汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究

汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 摘 要 目的 系统研究汉防己甲素tetrandrine,TET 在体外对临床常用唑类抗真菌药物抗白念珠 菌活性的增效作用。 方法 以来自HIV感染者的16株白念珠菌临床株CA-1~CA-17(无CA-10)为研究对象,选用 氟康唑(fluconazole, FLC)、伊曲康唑(itraconazole, ITR)、伏立康唑(voriconazole, VRC) 及酮康唑(ketoconazole, KCZ)分别作为三唑类及咪唑类药物的代表,采用棋盘式微量液 基稀释法分别测定TET与临床常用唑类药物在体外联用48h对白念珠菌的静态抗真菌作用, 结果以FICI(fractional inhibitory concentration index)法和ΔE法进行评价;采用时间-杀菌 曲线法动态测定联合用药48h内对白念珠菌敏感株CA-1及耐药株CA-17的体外抗真菌活性, 结果以菌落计数法和XTT比色法进行评价;并比较各方法间的一致性。 结果 TET单独作用于16株白念珠菌的MIC值为64-128 μg/mL;联合用药时唑类药物的MIC 值分别为:FLC + TET 0.125-8 μg/mL (vs. FLC 0.25-128 μg/mL), KCZ + TET 0.016-0.5 μg/mL(vs. KCZ 1-32 μg/mL),ITR + TET 0.031-0.5 μg/mL(vs. ITR 2-64 μg/mL),VRC + TET 0.016-0.5 μg/mL (vs. VRC 0.25-64 μg/mL);且MIC终点清晰,“拖尾现象”消失。 以 FICI法、ΔE法评判时,对耐药株,TET与 4种唑类药物联用的 FICI值均小于 0.5 (0.016-0.375),?SYN值均大于 100%,表现为强协同作用;对敏感株,TET和 FLC联 合用药组,以 FICI评判时 1/2株表现为协同作用,以 ΔE法评判时 1/2株表现为协同作用; 对于剂量依赖性敏感株,TET和 VRC联合用药组,以 FICI评判时 4/8株表现为协同作用, 以ΔE法评判时 5/8株表现为协同作用;其余均表现为无关作用。 时间-杀菌曲线结果示,唑类药物与 TET联合作用 48 h时,耐药株的活菌浓度均比单 用等剂量唑类药物降低>2 log CFU/mL;敏感株中 2/4株的活菌浓度比单用 等剂量唑类药 10 物降低>2 log CFU/mL,证实在体外 TET对唑类药物抗白念珠菌活性有增效 作用。 10 结论 TET在体外对FLC、KCZ、ITR及VRC抗白念珠菌活性有较强的增效作用, 对 于耐药株 的增效作用尤为显著,具有潜在的临床应用价值。 关键词: 汉防己甲素,增效作用,唑类药物,白念珠菌,棋盘式微量液基稀释 法 IAbstract Objective To investigate that TET which we have been found previously whether indeed have synergistic effect on azoles against Candida. albicansMethods Taking 16 clinical isolates of C. albicans CA-1, CA-2, „„, CA-17 , which were from HIV-infected patients as the study subject, FLC、ITR、VRC and KCZ were chosen to be representative of triazoles and imidazoles, respectively, the present study investigated the in vitro antifungal effects of TET combined with azoles by using the checkerboard microdilution method, and the effect of the interactions was assessed by two non-parametric approaches: the fractional inhibitory concentration index FICI model and ΔE model the difference between the predicted and measured fungal growth percentages; moreover, the dynamic antifungal effects of drug combinations against the azole-susceptible strain CA-1 and the azole-resistant strain CA-17 were assessed by using time-killing curves, the results were determined by using both colony counting and the colorimetric