【doc】大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义

【doc】大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义 大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义 一 , 《癌症》2000年第19卷第10期893 大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义 冱奎,廛墨整,郭善禹,王兵,刘文勇 (上海第二医科大学附属第九人民医院普外科.上海200011) /~733",;牛. ^7j一3.} 【摘要1目的:应用反转录聚合酶链反应(reveetmslscriptasepelymechalnreaeti吣RT-PCR)法检测大肠 癌的淋巴结微转移.方法:17例行根治性手术的丈肠癌患者,应用RT-PCR法检测切除的205个淋巴结中细胞角蛋 白213(c~okeratin20,CK20)mRNA的表达,另取4例良性胃肠道疾病患者的31个淋巴结作为阴性对照;并采用系列 稀释试验检测本法的敏感性:结果:大肠癌患者的2(15个淋巴结中有35个检测到CK20mRNA的表达,而病理组织 学检查仅发现18个淋巴结存在肿瘤转移;4例良性胃肠道疾病的31个淋巴结RT—PCR结果均为阴性.系列稀释试 验提示CK20RT-PCR的敏感性为每10个正常淋巴细胞中检测到1个肿瘤细胞存在.结论:CK20RT—PCR是检测大 中图分类号:R735.3文献标识码:A文章编号:1000—476X[2000)10—0893—06 Geneticdetectionoflymphnodemicrometastasesincolorectalcancer TANGRui,TANGSi—tong DepartmentofGeneralSurgery, ShanghaiSecondMedicalUniversity, GUOShah—yu,eta1. ShanghaiNinthHospital, Shanghai200011,P.R.C/dna 【Abstract】 Objective:ThisstudyWaSurtdertakentodetectlyrephnodemforometastasesineolorectalcancerpatientsby usiilgieev@i,~etranseriptasepolymerasechainreaction{Rr—PCR】 Methods:Atotalof205lymphnodes,obtainedfrom17 coloreetalc~nc@rpatientswhounderv,entcurativeoperation,weredetectedforexpressionofcy~okeratin20(CK20)mRNA withRT—PCR.Thi~y— onelymphnodesfrom4patientswithbenigngastrointesti;ra]diseasewereserved? negativecontro1. Cellspikingexperimentwasperformancedtodetenalnethesensitivityofthismethod. Results:Thirty—fiveof205lymph nodessamplesineolorectalcaneerpatientsweIeshownCK20mRNAexpression.whileonly18sampleswerehistologically pe~itiveCK20mRNAexpressio~wundetectedin31lymphnodesofbenigndisease.Theresultofcellspiking experimentindicatedthatthelimitofsensitivitye1tumorcellper10?