进一步利用转基因或基因剔除 等手段改变某些潜在调控因子 的表达，研究由微环境中趋化因 子和黏附分子分别介导的组织 干细胞胞内信号转导，探索组织 干细胞在组织损伤和修复治疗 中迁移的分子机制。