method utilizing XTT; The coincidence between various methods were evaluatedResults The MICs of TET against 16 C. albicans alone ranged from 64 to 128 μg/mL; when it combined with azoles, the MICs of azoles were : FLC + TET 0.125-8 μg/mL vs. FLC alone 0.25-128 μg/mL, KCZ + TET 0.016-0.5 μg/mL vs. KCZ alone 1-32 μg/mL, ITR+ TET 0.031-0.5 μg/mL vs. ITR alone 2-64 μg/mL, VRC+ TET 0.016-0.5 μg/mL vs. VRC alone 0.25-64 μg/mL, respectively; meanwhile, the MICs of TET also reduced to 1-16 μg/mL; the endpoints of the microtiter plates were clear, and the so-called “trailing” phenomenon could be eliminated The FICI andΔE model were used to evaluated the antifungal effects of TET combined with four azoles. For the azole-resistant strains, the FICI were all less than 0.5 0.016-0.375 , and all the ?SYN were more than 100%, significant synergistic effect were observed. For the azole- susceptible strains, when TET combined with FLC, 1/2 strains showed synergistic for FICI model, and 1/2 strains showed synergistic forΔE model; and for the the susceptible-dose dependent strains, when TET combined with VRC, 4/8 strains showed synergistic for FICI model, and 5/8 strains showed synergistic forΔE model; others revealed indifferentTime-killing curves showed that, for the azole-resistant strain, at 48 h the colony counting obtained by the XTT method treated with TET + azoles were at least 2 log CFU/ml lower 10 IIcompared to the strains treated with corresponding doses of azoles, indicated synergistic effects in vitro; for the azole-susceptible strain, the combinations showed synergism or indifference ConclusionsOur findings suggest that TET in vitro showed potent synergism when combined with the four azoles, FLC、KCZ、ITR and VRC, especially against azole-resistant C. albicans strains. It has potential clinical value Keywords : tetrandrine, synergism, azoles, Candida albicans, checkerboard microdilution method III目 录 摘 要. I ABSTRACTI 目 录. IV 前 言 1 1 白念珠菌感染的流行病学现状 1 2 白念珠菌感染的临床治疗现状 2 3 白念珠菌对唑类药物耐药机制 4 4 针对唑类药物耐药所采取的策略5 5 汉防己甲素概况及其作为唑类药物增效剂的研究进展. 8 6 抗真菌药物体外药敏实验研究进展11 7 本研究的内容、创新性及意义. 13 第一部分 以棋盘式微量液基稀释法测定并评价汉防己甲素与唑类药物的体 外静态联合抗 真菌作用. 14 1 材料. 14 1.1 菌株14 1.2 药品14 1.3 主要试剂 14 1.4 实验仪器与设备 14 1.5 药物与主要试剂的配制. 15 2 方法15 2.1 菌株的保存与活化15 2.2 菌悬液配制15 2.3 测定 TET与 4种唑类药物单独对白念珠菌的 MIC16 2.4 测定 TET分别与 4种唑类药物的联合抗白念珠菌活性. 