町 ma1]ymphoytesConclusion:Rlr_PCRfor CK20isasensitiveandspecificmethodtodetectlymphnode histopathofogfoalassayinexamininglymphnodemetastases. stagingandindicationsforcancertherapy ineolorectalcancer.Itissuperiortomutine MicrometastasesdetectionbyRT-PCRmayimproveclinical Keywords:Colore,_:talneoplasms;Lymphaticmetastases;Mierometastase;Geneticdiagnosis;Reversetranserlptase palymerasechainreaction(RT-PCR):Keratin20 术后转移和复发是大肠癌患者的重要死亡原 因.行根治术的患者约有30%,40%在5年内出现 收稿13期:1999—10—25:修回日期:2000—05—09 ?通讯作者:Tel:86—21—63138341—5136 E—mail:guo—sy@yeah.net 转移或复发…,但这些患者在手术前后的常规检查 中(包括手术探查,B超,CT等)并未发现显性转移, 因此微小的转移灶客观存在.我们将这些微小的,存 在于血循环,淋巴道,骨髓和其它各组织脏器中的, 临床常规检查难以发现的转移灶称为微转移微转 移虽小,但有发展形成致命的显性转移灶的可能,因 汤舂等夫肠癌琳巴结微转f萎基网捡删的直望 此明确微转移的存在与否对确定最侍治疗和判 断预后具有积极的意义. 淋巴结转移与否是判断大肠癌预后和指导术后 化疗的重要指标,常规的病理组织学检查在敏感陛 等许多方面存在不足.闲此,寻找一种敏感而特异 的方法检测淋巴结中肿瘤转移尤其是微转移的存在 具有重要的临床意义.本实验采用反转录.聚台酶 链反应(reveis~,.tmnscriptasePCR.RT.PCRf法反转 录并扩增淋巴结中细胞角蛋白20(cvlokerafin20, CK20)基因的mRNA,以检测大肠癌淋巴结微转移 的存在. 1与方法 11标本 我院I999年2月,6月行根治性手术的大肠 癌患者17例,男性8例,女性9倒;年龄4I,80岁. 中位年龄67岁;直肠癌9例,乙状结肠癌4例.升结 肠癌1例,盲肠癌3例;Dukes分期:A期3例,B期 7例,C期7例;隆起型6例,溃疡型8例,澄润型3 例;侵犯肠管周径?1/3的2例,I/3,2/3的5 例,>2/3的1O例;分化好的2例,分化中等的I2 例,分化差的3例;浸润深度,:的4例. pT',pL的l3例(具体情况详见表? 表117例大肠癌患者的临床病理资料 倒睁性别年龄部忙?体娄型肿瘤侵犯丹化程匿浸阳度nh舒 l岁)脑管周径 手术切除的标本立即分离淋巴结并取--d,块肿 瘤组织,每个淋巴结均切为两半,一半做常规病理切 片HE染色,另一半液氨冻存直至RNA抽提.共取 大肠癌患者淋巴结205个,平均每例I206个此 外.取4例良性胃肠道病变的31个淋巴结(2例乙 状结肠腺增患者16个,1例直肠腺瘤患者5个,I例 胃溃疡患者10个)作为阴性对照 1.2RT-PCR法 本实验采用RT-PCR法定性检测CK20mRNA,同 时选择管家基固磷酸甘油醛脱氯酶(glyceraldehyde. 3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)作为内参照,以 证明抽提RNA的完整性一 121RNA抽提:采用Trizol试剂(华舜产品)一步 法抽提组织总aNA(具体步骤详见操作),取部分 RNA样品稀释后测吸光度4值(A260/,4280在 1.8,2.0之间l,并换算浓度. 12.2引物没计与合成:CK20基因全长18061bp, 共有8个外显子和7个内含子,本实验所用的上游引 物和下游引物分别位于第1和第3外显子,RT-PCR 合成的片段包含第1外显子的后半段第2外显子 的全部和第3外显子的前半段.引物由Beckman Oligo10003'II)NA合成仪合成(中国科学院上海植 物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室),序列 如下: CK20SensePrimer:5'-CAG3.CACACGGTGAACTATGG.3. AntlsensePrimer.5'-GATCAGcTrCCACTc不AG北G.3. GAPDHSensePrimer:5'-ATGGCACCGTC.a,AGGCTGAG.3. Anti~nsePrimeE5'-CGCCTGC不CAtCACCTrCT.5?