病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法 21P(可编辑)

病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法 21P(可编辑) 病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法 21P 病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法练习内容1(小白鼠脑内接种法2(小白鼠滴鼻感染法3(鸡胚尿囊腔接种法目的要求1(了解病毒分离的方法2(了解病毒接种的实验途径3(掌握鸡胚尿囊腔接种的方法与尿囊液收获的方法病毒的分离一、标本采取的原则二、标本的处理三、病毒的分离方法一、标本采取的原则1. 病毒标本的采取应尽早为好. 2.由于大多数病毒对热不稳定，应该立即接种，如果不能及时接种或需保存，一般置50,甘油盐水4?或一20?以下保存。二、标本的处理(一)除菌处理粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4?过夜。鼻咽拭子一般加抗生素最终 /毫升，置4?作用4小时。对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠浓度为2000单位 道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4?过夜除菌。(二)研磨和稀释对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液(PH7.6 肉汤或10,脱脂牛乳生理盐水或0.5,水解乳蛋白Hanks 液)制成组织悬液，然后经2000转,分离心20分钟。必要时可加抗生素处理(同上)。病毒的分离培养的方法动物接种法鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法组织培养与病毒的细胞感染法动物接种法动物接种是最原始的病毒培养方法，常用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、家兔，有时也用猴、猿、猩猩等。接种时要根据病毒对动物，组织细胞等嗜性不同而选择特定的部位，如鼻腔、皮内、皮下、腹腔、脑内、静脉等(见12―2)。小白鼠脑内接种法(示教)【】1.脑炎病毒(小白鼠脑脊髓炎)悬液:脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加100,脱脂奶水研磨成10毫升悬液，离心沉淀30分钟，吸取上清液。2.小白鼠:3周龄，体重6―8克。【方法】1(1毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。2(取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指握住小白鼠 的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的体部。3(右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颊部皮毛4(右手拿住注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向注入，进入颅腔，进针2―3毫米，不要插得太深，注射量为0.02―0.03毫升。5(注射完毕，将用过的注射器煮沸消毒，动物一般在3―4天开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。小白鼠滴鼻感染法(示教)【材料】小白鼠、流盛病毒的鼠肺适应株悬液、无消毛细吸管、无菌小试管、乙醚、棉球及动物罐等。【方法】1(首先将小白鼠1只投于带盖的，内放有浸蘸乙醚的棉球的容器内行全身麻醉。注意麻醉的深度，一般不宜太深或太浅，太深时易遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太浅则易在滴注时打喷嚏。2(用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食指抓住耳部使其头部朝前并呈仰卧位置，另一手将吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴于管口而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴靠至动物鼻尖，动物在呼吸时带人，一般滴入0.03―0.05毫升，不宜过多，感染材料如被吸人肺内，容易引起动物肺水肿，往往于接种后一天内死亡。3(动物慢慢苏醒，在罐中逐日观察，通常在数日后开始发病，发病的症状常为耸毛，咳嗽、不食、甚至死亡，解剖可观察到肺脏有肺炎或出血性病灶。鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法一、鸡胚的孵育(一)鸡卵的选择一般都选新鲜、10天以内莱亨鸡(Leghorn bird)的受精卵以保证规格质量上的一致(二)孵育孵育时可将鸡卵放人卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39?，相对湿度为40―70,，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1―2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。(三)检卵鸡卵孵育4,5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况(二天一次)。1(未受精鸡卵:在检卵器上仅见到模糊的阴影。2(活鸡卵:鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点(鸡胚)，有明显的自然转动。3(死胎:如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。尿囊腔接种【材料】新城鸡瘟病毒10毫升稀释液，10―12 日龄鸡胚，卵垫，1毫升无菌注射器及14号针头，小锉了刀，橡皮乳头、大头针，眼科镊子及小镊子，无菌培养皿、无菌生理盐水，碘酒，酒精棉球。【方法】选9―11日龄鸡胚，照检后划出气室和胎位，在气室边缘上2―8毫米处避开血管作一标记，将碘酒在此消毒后，用蛋钻钻一小扎(勿损伤壳膜)，用注射器注入病毒0.1―0.2毫升，然后用溶化石蜡封口，置33―35?孵育(时间见表12―6)。(2)剖检及收获收获前鸡胚应置4?冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去，(不要将碎片落入壳膜)。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，(切勿压破卵黄囊)再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。三、病毒的检查(一)直接检查法1(痘疱的形成2(鸡胚死亡(二)间接检查法二、病毒的鸡胚接种、培养与收获(一)接种实验室经常应用的接种途径有四种:绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔和卵黄囊接种 等。(见表12―6)* *