16 2.5 两种药物联合作用效果的评价方法 17 3 结果18 3.1质控标准. 18 3.2 白念珠菌对唑类药物的敏感性判断标准. 19 3.3 TET及 4种唑类药物单独作用的 MIC值 19 3.4 TET与 4种唑类药物的联合抗真菌作用22 第二部分 以时间-杀菌曲线法测定并评价汉防己甲素与唑类药物的体外动 态联合抗真菌作 用 31 1 材料31 1.1 菌株31 1.2 药品31 1.3 主要试剂 31 1.4 实验仪器与设备 31 1.5 药物与主要试剂的配制. 31 2 方法32 2.1 时间-杀菌作用体系的建立32 IV2.2 时间-杀菌作用体系的测定及评价方法 33 3 结果34 3.1 时间-杀菌曲线的绘制 34 3.2 时间-杀菌曲线法的结果35 讨论39 结论41 缩略词表. 42 参考文献. 43 附录49 致谢50 V 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 前 言 白念珠菌(Candida albicans)又称白假丝酵母,属半知菌亚门芽孢菌纲隐球酵母科念 珠菌属,为念珠菌属中的主要致病菌,是最常见的机会致病性真菌,可寄居于正常人体的 胃肠道、阴道和口腔粘膜等部位,一般在正常机体中数量少,不引起疾病。当机体免疫功 能低下时,其可导致皮肤黏膜念珠菌病、甲念珠菌病及深部念珠菌病等,甚至可引发危及 生命的系统性感染。近年来,随着广谱抗生素、免疫抑制剂和细胞毒性药物的大量使用, 器官移植术、肿瘤放化疗技术的广泛开展,AIDS、糖尿病及恶性肿瘤患者等免疫功能低下 患者的的不断增多,白念珠菌感染的发病率居于侵入性真菌感染首位,在免疫功能低下的 [1]患者中白念珠菌感染也是重要的死亡原因之一 。 唑类抗真菌药物因其不良反应小,口服生物利用度高,抗菌谱广等优点,已成为治疗 念珠菌病的一线药物,在临床上使用广泛。但是,随着唑类药物长期、广泛使用,耐药株 [2] 有明显增多趋势,一些临床株甚至对唑类药存在交叉耐药 。而且,唑类药物对白念珠菌 只是抑菌剂,而不能使其死亡,由此而导致的治疗失败已成为困扰临床的重要问题。 因此,如何预防和治疗白念珠菌对唑类药物耐药已成为临床上治疗念珠菌病的重要难 题。寻找唑类药物的增效剂,逆转白念珠菌对唑类药物的耐药成为近年来的研究热点。我们已初步发现,天然药用植物粉防己根的双苄基异喹啉类化合物汉防己甲素 (tetrandrine, TET)对氟康唑抗白念珠菌、联苯苄唑或益康唑抗毛癣菌属活性有增效作用, [3-6] 其增效机制与抑制药物外排泵相关基因的表达有关 。 为进一步系统研究TET对其他唑类抗真菌药物是否具有增效作用,本实验选择氟康唑 (fluconazole, FLC)、伊曲康唑(itraconazole, ITR)、伏立康唑(voriconazole, VRC)及 酮康唑(ketoconazole, KCZ)分别作为三唑类及咪唑类药物代表为研究对象,采用棋盘式 微量液基稀释法(简称棋盘法),测定TET与临床常用的4种唑类药物联用对16株临床分离 的白念珠菌的体外抗真菌活性,并通过时间-杀菌曲线实验进一步动态验证验证TET对4种 唑类药物是否均具有增效作用。 1 白念珠菌感染的流行病学现状 近年来,随着恶性肿瘤、艾滋病、糖尿病病人等免疫功能低下患者的不断增多,化疗 药物、广谱抗生素及免疫抑制剂的大量使用,以及各种有创诊疗技术的广泛开展,真菌感 染的发病率随之急剧升高。白念珠菌是最常见的机会致病性真菌,也是最常见的引起深部 [7] 真菌感染的病原体 。我国真菌病病原学10年(1986~1996)动态流行病学研究表明,白念 1 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 [8] 珠菌在致病真菌中的构成比从1986年的第5位跃居1996年的第2位 。另有流行性学调查研 [9] 究显示,在美国医院内8%~10%的血液感染的主要病原体为念珠菌 。国外多实验研究中 心统计了1997~2007年的256882例医院真菌感染,其中白念珠菌占65.3%。 另外,根据美国 健康状况统计中心的资料显示:深部真菌感染的死亡率自1997年来呈稳定趋势,约0.4/10 [10] 万,其中以白念珠菌为最重要的致病菌 。最近的2项流行病学调查研究显示,白念珠菌 [11,12] 通过血液感染患者的病死率分别为44%和43.6% 。ARTEMIS研究和SENTRY计划均为 全球性多中心系列研究,其最新研究结果表明念珠菌感染的病原体以白念珠菌最常见分别 占65.3%和53.2%。分别对我国北京、上海、广州、杭州的5所三级甲等医院在2001~2005 年间临床分离的8000株酵母菌统计结果示:白念珠菌所占比率最高(59.5%),其次分别 是光滑念珠菌15.8%、热带念珠菌13.83%、克柔念珠菌1.77%和近平滑念珠菌1.51 %。 尽管各个国家或地区报道的白念珠菌感染率不尽相同,但总体趋势仍揭示白念珠菌是 最为重要的条件致病性真菌,它的发病率和病死率均较高,由其所引起的系统性感染是导 致患者死亡的主要原因。 2白念珠菌感染的临床治疗现状 白念珠菌侵袭性感染发展十分迅速,如得不到及时有效的治疗,可导致患者死亡。