_ l_2.3反转录合成cDNA和PCR反应:本实验采用 AccessRT.PCR试剂盒(Promega),反转录和PCR在 同一试管,单一缓冲液中完成.每个RNA样品分别 用CK20和GAPDH引物进行RT-PCR反应,步骤如 下:在0.5ml离心管中依次加入无RNA酶的水, 5×缓冲液10(终浓度为1×,,dNTPI(终浓度 0.2mmoI/L),CK20或GAPDH的上游和下游引物 各ll(终浓度1o-mol/I),25mmol/LMgSO,2 (终浓度1mmol/L),AMV反转录酶,TfIDNA合成 酶各1l(终浓度01L/I.t1)和1g总RNA整个 反应体系50.加样过程在冰上进行.加样完成 后,轻微振荡混匀,放入PTC.1O0热循环仪cMJ Research).首先480c45rain进行反转录(cDNA第 一 链合成),然后94%2rain使Ably酶失活并使 RNA/cDNA/引物变性,以后按以下条件合成cDNA 第二链和进行PCR扩增CK20引物存在时反应条 件为94?1rain,62?2rain,68?2rain共4O次循 环;GAPDH引物存在时为94?1rain,63%1rain, 68oC2min共3O次循环最后680c7rain.CK20和 汤睿,等.大肠癌淋巴结微转移基因检删的意义 不加RNA的反应体系作为空白对照进行PCR 扩增结果为阴性,证实不存在试剂污染;不加AMV 反转录酶的反应体系进行PCR扩增结果为阴眭,证 实无基因组DNA的污染 将存在CK20引物的RT—PCR产物进行测序,结 果与GenBank检索所获得的序列一致,提示经 RT.PCR反转录并扩增所获得的DNA片段足CK20 基因的一部分. 2.2大肠癌患者的淋巴结样本 17例大肠癌的205个淋巴结,常规病理HE染 色提示有7例的18个淋巴结存在肿瘤转移,l性率 8.78%,RT.PCR提示有11例的35个淋巴结存: 转移,阳性率1707%(见表2)两者比较RT—PCR 法检出大肠癌淋巴结转移的敏感性较HE染色高 (见表3),统计学检验存在显着性差异(,< 001), *淋巴结总数/HE阳性琳特数/RTPCR阳性淋巴结数 表3HE染色和RTPCR检测大肠癌淋巴结转移的比较 所有HE染色存在肿瘤转移的18个淋巴结 RT.PCR均为阳性,而HE染色阴性的187个淋巴结 中有8例的17个淋巴结RT—PCR为阳性,其中包含 了4例(例2,4,6,17)DukesA,B期的患者(图3), 而另4例DukesC期患者(例3,9,10,11)则发现了 更多的淋巴结RT.PCR结果为阳性(图4). 各病例中,CK20阳性淋巴结分布在根治术切除 标本的不同部位,肠旁淋巴结(N.)为17/100 图3倒4直肠癌患者8个HE染色阴性淋巴结 RT—PcR产物的电泳结果 M,丹子址参照柳;T,肿瘤组织:B,空白对{C小加 ^Mv骑的陛对照】一4,直腑旁淋巴结,奠巾2个一I, 3lCK20阳:5—8,直舫上动脉径路淋巴结,均阴性 图4倒11乙状结肠癌患者13个淋巴结 RT-PCR产物的电泳结果 M,分子量参照物:T肿瘤组织;B,空白对照;C,不加AMV酶 的阴性对照;】一l3区域淋巴结2,6为HE染色阳性的淋巴结. 其余HE染色均为I5E】性;电泳提示23,4,6I1,13CK20阳性 转?!:;j..m;?,粑一一=== ,一一一一..,一.:. 一一一一一.....:....嘴Hk"?",一雌一忙篮? 《癌症)2o0o年第19卷第10期 淋巴结存在转移.因此,目前临床常规的病理组织 学方法检出淋巴结转移的敏感性不高,难以发现肿 瘤的微小转移灶 连续切片法可以提高淋巴结转移的检出率,但 工作量过大.临床上难以推广.免疫组化从20世纪 80年代中后期开始用于淋巴结微转移的检测,CK, CC49等多种单抗被应用于检测I,尽管有助于检 出微转移,但目前可供选择的抗体其特异性和敏感 性还不能满足诊断的要求,能否作为推断预后的指 标也存在争议I.作为一种形态学方法,它还存在 阳性判断不一致的缺点,且切片的数量有限.不 足以反映整个淋巴结的情况,费用也较高因此,它 也未能成为临床检测的常规手段 近年来.随着分子生物学技术的发展,通过基因 检测徽转移已成为可能.