人胎盘组织造血干-祖细胞的分离富集

人胎盘组织造血干-祖细胞的分离富集 人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集 作者: 章涛，陈代雄，方宁，刘祖林，祁莹，刘金伟【摘要】 为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞(HSPC)的标化，采用机械法加胶原酶消化法制备人胎 盘组织单个细胞悬液，用羟乙基淀粉(6% HES)法从中分离出单个核细胞 (MNC)，再经免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+ 3个 细胞亚群，用流式细胞术对各阶段分选细胞进行型分析并计算分选细胞的富集度 和回收率。结果表明: 机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞(MNC)数达(12.30?3.51)×108，与脐血初始样品所含的MNC数(8.86?5.38)×108 比较差异无统计学意义，而其CD34，细胞所占百分率,(3.93?2.31)%,则明显高于脐血,(0.44?0.29),,。胎盘组织单个细胞悬液经6% HES分离后MNC和 CD34，细胞的回收率分别为(45.3?11.7),和(5 1.1?9.8)%;MNC经免疫磁珠分选后，其CD34，细胞的纯度和回收率分别为 (73.4?14.1),和(52.7?11.7)%。结论: 本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯化可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC，为进一步研 究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集。 【关键词】 CD34抗原;造血干细胞;胎盘;免疫磁珠细胞分选;脐 血 Isolation and Enrichment of Hematopoietic Stem/ Progenitor Cells from Human Placenta Tissue AbstractThe aim of this study was to establish the standard protocols for isolating and enriching hematopoietic stem/ progenitor cells (HSPC) from human placenta tissue (PT). Single-cell suspension from of human PT was prepared by mechanical method bined with collagenase digestion. Mononucleated cells (MNC) derived from PT were separated by hydroxyethyl starch (6% HES), then the three cell subsets of different immunophenotypes (CD34-,CD34+CD38-, CD34+CD38+) contained in MNC were isolated by Magnetic Activated Cell Sorting (MACS). The cell immunophenotype of each sorting steps was analyzed by flow cytometer (FCM). The cell enrichment and recovery rate of each sorting step were calculated. The results showed that MNC could be harvested up to (12.30?3.51) ×108 from a single-cell suspension of human PT by mechanical method and collagenase digestion, no significant difference existed as pared with umbilical cord blood (UCB) initial sample ,(8.86?5.38) ×108,, but the percentage of CD34+ cells in MNC of human PT was (3.93?2.31)%, much higher than that in UCB ,(0.44?0.29)%, (P0 001). recovery rate of MNC and CD34+ cells from PT after separation with 6% HES were (45.3?11.7)% and (5 1.1?9 8)% , respectively. After MNC being sorted by MACS, the enrichment and recovery rate of CD34+ cells in CD34+ group were (73.4?14.1)% and (52.7?11.7)% respectively. It is concluded that the protocols established here for isolating and enriching hematopoietic stem/progenitor cells from human placenta can acquire HSPC with high abundance, enrichment and viability and may be a useful reference of isolating methods for future related study. Key wordsCD34 antigen; hematopoietic stem cell; placenta; MACS; umbilical cord blood 造血干/祖细胞(hematopoietic stem/ progenitor cells， HSPC)存在于人骨髓 、动员的外周血和脐血等组织中,1-3,。新近，有学者提出人胎盘组织中含有比脐血更为丰富的造血干细胞,4,;人胎盘组织中CD34+ HSPC的百分率是脐血的8.8倍，并且人胎盘组织中免疫细胞成分较少，极有希望成为今后HSPC的新来源,5,。从人胎盘组织分离出高活性、高丰度的HSPC是对其进行相关生物学特性等研究的前提，目前尚无有关人胎盘组 织HSPC分离的优化方案可循。本研究旨在建立从胎盘组织中分离、纯化HSPC的标化流程，为今后人胎盘组织HSPC的深入研究打下良好的基础。 材料和方法 主要试剂 胶原酶(collagenase ?)、羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch， HES)为 Sigma公司产品。RPMI 1640、新生牛血清(FCS)购自于Gibco公司。荧光标记单克隆抗体CD38-FITC、CD34-PE及CD34绝对计数试剂盒为Becton Dickinson公司产品。免疫磁珠细胞分选试剂盒购自Miltenyi Biotec公司。 胎盘与脐血的收集 收集足月分娩的人胎盘，同时采集同一胎盘的肝素抗凝脐血，HBsAg(-)，共5份。胎盘和脐血均于6小时内进入分选程序。 胎盘组织单个细胞样品的制备 多点剪取胎盘全层组织约80 g，用Hank液反复漂洗，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，将其剪碎，再用Hank液漂洗3次。加入0.025,胶原酶消化20分钟，用不锈钢网过滤，细胞滤液260×g离心5分钟，细 00 ml RPMI 1640悬浮混匀。 胞沉淀用1 人胎盘组织单个核细胞(MNC)的分离 胎盘组织单个细胞悬液按4?1的比例加入6%羟乙基淀粉(6% HES)，混匀, 22?下静置45分钟至红细胞完全沉降。吸取富含单个核细胞的上层液，按1?3的比例加入Hank液， 400×g 离心8分钟。 弃上清，沉淀物用2 ml 含15% FCS的RPMI 1640悬浮，再按1?3的比例加入RBC裂解液，作用5分钟。 260×g离心5分钟，细胞沉淀物用含15% FCS的RPMI 1640洗涤、悬浮，经350目尼龙膜过滤。镜下计数MNC细胞，台盼蓝染色观察细胞活力(细胞活力应90%)。MNC细胞样品进行FCM分析，并作为磁式分选的起始样品。脐血按1?1的比例加入Hank稀释后，同上述6% HES法分选MNC。 CD34，细胞及其亚群的免疫磁珠分选 按照免疫磁珠细胞分选试剂盒推荐的分选策略，分选胎盘和脐血MNC为CD34+和CD34-细胞组分，进而再将CD34+细胞组分分选为CD34+CD38+、CD34+CD38- 2个细胞亚群。 细胞样品的流式细胞术分析 调整待测样品细胞浓度到1×106/ml，于含20 μl相应荧光标记单克隆抗体(CD34-PE、CD38-FITC)的上样管内加入100 μl细胞悬液，混匀，室温避光静置20分钟。每管加入2 ml RBC裂解液，混匀，室温静置10分钟， 180×g 离心5分钟，弃上清，重新悬浮细胞。每管加入2 ml含0.1, NaN3 的PBS,混匀， 180×g离心5分钟，弃上清，再悬浮细胞;每管加入0.5 ml 1,的多聚甲醛，混匀，2-8?避光放置，逐一上机分析。绝对计数则将细胞样品置于含微球的TruCOUNT管，其样品制备方法按试剂盒(ProCOUNTTM Progenitor Enumeration Kit)说明进行。采用Cell Quest软件对标记样品进行检测分析。单个核细胞和CD34+细胞绝对计数用ProCOUNT软件采集(每管采集2×104个细胞)和分析。MNC及CD34+细胞的回收率和富集度按下面计算 ,6,: CD34+(MNC)细胞回收率(%)=,分离产物的总细胞数×产物的CD34+(MNC)细胞纯度/起始标本CD34+(MNC)细胞总数,×100%CD34+(MNC)细胞的富集度(%)=,分离产物中CD34+(MNC)细胞数/分离产物的总细胞数,×100%统计学分析 实验数据采用统计软件SPSS for Windows 10.0进行处理。如方差齐，采用t检验对各组样本之间进行两两比较;如方差不齐，则采用t‘ 检验。