目 [13,14] 前,临床上能够有效治疗念珠菌感染的药物十分有限,常用的主要有以下几类 :(1) 多烯类抗真菌药物:代表药物有两性霉素B、制霉菌素等,此类药物具有杀菌作用,可与 真菌细胞膜上的麦角甾醇结合,致真菌细胞膜上产生多孔,使细胞内液中的重要物质溢出, 从而导致真菌细胞死亡。两性霉素B口服、肌注均很难吸收,口服后大部分经体内代谢灭 活,不易通过血脑屏障,不良反应较多,最常见的不良反应是静脉滴注药物后发生的寒战、 高热等即刻反应以及贫血,肝肾毒性等,其中肾毒性较大,且呈剂量依赖型,约有80%患 者长期使用可发生氮质血症;(2)唑类抗真菌药物:又分为咪唑类和三唑类两大类,代 表药物有酮康唑、联苯苄唑、氟康唑、伊曲康唑等,此类抗真菌药物以细胞色素P450为药 物作用靶点,选择性抑制羊毛甾醇-14α-去甲基酶,阻断真菌细胞膜中麦角 甾醇的合成通路, 使真菌细胞膜成分发生变化,细胞膜的通透性增高,导致真菌细胞内液中的重要物质溢出, 抑制真菌生长;(3)丙酰胺类抗真菌药物:代表药物有特比萘芬、布替萘芬等,此类药 物主要用于浅表真菌感染的治疗,通过抑制鱼鲨烯环氧化酶,从而抑制真菌细胞膜中麦角 甾醇的合成,同时角鲨烯的堆积又可导致真菌细胞膜的破坏,导致真菌细胞死亡;(4) 2 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 核苷类抗真菌药物:代表药物有灰黄霉素和5-氟胞嘧啶,通过竞争性干扰真菌细胞DNA的 合成,从而抑制真菌生长;(5)棘白菌素类抗真菌药物:代表药物有卡泊芬净、米卡芬 净等,此类药物具有杀菌作用,通过抑制真菌细胞的β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶,阻止真 菌细胞壁合成,细胞壁的通透性增高,导致细胞溶解。此类药物属于真菌细胞壁合成抑制 剂,是全新的一类抗真菌类药物。Fig.1是各类抗真菌药物作用机制示意图。 Fig.1 临床常用抗真菌药物种类及其作用机制 3 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用 研究 3 白念珠菌对唑类药物耐药机制 在上述各种抗真菌药物中,唑类药物因其不良反应小,口服生物利用度高,抗菌谱广 等优点,已成为治疗念珠菌感染的一线药物,在临床上使用广泛。但是,随着唑类药物长 期、大量使用,白念珠菌对其耐药性显著增高,且由于唑类药物仅具有抑菌作用,因此在 长期治疗和重复给药过程中,使真菌耐药程度越来越严重,这成为困扰临床的重要问题。国 外有文献报道白念珠菌对氟康唑敏感的菌株仅占30. 6%,且近年来白念珠菌耐药性的上升 趋势显著。重庆医科大学附属医院分析2003- 2005年临床标本分离的186株白念珠菌,发现 其对唑类药物耐药率从2003年的361 36%上升到2005年的63. 98%;中南大学湘雅医院临床 分离酵母样真菌对咪康唑、益康唑、酮康唑和氟康唑的耐药率分别由2002年的10. 3%、117%、1 2. 4%和101 3%上升至2005年的19. 9%、25. 0%、29. 2%和271 0%;湖南省肿瘤医院 肿瘤患者的真菌感染率及对抗真菌药物的耐药趋势分析结果示752株真菌对氟康唑、伊曲 康唑、益康唑、酮康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B和制霉菌素都表现出耐药 率升高的趋势, 其中对氟康唑的耐药率从2004 年的9. 2%上升到2006年的291 5%,对伊曲康唑的耐药率从 2004年的7. 7% 上升到2006年的281 5%。 目前研究表明,白念珠菌对唑类药物的耐药机制包括以下几个方面: (1)参与麦角固醇合成的酶变化:? ERG11基因的变化: 白念珠菌对唑类药物耐药的 主要机制之一是ERG 11基因突变,导致唑类药物与14α-脱甲基酶亲和力下降,和(或)该 [15] [16] 酶的过度表达 。White等 对从同一HIV感染者口咽部分离而来的白念珠菌的研究发现, 与敏感株比较,耐药株的14α-脱甲基酶发生R467K点突变,单一的R467K点突变足以引起 [17] 白念珠菌对氟康唑产生耐药 。此外,14α-脱甲基酶上的F126L、G129A、T229A、Y132H、 G307S 、 S405F等突变均能导致白念珠菌对氟康唑产生耐药;? 固醇合成途径中非ERG 11 基因的改变:唑类药物抑制14α-脱甲基酶后不但消耗麦角固醇,而且还能引起甲基化的固 醇蓄积,后者可抑制白念珠菌生长。在唑类药物存在的情况下,固醇合成途径 的改变能减 [18,19] 少上述固醇的蓄积,对唑类药物产生耐药 。 (2)外排泵过度表达:多数白念珠菌耐药的主要原因是真菌细胞内药物累积量的下降, 这与多种外排泵基因的过度表达相关。外排泵能将细胞内的药物排出细胞外,导致细胞内 药物浓度降低,从而不能有效抑制真菌生长。目前,与白念珠菌耐药相关的外排泵主要有 两大类,一类是ATP结合盒转运子(ATP Binding Cassette Transporters, ABC Transporters), 目前, 至少有7个CDR基因已完成鉴定及测序,但已证明与白念珠菌耐药相关的只有CDR1 和CDR2,它们依赖ATP进行主动转运,Sanglard等分别比较了光滑念珠菌氟康唑耐药株与 4 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 敏感株中氟康唑的积聚量,发现耐药株对氟康唑积聚量减少,其将耐药相关的不同基因片 段分别转入已敲除ATP结合盒转运子基因的酿酒酵母中,耐药率增加。