改良焦性没食子酸法培养厌氧菌

改良焦性没食子酸法培养厌氧菌 改良焦性没食子酸法培养厌氧菌 袁桂秀, .. 林.. 晨, .. 江振友, .. 黄环珍 ( 暨南大学医学院微生物和免疫学教研室, 广东广州510632) 关键词: .. 焦性没食子酸法; .. 厌氧菌; .. 培养基 中图分类号: .. R378.. .. .. 文献标识码: .. A.. .. .. 文章编号: .. 1000- 9965( 1999) 04- 0024- 02 .. .. 目前厌氧菌分离培养法主要有焦性没食子酸法、厌氧气袋法、厌养缸法和厌养培养箱法[1] 。厌养缸和厌 养培养箱法需要一定设备或特制设备, 因而其应用受到一定限制。焦性没食子酸法或厌氧气袋法进行厌养菌 分离培养, 由于其方法简单、操作容易, 在大专院校微生物教学或基层医疗单位仍广泛使用, 但分离效果不易 控制。为此, 本实验室在教学实践中, 通过改良焦性没食子酸法分离培养厌养菌, 分离出的菌落及溶血明显好 于普通焦性没食子酸法或厌养气袋法。现总结如下。 1 .. 材料与方法 ( 1) 普通焦性没食子酸法: 将厌氧菌接至血琼脂平皿上, 在该平皿盖的外侧面中央放直径4 cm 左右的圆 形纱布两层, 其上放焦性没食子酸0..2 g 再盖同等大小纱布两层, 然后加质量分数 ..5 mL, 迅 10%NaOH 溶液0 速将平皿倒置于其上, 平皿周围用溶化石蜡封闭, 放37 .. 培养24~ 48 h 后取出观察。 ( 2) 改良焦性没食子酸法: 于上述普通方法基础上, 在血琼脂平皿配制和培养用化学品的组成方面加以改 良, 一是用滤纸制成小袋, 袋内含适量碳渣代替纱布或棉花; 二是用无水碳酸钠代替氢氧化钠; 三是在配制血 琼脂平皿时, 加入少量葡萄糖, 终质量浓度为2 g/ L。其方法为先用滤纸制成小袋3 cm .. 5 cm, 每袋含量为焦 性没食子酸0..5 g、无水碳酸钠0..5 g 、碳渣2..5 g, 分别研磨成碎粉, 临用时再混合, 装入袋内, 胶水封闭, 将袋放 入该平皿盖的外侧面中央, 迅速将平皿倒置于其上, 其余方法同上。 2 .. 结果 .. .. 厌氧菌在普通焦性没食子酸法培养基中, 经37 .. , 培养48 h 后, 破伤风杆菌在血平皿上分离出单个不规 则形菌落, 有明显溶血环。但放置室温48 h 后, 整个平皿溶血, 溶血环消失, 平皿内水分较多。产气荚膜杆菌 在培养24 h 后, 分离出单个菌落, 有明显溶血环, 但典型双层溶血环不太明显。 破伤风杆菌在改良的焦性没食子酸法培养基中, 经37 .. , 培养48 h 后, 血平皿上分离出非常典型的单个 不规则菌落, 中心紧密, 四周疏松, 边缘不整齐, 有明显溶血环, 环呈多角形。产气荚膜杆菌在培养24 h 后, 明 显分离出单个菌落, 直径2~ 5 mm, 半透明, 表面光滑, 边缘整齐, 在血平皿上可见清晰的双层溶血环, 内环完 全溶血, 外环不完全溶血, 放置室温48 h 后仍保持典型培养特性[ 2] 。 3 .. 讨论 .. .. 从改良前后培养厌氧菌比较可以看出, 改良后在血平皿上培养破伤风杆菌能分离出非常典型的单个不规 则形菌落, 有明显溶血环; 产气荚膜杆菌在培养24 h 后, 明显分离出单个菌落, 在血平皿上可见清晰的双层溶 血环, 内环完全溶血, 外环不完全溶血, 在鉴别厌氧菌上具有重要意义。特别是培养好后的平板, 可以在无菌 .. 收稿日期: .. 1999- 03- 29 .. .. .. 作者简介: .. 袁桂秀( 1964~ ) , 女, 湖南衡阳人, 助理实验师.. 第20 卷第4 期 1999 年8 月.. .. .. .. .. .. 暨南大学学报( 医学版) .. .. Journal of Jinan University(Medicine Edition) .. .. .. .. .. Vol. 20 No. 4 .. Aug. 1999 室持续存放3~ 5 d, 其内化学品袋无出水现象。给学生示教能达到极好的效果, 很好地解决了实验室准备工 作重复繁琐的问题。改良前培养厌氧菌典型生长特征重复性较差, 且存放时间短, 影响了教学效果。通常普 通焦性没食子酸法[ 1] 由于化学反应发生快, 要求操作很快, 因此造成平皿厌养条件难以控制, 培养结果不稳 定。为了使焦性没食子酸充分反应, 所加碱量必须过量, 过量碱液流动也造成观察不便。另外, 中和反应后剩 余的碱液能吸收CO2 [3] , 而CO2 是刺激小量接种物所必需的因素, 缺乏了它会使细菌生长受到抑制。为此, 我 们采用无水碳酸钠替代氢氧化钠, 使反应缓慢进行。一方面可避免CO2 含量减少, 另一方面可使化学反应中 生成水分减少, 从而有利于观察。在改良中加入碳渣, 主要目的是吸收化学反应中生成的水分, 另外还可延缓 化学反应。在溶血性控制方面, 主要在血平板制备时, 在培养基中加入少量的葡萄糖, 可以稳定红细胞膜, 防 止过度溶血, 控制溶血环的扩大, 可以减缓破伤风杆菌菌落在培养基表面迁徒扩散。 还 除了上述改良措施外, 可用硬一些的琼脂血平皿, 在减缓菌落蔓延生长方面效果更好。另外倒培养基时不可过厚, 以0..2 cm 为宜, 所用血应为新鲜健康的兔血, 血量在10%左右, 这样不但菌落典型, 而且又便于观察溶血环, 能达到预期效 果。 .. .. 采用此方法时要注意在配制血琼脂平皿时, 加入葡萄糖的量控制在终质量浓度为2 g/ L, 否则培养时溶血 环不明显; 培养用化学品的组成控制在焦性没食子酸与无水碳酸钠之比为1..1 范围为宜; 滤纸制成小袋面积 不能超过平皿1/ 2, 否则不易观察结果; 注意培养基表面不能与化学品接触。我们体会本法虽然在准备工作 方面略显繁琐, 但在没有厌氧培养箱设备条件下仍能达到满意结果。 参考文献: [ 1] .. 张子慷, 何光泽.. 医学微生物学与免疫学实验教程[M] .. 成都: 四川科学技术出版社, 1989.. 91~ 93.. [ 2] .. 闻玉梅.. 厌氧性细菌.. 见: 陆德源主编.. 医学微生物学[M] .. 北京人民卫生出版社, 1996.. 118~ 124.. [ 3] .. 陆光裕.. 有机化学[M] .. 北京: 人民卫生出版社, 1985.. 205~ 210.. 第4期袁桂秀等: .. 改良焦性没食子酸法培养厌氧菌2..5 ..