大鼠视交叉上核内主要的三种肽能神经元的分布

大鼠视交叉上核内主要的三种肽能神经元的分布 大鼠视交叉上核内主要的三种肽能神经元 的分布 l2L一324,3 z?.…zz? 大鼠视交叉上核内主要的三种肽能神经元的分布 操高原陈文玉只' 华西医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室(成都610041)(妄7,-2l弓 内容擒要为研究视交里上棱内主要肽能神经元的分布情况,选用健康成年雄性SD大鼠5其,以免疫组化双 重及三重标记技术,对太鼠视交叉上桉(SCN)内血管活性肠多肽(VIP),精氪酸血管加压素(AVP)及生长抑素 (50M)样三类神经细胞群的分布进行了观察=免疫染色以ABC法进行,呈色底物采用DAB,TMB及4?氯一1一萘酚. 结果显示:在SCN头中尾三段,三种肽能神经元的数量及分布均存在差异;VlP与AVP样细胞群之间并不是截然 分界.其相交处一狭窄区由三种脓能神经元混杂在一起,交错重叠.上述发现为SCN机能学的研究提供了新的形 态学依据.V工P 关键词枧交叉上棱盘昔活性橱童然精氨酸血管加压寨生长抑寨免疫组织化学大鼠—— 一殛 DistributionofPeptidergicNeurottsI?theRatSuprachiasmaticNuclehsWangLet,OuKoqun,C?Gaoyucm, ChenWenyu.DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofBasicMedicalSciences, WCUMS,Chengdu 610041 AbstractThedistributionofthepepridergicneuronsinthesuprach[asmaticnucleus(SCN)inf iveadultmale SDratswasexaminedbymulti— immunolabellingforvasoactlyeintestinalpolypeptide(VIP),argJninevasopress[n (AVP)andsomatostatin(SOM).The[mmunoreactionswerevisualizedwithanEliteABCKit(VectorLab).The substratesintheperoxidasereactionwerediaminobenzidine(DAB),tetramethylbenzldine(TMB)and4.chloro.1. naphto1.TheresultsshowedthatthedifferencesindistributionandpopulationofVIP,AVP?andSOM?like vleuroi3sexistedintherostra[,intermediateandcaudalregionsoftheSCNandtheseneuronswereoverlappedand SOM—Iikeneurot/s~,Ter6scatteredamongthemintheare8betweenVIP.andAVP— likenellronsThesefindings mayprovidenewmorphologJcevidencesforexplainingthefunctionalmechanismintheSCN. KeywordsSuprachiasmaticnucleusVasoactJveintestinalpolypeptideArgininevasopressin SomatostatinImmunohistoehemistryRat 视交叉上核(SCN)为位于下丘脑第三脑室底视 交叉背侧的头尾方向呈长条形的神经核团,由密集 的小细胞神经元组成.核团内主要包含有血管活性 肠多肽(VIP),精氨酸血管加压素(AVP)及生长抑 索(sOM)样的三类神经细胞亚群,它们分别位于 SCN内的特定区域:VIP样神经元主要位于腹外 侧,AVP榉神经元主要位于背内侧,而SOM样神 经元散在于两者之l可【.这三类神经细胞在SCN 内分布有无交错重叠,在SCN的不同节段它们在数 量和配布上有无差别,迄今未见详细报道,而且也未 见在同一平面同时观察这三类神经细胞的报道.