Nakamura等发现白 念珠菌CDR1在缺失ATP结合盒转运子的酿酒酵母中呈高表达,可使含有该基 因的酿酒酵母 由对唑类药物由敏感转变为耐药;另一类是主要易化子(Major Facilitators, MF)超家族, 包括Mdr1p和Ful1p,它们通过电化学势能进行被动转运,这种蛋白的功能是依赖跨膜的电 化学梯度向细胞外泵出有害物质。有研究表明,在对唑类药物耐药的白念珠菌中,这两类 [20, 21] 外排泵过度表达 。 (3)真菌细胞膜的通透性降低:多效耐药调控蛋白(Pleiotropic Drug Resistance Protein, PDR蛋白)由PDR基因编码,基因PDR16和PDR17主要调控真菌细胞的脂质合成与转运, PDR16基因与真菌细胞膜上甾醇组成相关, PDR17基因则与真菌细胞膜上磷脂的组成相关, 若此类基因发生改变,真菌细胞膜上甾醇和磷脂的组成和比例也随着将生变化,从而影响 [22] 真菌细胞膜的流动性,使细胞膜通透性降低,使药物进入真菌细胞减少而产生耐药 。 [23] (4)甾醇代谢途径改变 :在唑类药物的选择压力下,一方面羊毛固醇生成麦 角固醇 的起始合成环节受阻,使麦角固醇合成减少;另一方面,羊毛固醇在14α-还原酶的催化下 5,6 生成14α-甲基化类固醇,后者由ERG3基因编码的? 去饱和酶催化下生成14α-甲基3, 6- 二醇。麦角固醇的缺乏和细胞毒性14α-甲基3, 6-二醇的积聚抑制了真菌的生长,但是部分 5,6 真菌由于ERG3基因发生突变,不能产生? 去饱和酶,致使14α-甲基3, 6-二醇的前体14α- 甲基类固醇在细胞内积聚,后者可以部分代替麦角固醇的功能,维持真菌细胞生长,从而 产生耐药。 (5)生物膜的形成:生物膜(Biofilm, BF)是指微生物粘附于固体或有机腔道表面, 形成微菌落,并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。真菌生物膜 内细胞的形态与浮游菌不同,且对药物的敏感性较低,同时此种形态的真菌常对抗真菌药 物表现出高度耐药性,其耐药机制可能与生物膜内真菌生长速率低或营养限制导致真菌表 形改变、胞外基质屏障所致药物渗透性减弱以及表面接触诱导膜特有的耐药基因的过度表 [24] 达有关。已有研究表明真菌细胞产生生物膜是导致真菌产生耐药的主要原因之一 。白念珠菌对唑类药物耐药是逐渐发展的,上述机制既可单独作用,又可多种机制共同 作用,通常情况下,白念珠菌对唑类药物高度耐药是多种耐药机制共同作用的结果。 4 针对唑类药物耐药所采取的策略 随着白念珠菌对唑类药物耐药性的显著提高,临床上对白念珠菌感染的治疗越来 5 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 越困难,因此,如何防治白念珠菌对唑类药物的耐药也受到越来越多的重视。目前针 [25] 对白念珠菌唑类药物耐药所采取的策略主要有以下几个方面 :(1)规范用药指证: 临床研究发现,间歇性、长期、低剂量用药可导致耐药的产生,为防止耐药,应严格杜绝 抗真菌药物的不合理应用。理论上持续性、短期、高剂量用药可降低耐药的发生率,然而 在药物的高选择压力下可能会出现耐药性更高的菌株;(2)加强新的抗真菌药物的研发, 如泊沙康唑、雷夫康唑等,然而新药的研发上市需要耗费大量的资金和时间,而且不 可能迅速大批的应用;(3)改进现有抗真菌药物的剂型,如两性霉素B脂质体的应 用,伊曲康唑静脉给药剂型的出现等;(4)加强联合抗真菌作用研究,寻找与现有 抗真菌药物具有协同作用的药物,包括不同机制的抗真菌药物之间及抗真菌药物与非 抗真菌药物之间的联合应用的研究。 近年来,鉴于抗真菌药物选择范围小、毒副作用较大、耐药性产生增加等多种 原因,抗真菌药物的联合应用越来越受到重视,己成为临床上抗真菌治疗的主要发展 [26] 方向之一 。抗真菌药物联合应用包括:不同作用机制的药物联合,不同抗菌谱的 药物联合,不同的药物稳定性和药动学特性药物的联合等,其优势在于:不同药物可 抑制真菌代谢的不同阶段而产生协同作用,例如特比萘芬与唑类药物的联合应用,这 两类药物都能抑制真菌细胞麦角固醇的生物合成途径,但作用靶点不同;一种药物作 用于真菌细胞壁或细胞膜而使另一种药物向细胞内渗透增多,例如FLC能破坏真菌细 胞膜从而促进利福平或喹诺酮类药物的吸收,使其更易进入菌体而干扰真菌DNA的 合成;作用不同的分子靶位,例如作用于真菌细胞膜和细胞壁,这种协同效果己被很 多研究者证实,如唑类与棘白菌素类药物的联合应用;药动学或药效学上具有互补作 用;可以减少用药剂量,从而降低药物的毒副作用;减少耐药的发生。目前,已有不 少学者致力于研究联合使用多种作用相同或不同的抗真菌药物以提高疗效,现已经获 得了令人满意的效果并且在临床广泛使用。 4.1 抗真菌药物之间的联合 由于不同种类的抗真菌药物的作用机制不同,因此联合用药可能有协同作用或相 加作用,且能减少单独使用药物的剂量及不良反应的发生。 (1)唑类与多烯类药物之间的联合 多烯类抗真菌药物,包括两性霉素B. 两性霉素B脂质复合物、制霉菌素等。