人谷氨酰转移酶(GGT)酶联免疫分析试剂盒

人谷氨酰转移酶(GGT)酶联免疫试剂盒 人γ谷氨酰转移酶(GGT)酶联免疫分析试剂盒 使用书 产品编号:E1375h TMUSCNLIFE www.uscn-life.com 本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中γ谷氨酰转移酶(GGT)含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗GGT抗体的微孔中依次加入标本或品、生物素化的抗GGT抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GGT呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板:一块(96孔) 2. 标准品(冻干品):2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后静置10分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进 行倍比稀释)后，分别稀释成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L， 3.12 U/L，样品稀释液直接作为标准浓度0 U/L，临用前15分钟内配制。如配制100 U/L 标准品:取0.3ml (不要少于0.3ml ) 200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的 Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液:1×20ml。 4. 检测稀释液A:1×10ml。 5. 检测稀释液B:1×10ml。 6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算 好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测 溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7. 检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶 液A。 8. 底物溶液:1×10ml/瓶。 9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液:1×10ml/瓶(2N HSO4)。 2 11. 覆膜:5张 12. 使用:1份 自备物品 1. 酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热) 2. 微量加液器及吸头，EP管 3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸 标本的采集及保存 1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4?过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可 检测，或将标本放于-20?或-80?保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8? C 1000 x g离心15 分钟，或将标本放于-20?或-80?保存，但应避免反复冻融。 3. 细胞培养物上清或其它生物标本:请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本 放于-20?或-80?保存，但应避免反复冻融。 注:以上标本置4?保存应小于1周，-20?或-80?均应密封保存，-20?不应超过1个月，-80?不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 实验开始前，各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37?溶解);试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。 1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标 准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔 壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37?反应120分钟。为保证实验结果有效性， 每次实验请使用新的标准品溶液。 2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100μl(在使用前一小时内配制)， 酶标板加上覆膜, 37?反应60分钟。 3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔， 甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。 4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl，酶标板加上覆膜37?反应60分钟。 5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干 (也可轻拍将孔内液体拍干)。 6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37?避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标 准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。 7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底 物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。 注: 1. 试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。 2. 加样:加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。 3. 孵育:为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。 4. 洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔 中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。 5. 试剂配制:Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。 6. 反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。 7. 底物:底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。 洗板方法 1. 手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。 2. 自动洗板:如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的人GGT，且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算 以标准物的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)，在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 检测范围:3.12 U/L - 200 U/L 最低检测限:0.78 U/L 说明 TM1. 只有全部使用USCNLIFE试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其 TM他制造商的产品。只有严格遵守USCNLIFE试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。 2. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂 避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 3. 试剂盒保存:短期(1周以内)以标签上的标示为准，长期保存请将试剂全部保存于-20?。 4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 5. 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 6. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 7. 有效期:6个月。 8. 本操作说明适用于48T试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。