由 此,我们采用免疫组化双重及三重标记技术,较详细 地研究了SCN向上述三类神经细咆群的分布情况 *高等学棱博士学科点专项基盘资助 1材料和方法 健康成年雄性SD大鼠5只,于处死前24,48 小时侧脑室内注射秋水仙素(50~g/101)Zambonis 固定液(fi-2.5多聚甲醛,0.2苦味酸)灌注固 定.AO恒冷箱切片机作冠状连续切片,片厚2Opm, 依次间隔取片,分成两套,分别进行免疫组化双重和 三重标记染色.免疫染色用兔抗VIP(1:6000, INC),兔抗AVP(I:4000,CHE)和兔抗SOM(1t 2000,INC)血清为一抗的ABC法进行(ABC药盒 为Vector实验室产品).抗体的染色特异性经空白, 置换及吸收等对照实验所证实.免疫双标具体过程 依次为:?于含0.3TritonX一100,10正常羊血 清(NGS)的0.05mol/LPBS中室温下孵育3O分 钟;?第一套一抗(用1NGSPBS稀释)37?孵育 2小时,室温过夜i?Biotinlated—IgG(1:200)37C ,/ /,?V 3期王蕾等.大鼠视交叉上棱内主要的三种肚能神经元的分布 孵育1小时;?ABC复合物(1:100)37?孵育1.5 小时;?DAB呈色(棕色);?第二套一抗37c孵育 2小时,室温过夜;?BiotinlatedIgG(1:200)37C 孵育1小时;?ABC复合物(1:100)37c孵育1.5 小时;?TMB—ST法呈色(绿色);@裱片,梯度乙 醇脱水,二甲苯透明,树皎封片.以上各步骤之间均 用PBS充分洗涤免疫三标过程是在上述双标两套 染色之间增加另一套染色,仍然是ABC法,但用4一 氯一1一萘酚呈色(黑色)三标的切片裱片后不经脱水 透明,直接用DPX封片, 2结果 21抗VIP与抗AVP血清相结合的免疫组化双 重反应结果 光镜下可见免疫染色后的SCN位于第三脑室 底视交叉背侧,左右对称,与周围脑区分界清楚. VIP样神经元显示为棕色,AVP样神经元显示为绿 色.均为小细胞神经元.在SCN头段,核团内VIP 及AvP样神经元数量均较少,VIP样神经元分布 于腹侧,AVP样神经元分布于背侧(图1a);在SCN 中段,核团内VIP及AVP样神经元数量均增多, VIP样神经元主要位于腹外侧份,AVP样神经元主 要位于背内侧份(图1b);在SCN尾段,桉团内神经 元数量减少,以VIP样神经元数量减少更为显着, VII'样神经元散在于外侧,AVP样神经元聚集于内 侧(图lc).无论在SCN头段,中段和尾段,VIP与 图1太鼠视交叉上接(SCN),免疫组化双重标记法染色(')vIP样神经元(棕色),(alk)AVP样神经元(绿色),?V;第三脑室,O42:柳交叉 HE×200la:SCN头段,lb:SCN中段,lc:SCN尾段.图2太鼠视交叉上按,免疫组化三重标记法染色.(十)SOM样神经元(棕 色),(?);VIP样神经元(黑色),(?):AVP样神经元(绿色),_v:薷三脑室;OC;视交叉HE~200 F1SectionoftheratSCNtstminedbydouble—immnnolabeiling.('):VlP—likeneurons(brown),(?)AVP-likeneurons(green),IV:third vetltricleOC:opticchimsma.HE×200la:therostralregionsoftheSCN,1b!theintermediateregionsoftheSCN.1cthecaudalregi onsof theSCNFig2SectionofthermtSCN.stminedhytri—immunoimhelling.('):SOM一 11heneurons(brown)(?)!VIP?liker0ns (black)(?):AVP—liheneurons(grin),?V!thirdvent^cleOC:opticchiasmaHE×200 华酉医科大学31卷 AVP样细胞群之间都不是截然分界,相交处一狭窄 区内两种肽能神经元混杂在一起,交错重叠.偶尔也 见单个的AVP样神经元出现在VIP样神经元聚集 的区域内. 2.2免疫组化三重标记结果 镜下见SOM,VIP及AVP阳性反应神经元分 别以棕色,黑色及绿色在同一张切片上显示出来(图 2).SOM样神经元数量较少,散在分布,在SCN头 段,分布于腹侧的VIP样神经元与背侧的AVP样 神经元之间,在SCN中段,分布于腹外侧的VIP样 神经元与背内侧的AVP样神经元之间,在SCN尾 段,分布于外侧的VIP样神经元与内侧的AVP样 神经元之间.无论在SCN头段,中段及尾段,SOM 样神经元始终分布于VIP与AVP样细胞群之间相 交错重叠的区域内,与VIP及AVP样神经元混杂. 