此类 药物具有一条含双键的疏水侧链和一条含多烃基的亲水侧链,其双键侧链可 与真菌细 胞膜上的麦角甾醇相互作用形成甾醇-多烯复合物,使真菌细胞膜上形成许多微孔, 6 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 使细胞内大分子内容物溢出而起杀菌作用。同时,两性霉素B还可通过激活巨噬细胞 产生杀菌作用。但多烯类药物毒副作用较大,唑类药物利用其咪唑环或三唑环上的第 三位或第四位氮原子镶嵌在14α-去甲基酶的细胞色素P450蛋白的铁原子上,抑制14α- 去甲基酶的活性,使羊毛甾醇不能转化为14α-去甲基羊毛甾醇,导致真菌细胞死亡 [27-30] 。 (2)唑类与棘白菌素类药物之间的联合棘白菌素类抗真菌药物包括卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净等。它是葡聚糖合 成酶抑制剂,为一类新型抗真菌药物,可通过非竞争性抑制真菌细胞壁的β-1, 3-D- 葡聚糖的合成发挥杀菌作用。葡聚糖是真菌细胞壁的一种多糖,是真菌细胞壁的重要 组成成分,它可保持真菌细胞壁的完整性及渗透压的稳定性,其突出优点是 可与其他 [31,32] 抗真菌药物联合使用治疗难治性真菌感染且效果良好 。 (3)唑类与氟胞嘧啶类药物之间的联合5-氟胞嘧啶(5-FC)在其渗透酶的作用下可进入真菌细胞内,在细胞内胞嘧啶去 氨酶的作用下,脱去氨基形成5-氟尿嘧啶才,从而干扰真菌细胞脱氧核糖核酸的合成。 同时,还可以通过鸟苷酸UMP-焦磷酸酶转化为5-氟鸟苷酸FUMP ,进一步被磷酸 化后渗入到真菌RNA中,最终破坏真菌蛋白质的合成。因此,5-FU的抗菌作用机制 涉及嘧啶代谢、RNA和DNA的合成以及蛋白质的合成等过程。目前临床上很少单独 使用5-FC,往往将其与其他抗真菌药物联合使用。已有报道关于5-FC与FLC、KCZ、 [33] ITR等联合应用抗白念珠菌具有无关或者协同的作用 。 (4)唑类与丙烯胺类药物之间的联合丙烯胺类药物代表药物特比奈芬、布替萘芬。此类药物能竞争性抑制角鳖烯环氧 化酶,阻止鱼鲨烯转变成羊毛甾醇,使角鳖烯积聚,麦角甾醇合成受阻,影响真菌细 胞膜的结构和功能。特比奈芬与FLC或ITR联合应用抗白念珠菌具有无关或 协同的作 [34,35] 用,无拮抗发生,尤其对特比奈芬耐药的白色念珠菌特别有效 。 4.2 抗真菌药物与非抗真菌药物之间的联合 目前,国内外已有学者陆续发现一些自身基本无抗真菌活性的药物或化合物与唑 类药物联用时,可明显增强唑类药物的抗真菌活性。Sun等研究钙调蛋白磷酸酶抑制 [36] [2] [37] 剂环孢菌素A 、他克莫司(FK506) ,以及天然植物retigeric acid BRAB 等与 多种唑类药物在体外联合作用于白念珠菌的抗真菌活性,结果发现联合用药对抗白念 [38] 珠菌具有较强的协同作用。Quan 等 采用棋盘式微量液基稀释法测定FLC及盐酸小檗 7 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 碱联合作用于40株临床分离的氟康唑耐药白念珠菌的MIC值,结果发现FLC或盐酸小檗碱 单独作用时的MIC值都很高,抗白念珠菌活性都很弱,而当FLC和盐酸小檗碱联合使用时, [39] FLC的MIC值可降低32至1028倍,说明小檗碱对FLC具有很强的增效活性。Steinbach等 研究发现,FK506、环孢菌素A和西罗莫司在体内和体外均能抑制白念珠菌、新生隐球菌 和酿酒酵母的生长。显微观察亦发现钙调神经磷酸酶抑制剂可以抑制曲霉菌丝的生长,与 [40] 卡泊芬净合用具有协同作用。Kubo等 研究发现茴香烯可以大大增强依地酸(EDTA)对 酿酒酵母的抑制作用,加入100 μg /mL 茴香烯时EDTA的最低杀菌浓度(MFC)从400 μg [41] /mL降至200 μg /mL。Kubo等 还发现十一碳烯醛对酿酒酵母的抑制作用也可以被茴香烯 增强16倍,而山梨酸的抗菌活性可以被茴香烯增强8倍,即加入100 μg /mL茴香烯时山梨酸 的MFC从1600 μg /mL降至200 μg /mL,水蓼辣素的抗白念珠菌活性可以被茴香烯增加128 [42] 倍。Fujita等 发现当十二醇单独作用于酿酒酵母时,只有其浓度达到1600 μg/mL才表现 出抑菌作用,但当加入50 μg/mL茴香烯时十二醇即成为一种杀菌剂。 但是,上述药物或化合物在临床应用方面有其各自的局限性,例如FK506,环孢 菌素A其本身为免疫抑制剂,其毒副作用较大,RAB并非药物,这些都限制了它们在 临床的应用的可能性。 5 汉防己甲素概况及其作为唑类药物增效剂的研究进展 汉防己甲素(tetrandrine,TET),又称粉防己碱,是从防己科千金藤属植物粉 防己的块根中分离出的主要生物碱,其分子式为C H N O,是粉防己的主要有效成 38 42 2 6 分,属双苄基异喹啉类化合物(结构式见Fig.2)。药理研究表明:(1)TET 是一种 2 + 2 + 2 + Ca 通道阻滞剂,其能够阻滞质膜电压或受体依赖性Ca 通道,抑制细胞外Ca 内 2 + 流和细胞内Ca 动员,保护肝细胞、心肌细胞、神经细胞等免受毒性作用及缺血再灌 2 + 注损伤,能促进白血病细胞内Ca 动员,诱导细胞死亡;(2)TET 能够下调T细胞 蛋白激酶C信号传导途径,抑制T淋巴细胞增殖、白介素?分泌及T淋巴细胞激活抗原 的表达,且能破坏巨噬细胞的完整性,抑制其呼吸爆发和致炎因子释放;(3)诱导 肿瘤细胞凋亡;(4)下调P糖蛋白活性,逆转多药耐药;(5)抑制血小板源生长因 子诱导的肝星状细胞及肺成纤维细胞增殖及?型和?型胶原表达。因此,TET 具有 抗纤维化,降低门脉高压及肺动脉高压,抗炎,抗肿瘤等作用,在临床上有着广泛的 [43] 应用前景 。8 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 Fig.2 Chemical structure of tetrandrine研究发现,非细胞毒性剂量的TET在体内、外可逆转P-gp介导的多种多药耐药性(MDR) 细胞的耐药性,同时可诱导肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤细胞的活性。Xu等通过多中心的临 床实验的结果表明,TET联合柔红霉素、表鬼臼毒和阿糖胞苷治疗难治性、复发性急性骨 髓性白血病时,42%的患者获得完全缓解,25%的患者达到部分缓解,证实了TET可增强 抗肿瘤药物的疗效,为临床治疗提供了新的思路。本课题组在寻找唑类抗真 菌药物增效剂 方面做了大量的研究,通过对众多中药单体的筛选,终于初步发现TET对FLC在体内、外 抗白念珠菌有显著的增效活性。 [44] 李丰霞等 以来自同一亲本的对FLC敏感性不同的16 株白念珠菌为研究对象,通过体 外药敏实验发现,当TET浓度分别? 40 μg/mL、?2 μg/mL时,其与FLC联合使用可不同程度 地降低FLC对白念珠酵母相及菌丝相的MIC值,且增效作用呈剂量依赖性相关。利用流式 细胞仪检测加入TET前后,蓄积/外排实验中白念珠菌酵母相Rh123阳性细胞率的变化。结 果显示:加入TET后,白念珠菌酵母相Rh123阳性细胞率比未加入TET组显著升高,即Rh123 蓄积显著增多。同时利用荧光分光光度计测定并比较该组菌株细胞内Rh123荧光强度的变 化,结果显示与未加入TET组相比,加入TET的菌株细胞内Rh123平均荧光强度明显增高, 说明TET可减少白念珠菌酵母相对Rh123的外排。初步证实了TET可以减少白念珠菌对FLC 的外排,增强对FLC的敏感性。 [45] 王凯丽等 参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的M27-A,测定并比较KCZ单独及联合TET时对16 株白念珠 菌的MIC。同时采用菌落计数法绘制KCZ单独及与TET 联合时对白念珠菌的时间-杀 菌曲线。体外药敏实验结果显示,KCZ 单独及联合TET时对16 株白念珠菌的MIC值 范围分别为1~32 μg/mL,0.0038~0.25 μg/mL,差异有统计学意义;时间-杀菌曲线结 9 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 果显示:药物作用48h,KCZ 联合TET 时的活菌浓度均比单用等剂量的KCZ 时降低 2 log10 CFU/mL,其差异有统计学意义,进一步证实了TET在体外对KCZ抗白念珠 菌活性有增效作用。 [46] 石建萍等 研究了TET对KCZ抗皮肤癣菌的增效作用。实验将手足癣和体股癣患 者随机分为三组:(1)KCZ+TET组:霜剂内含2%TET 和2%KCZ;(2)KCZ组: 霜剂内含2%KCZ;(3)TET组:霜剂内含2%TET,治疗疗程分别是体股癣2周,手 足癣4周。治疗过程中每周随访一次,停药后2周、4周回访,分别观察临床疗效及微 生物学指标判断用药效果。结果显示,KCZ+TET组与KCZ组在临床表现评分差值比 较、临床疗效比较、微生物学疗效比较、总体疗效比较等方面,差异均有统计学意义, 且临床试验观察中均无严重不良反应发生。 [47] 向守宝等 参照CLSI M38-A方案测定TET单独及联合联苯苄bifonazole, BCZ, 对15 株红色毛癣菌的MIC值。结果显示BCZ单独及其联合40 μg/mL TET时,对15 株 红色毛癣菌的MIC值范围分别为0.25~1 μg/mL和0.0313~0.0625 μg/mL,经配对t检 验,有统计学意义(t 8.614,P 0.000),可以认为BCZ对TET在体外抗红色毛癣菌 活性有增效作用。 [48] 袁绍辉等 以同一亲本来源且对FLC敏感性不同的16株白念珠菌的菌丝相为研 究对象,TET作用前,MDR1和CDR1在FLC耐药株和剂量依赖敏感株中的表达 量高于 均敏感株,差异具有统计学意义;TET作用24小时后,CDR2在耐药株中,FLU1在剂 量依赖性敏感/耐药株中,MDR1、CDR1在敏感/剂量依赖性敏感/耐药株中,表达量低 于作用前,差异有统计学意义。TET作用前ERG11表达水平在FLC敏感株/剂量依赖性 敏感株/耐药株中有异,差异有统计学意义;TET作用24小时后,ERG11 在敏感株/ 剂量依赖性敏感株中表达量低于TET作用前,差异有统计学意义。 [49] 张丁等 以1株须癣毛癣菌标准株构建豚鼠皮肤癣菌病模型,将造模成功的50只豚鼠 随机分为5组,分别涂用1%益康唑(econazole, ECZ) + 1% TET(ECZ + TET 组)、 1% ECZ (ECZ 组)、1% TET(TET 组)和霜剂基质(基质组),每天1 次,连续7 天;空白对 照组不涂任何外用药物。实验从皮损表现、病原学、病理学三方面观察TET对ECZ抗须癣 毛癣菌是否有增效活性。