3讨论 由于免疫组化技术对小细胞神经元显示较为困 难,目前对于SCN内三大神经细胞群分布的描述更 多的是免疫组化单标的资料.本实验首次将免疫组 化三重标记技术成功地应用于SCN研究领域,达到 了在同一平面同时观察三种肽能神经元分布的目 的.方法学的突破,使我们不仅观察到三种肽能神经 元在SCN头中尾三段细胞数量的变化及分布上的 不同,而且观察到在VIP与AVP样细胞群相交界 处一狭窄区域内,三种神经元交错重叠混杂分布的 情况,获得了SCN内上述三种肽能神经元分布的更 为直观,准确和全面的资料. SCN作为哺乳类昼夜节律发生器的功能已为 众多实验所证实.它明显受到外界光暗环境的诱导 和影响一,又对机体绝大部分的生理功能及行为的 节律起调节作用.与其功能相适应,SCN有什么 样的形态结构特征?特别是SCN内主要的三类神经 细胞群各起了什么样的功能作用呢?从本实验结果 来看,SCN中的VIP样神经元靠近视交叉,与视神 经关系最为密切.从该细胞群在SCN头中尾三段的 分布来看,由核团的腹部,转至腹外侧部,最后到外 侧部,这个变化,与视神经纤维由腹侧逐渐向腹外侧 伸展相一致,故VIP样神经元接受视神经投射最 多.另外,视神经纤维向SCN的投射,在头尾段数量 较步,而主要集中在SCN的中段的腹外侧部.视神 经投射纤维的数量的变化与本实验观察到的VIP 样神经元数量的变化的情况相符台.因此,我们推测 VIP样神经元与传人的光信息的接受有关另一方 面,对SCN传出纤维的研究表明,从SCN的背尾侧 发出的纤维较致密,而从头侧发出的纤维较少]. 传出纤维发出的部位,正好是本实验观察到的AVP 样神经元所聚集的区域,而纤维数量的多少与该处 AVP样神经元数量的多少相一致.由此我们推测 AVP样神经元的轴突可能是SCN传出纤维的主要 组成部分.SOM样神经元分布于VIP样神经元与 AVP样神经元之间,从分布位置来看,SOM样神经 元与VIP样神经元及AVP样神经元有非常密切的 关系.我们已从另一实验观察到,SOM样神经元与 VIP样神经元及AVP样神经元之间有相互的纤维 联系],故我们推测SOM样神经元可能为中间神 经元,协调VIP样神经元与AVP样神经元的功能 活动. 许多实验揭示,SCN中三种肽能神经元在功能 上是相对独立的.免疫组化单标的资料表明三 种肽能神经元有各自集中的分布区域,从形态学的 角度支持上述观点.但本实验从免疫组化双重及三 重标记的切片上观察到,三种肽能神经细胞群的分 布并非截然分界,它们相互交错,而在相交处一狭窄 区域内三种肽能神经元重叠混杂在一起.提示三种 肽能神经元在功能上可能不是完全独立的,彼此之 间可能存在相互调节和制约.而这三类肽能神经元 究竟在昼夜节律产生中起什么样的作用,尚需进一 步的探索 参考文献 VanDenPolAN.T$11limotoKI_.NeurotransafitteroJ'the hypothalam[csuprachias~ticauc[eus:imamn~ytochealkal a~lys[sof25ne~ona[antigens.Neurosci.1985I15(4)1049 CardJP,MooreRY.Thesuprachias~ticnttE[eu$oJ'the goldenhamster:[mmunocytochemicalanalysisoJ'cellandJ'[ber d~stribut[onNeurosci.1984113(2):415 顾耀铭.陈以慈,叶鹿铭.钨酸钠做为稳定剂的新的高灵敏 HRPTMB法——1.光铙研究神经解剖学杂志,199O;6(1): 121 操高原,晴可群,陈文玉等摘除眼球后对视交叉上棱节律性的 影响.神经解剖学杂志,1994F10(3):289 Melter』H.R[etveldWJNeurophys[ologyofthesuprachias maticcircadianpaceraakerinrcdents.Phys~olRev.1989:69 (3):671 StephanFK,BerkleyM,MossREfferentconnectionsofthe ratsuprachiasalaticnuc[etts.Neurosci,1981{6(12):2625 WattsAG.SwansonLW,SanchezWattsEfferentpr.】ection ofLhesuprachiasmat[cnucleus1studiesusingantrograde transportofphaseo[usvulgat[sleucoaglutinin*-he珀【』Comp Neurol,1987l858(8):204(下转第369页) 3期赵金辉等.