结果显示,ECZ单独及联合40 μg/mL TET时,15 株红色毛癣菌的 MIC值范围分别为0.250~2 μg/mL和0.0313~0.0625 μg/mL,差异有统计学 意义。豚鼠皮肤 癣菌病的模型在涂用1% ECZ + 1% TET霜、1%ECZ霜、1% TET霜、霜剂基质的第2天起, ECZ + TET组和ECZ组的皮损评分逐渐下降,TET组、基质组和空白对照组的皮损评分逐 10 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究 渐上升,5组间皮损评分差异有统计学意义。与其它组相比,ECZ + TET组皮损毛根侵犯试 验、皮损直接接种法的培养阳性率明显降低;菌落形成单位计数法的培养阳性数明显减少。 病理组织中真菌菌丝和孢子、炎症反应和组织破坏程度明显减轻。综上所述,我们已经初步证明,TET在体外可以增强FLC,KCZ抗白念珠菌以及 BCZ、ECZ抗毛癣菌属的活性,且其在小鼠体内可以增强FLC抗白念珠菌的活性。其 机制可能是TET在转录水平可抑制白念珠菌药物外排泵基因MDR1、FLU1、CDR1、 CDR2和唑类药物作用靶酶基因ERG11的mRNA表达。 6 抗真菌药物体外药敏实验研究进展 抗真菌药物体外敏感性实验是测定致病真菌对抗真菌药物的敏感性或是测定抗真菌药 物对致病真菌的抑制活性的实验方法,其经历了不同的发展过程。目前较常用的体外联 合抗真菌作用实验方法有: (1)棋盘式微量液基稀释法:美国临床与实验室标准协会(CLSI,旧称美国临床 实验室标准化委员会,NCCLS)于 1997年推出了关于酵母菌的液体培养基稀释法全 量法与微量法抗真菌药物敏感性试验方案 M27-A,在此基础上又分别于 2008年, [50] [51] 2012年推出了新版方案 M27-A3 ,M27-S4 ,该系列方案准确性高、重复性好, 实验室间结果的一致性较为理想,应用此方法可获得药物作用于受试菌的静态抗真菌 效果。参照 M27-A3,M27-S4方案测定药物联合用药的体外药效时,通常采用棋盘式 微量液基稀释法,即棋盘法。该方法是在同一 96孔平板上将两药 MIC的倍比稀释系 列进行交叉配合,形成多个浓度组合,然后在 96孔平板各孔中加入一定浓度的受试 菌液,同时设生长对照孔,经过适当时间的培养对结果进行判读,将各实验孔与生长 对照孔中真菌的生长情况进行比较,获得生长抑制百分数。MIC(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)值为抗真菌药物能够抑制真菌 生长的最低浓度,根据所测药物及菌种的不同,MIC终点的定义也有所不同。由于 唑类药物是抑菌剂,对一些真菌常常存在“拖尾”现象(即当药物浓度大于 MIC时, 依然有少量真菌持续生长的现象)发生,造成了药敏结果终点判断不明确。目前,一 般以抑制 80%真菌生长的最低药物浓度作为 MIC值,这种终点判读方法使得实验结 果具更好的重复性和一致性。 11 暨南大学硕士学位论文 汉防己甲素与唑类药物的体外联合抗真菌作用研究棋盘法的实验结果以往常用视觉法进行判读,但由于唑类药物的“拖尾”现象 及其他一些主观因素,导致视觉法判定 MIC值缺乏客观性和准确性。目前实验室中 常用 OD值测定法,即以酶标仪测定 96孔平板中各孔的 OD值,将其减去空白对照 孔的 OD值,再除以生长对照孔的 OD值,即可得到各药物联合作用孔内真菌的生长 百分数,即真菌生长百分数(各孔中的 OD值-空白对照孔中的 OD值)/生长对照孔中 的 OD值-空白对照孔中的 OD值 ×100%,真菌生长抑制百分数1-真菌生长百分数。 在评价药物联合作用结果时,应用最为普遍的理论分别是 LA理论与 BI理论。 基于 LA理论的方法包括分数抑菌浓度指数(Fractional Inhibitory Concentration Index, FICI法;基于 BI理论的有生长率差值(Difference between the predicted and measured fungal growthpercentages,ΔE)法,其中 ΔE为真菌的理论生长率与实际生长率之差。以酶标仪测定 OD值确定抗真菌活性,继而以 FICI法和 ΔE等方法进行联合作 用评价为国际上新近推出的方法,其优点在于更加方便、准确、客观,能够消除人为 误差,为联合抗真菌作用的评价提供了新的方案。 (2)时间-杀菌曲线法 时间-杀菌曲线法能够测定药物抗真菌活性的速度和程度随时间的变化,应用此 方法可获知不同时间点药物的动态抗真菌活性。该方法是将一定浓度的菌悬液暴露于 不同浓度的药物组合,于预先设定的时间点取样,通过绘制一段时间内所测药物的时 间-杀菌曲线,从而评价联合用药药效。这一方法普遍应用于抗菌药物杀菌活性的测 定,近年来的研究集中在以其测定抗真菌药物单用或联用的效果。时间-杀菌曲线法 可提供以下信息:药物抗菌活性的速度和程度;药效学参数,如浓率-效应关 系及后 [52] 效应 。 菌落计数法是经过一定的培养时间,真菌细胞经适当稀释后接种于琼脂上,再 培养使之生长,测定叫同时间点每毫升的菌落数量,绘制所测定药物的时间-杀菌曲 线。该法的不足之处是依靠菌落形成单位(Colony forming units, CFU)计数来指示真菌 的生长情况。这一操作的前提是所计数的菌落是由菌液中的单个活细胞生长而来,用 于细菌计数时效果良好,因为对细菌而言,其菌悬液是以单个细胞的形式存在的,但