酚类化合物在河川水体中的生物降解研究 56.19,40.84,46.49,64.40 综合以上结果可看出4种酚类化合物的降解顺 序为j间苯二酚>苯酚>邻甲酚>邻氯酚.导致微生 物对4种酚类化合物降解顺序不同的主要原固可能 是酚类结构不同.在其它条件一定的情况下,有机物 的结构决定了有机物分解代谢反应的可能性和难易 程度.有资料"表明酚类化合物好氧降解是在一系 列酶的作用下,通过进入电子呼吸链来进行的,它们 的开环裂解需要氧从苯环分子中获得电子来完成. 甲基和羟基均使苯环活化,使苯环上的电子云密度 增加,氧化过程变得容易.氯取代基则使苯环钝化, 使苯环上的电子云密度降低,导致氧难以进攻苯环, 使得微生物对氯代酚的降解能力低于其它几种酚类 化合物.另一方面,取代基团的数目对于能否被酶系 统降解也起着很大作用,基团的数目越多,空问位阻 越大,微生物降解污染物的能力也相应降低. 用苯酚驯化的微生物可降解苯酚,邻甲酚,邻氯 酚和间苯二酚比较邻氯酚/苯酚单独降解曲线和用 苯酚驯化的微生物降解邻氯酚/苯酚曲线,发现用苯 酚驯化的微生物降解邻氯酚的百分数变化明显高于 单独邻氯酚驯化的降解百分数的变化,但却低于单 独苯酚降解的百分数.前者说明苯酚的存在为邻氯 酚提供了诱导酶,苯酚诱导酶的共代谢作用加速了 邻氯酚的降镪,而邻氯酚却抑制了苯酚的降解,对其 产生了竞争作用,我们以难降解的邻氯酚驯化的微 生物降解邻氯酚和苯酚,前5小时30分钟内苯酚降 解百分数变化均低于邻氯酚,但随后微生物能以苯 酚为碳源生长,降解百分数明显高于邻氯酚.当以生 活污水作为营养源时,邻氯酚降解百分数变化低于 加入N和P者,说明邻氯酚对苯酚有竞争抑制作 用,生活污水中含有微生物生长所需的营养条件,但 其它有机物的存在影响邻氯酚的降解,使邻氯酚降 解减慢. 用邻甲酚驯化的微生物可降解四种酚类化合物 组成的混合水样,其降解效果与用混合水样驯化的 微生物降解混合水样的结果无明显差异从以上几 个实验可见:当用易降解物质化的微生物降解难 降解物质时,可诱导和加速难降解物质的降解;反 之,它们之间发生竞争作用,难降解物质抑制易降解 物质的分解,说明四种酚类化合物的微生物彼此间 具有相似的结构及诱导酶的非专一性,可以相互取 得所需碳和氧发生相互诱导,相互竞争和共代谢作 用.此性质对难降解酚类化合物的处理具有重要实 际意义. 参考文献 1VincentG.Ange[ett[G,BivrsechAOrganicmicropo[[utantsin theaqLmtJc~nviroament.Kluwer.1991:285 2国家环保局编.承和废水监测分析方法.第3麓.北京:中国环境 科学出版让,989l850~408 3于瑞莲.赵元慧.褒星.取代苯胺和苯酚类化台铀对大塑蚤的 毒性噩pH值对其毒性的影响.环境化学.1998I17(5);454 4洪丑主编.有机化学.第2板.北京:人民卫生出敝社,1985 2ZO,227 (1999-05一i7收祷,2000—0411謦回) 编辑罗惠坤 (上接第324页) 8王蕾,欧可群,操高原等.太鼠视交夏上棱内v1P,AVP厦 SOM样神经元的相互关系一一免疫姐化双重反应法研究神 经解剖学杂志,1996I12(4):413 9AlbersHEtStopaEG,ZoellerRT.【)ay_nIghtvarLstionin preprovasoactivekntestlna|ptpte/p印t旧ehistidineisoleucJne mRNAthintratsuprachiasmaticnucleus.MolBramRcs, 1990?7(1185 10UhlGR,ReppertSM.Suprachlasmatlc~ueleusvasopressJn messengerRNA:Circ且dJanvar~tion_nnorro.~landBratteborO rats.Scnce,1986|232(18ApriI):390 l】ShlnoharaKY,bobeJrTakeuch1.Ciz*adiAnrhythros somatostat[~【mmu?o?thyintimSCNof憎t.Neuroscl [1.1991I129(1):59 (199909—28收稿.2000—05—12怔回) 编辑扰进