目前基因检测主要是应用 PCR技术,包括两方面的策略:一是检测肿瘤细胞 基因突变或染色体重排所导致的DNA异常,报道的 主要方法是突变等位基因特异-性扩增(mutanta1 1ele.specificamplification.MASA)..可检测的基固 有K.ms和p53等,但此法最大的障碍在于K.ras和 p53在大肠癌的突变率并不是很高I,首先要检测 原发肿瘤的突变类型,未测得突变者便不能进一步 对淋巴结进行检测,所以检测率低.步骤也较复杂, 目前不能用于临床另一种策略是RT—PCR,它通过 反转录并扩增正常被检组织不表达而肿瘤或肿瘤来 源组织表达的mRNA来证实微转移的存在.即只要 被检组织存在肿瘤或其来源组织的mRNA就提示 存在肿瘤细胞转移 用于大肠癌淋巴结微转移检测的靶RNA主要 包括CK和CEA等的mRNA,本实验选择的是 CK20.CK属细胞骨架蛋白,广泛分布于上皮细胞和 上皮来源肿瘤细胞的细胞浆,在间叶组织不表达 CK共有20种亚型,CK20是其中之一,它在正常人 体内的表达主要局限于胃肠道上皮IlO1.而在正常淋 巴结的淋巴细胞和上皮细胞不表达…I同时,CK20 mRNA在几乎所有大肠癌组织中均表达--.与其他 较常用的靶RNA比较,CK19在正常淋巴结上皮亦 有一定表达II,同时存在假基因的问题,特异性 差;CEA虽被作为肿瘤标志物广泛应用,但在大肠 癌的表达水平存在变异I.因此,CK20是目前较为 理想的选择.同时.本实验选择的引物跨越了3个 外显子,减少了基因组DNA污染和错配所造成的 假阳性,从另一个角度保证了方法的特异性.从本 实验的结果来看.所有l7例大肠癌患者的肿瘤组 ~ ~370h t 一一 3讨论 在大肠癌的各种分期中.淋巴结转移与否是判 断大肠癌预后和指导术后放化疗等治疗措施的重要 指标.长期以来,临床上都采用病理切片HE染色判 断淋巴结的转移情况但仍有20%经组织学证实淋 巴结阴性的患者在术后5年内肿瘤复发.用连续切 片法对阴性淋巴结进行重新检测,也发现近1/5的 898 \'H 而眷等大物癌淋巴结微转移基医硷删的意义 织和4例良性胃肠道疾病的病变组织均表达CK20 mRNA.而4例良性胃肠道疾病的31个阴性淋巴结 均不表达,也证实了CK20的tIT—PCt/具有很高的特 异性, RF-PCR法具有很高的敏感陛,只要存在极少 量肿瘤组织的靶RNA,即可反转录并扩增获得阳性 结果,通常可以在10,10'个正常细胞(立?淋巴细 胞,外周血细胞或骨髓细胞等)中检出i个肿瘤细 胞i"j系列稀释试验也征明本实验体系能在10 个正常淋巴细胞中发现1个肿瘤细胞淋巴结样本 的实验结果也表明,除HE染色阳性的18个淋巴结 R_r—PCR均为阳性外,原HE阴性的187个淋巴结中 有8例的l7个淋巴结RT—PCR为陆.提永这些淋 巴结中存在常规病理组织学检查所小能榆出的微转 移,这一点或许l?I能解释,部分HE染色阴性的大肠 癌患者行根治术后为何会出现复发., 当然,RT-PCR法也有一定的缺点和局性.由 于扩增目标为RNA,闰此取材必须是薪鲜豇织尢 法作回顾性研究,且技术要求较高,标本处理必须迅 速,抽提和反转录时需预防RNA的降解但总的米 看,它还是具有以下优点:cl}只要选择适当的靶 RNA,具有很高的敏感性和特异性;(2JR]__PCR能 反映标本的整体情况而非局部断面;《3)操作方法 易标准化,判断结果容易且准确,人为因素f扰少: 【4)检测时间较短,能在24,48h内得出结果.叫 可检测多个标本只要具备基本条件的分了生物学 实验室均能进行,因此RT—PCR法有可能成为临床 检测微转移的常规方法 目前.我们推断大肠癌患者预后和选择术后治 疗方案主要是根据患者的分期,仉这些分期指标仍 然存在不足,已经不能作为唯一指导治疗和判断预 后的标准.微转移的检出是一个重要的指标.它能 帮助我们解释一些现象,对患者分期,判断预后和确 定手术和术后的治疗方案具有重要的指导作用,本 组病人中如以RT.PCR结果为标准,则有4例Dukes A,B期患者的分期可改为C期,或者我们可以说这 些患者是DukesA,B期中的高危病例,应当进行更 为积极的随访对发现微转移的患者,应采取更积 极的治疗方案.CK20RT-PCR法除检测淋巴结外, 也能对患者的血液,骨髓和腹膜腔的微转移灶进行 检测.它将对临床处理提供更多的指导和参考.具 有良好的应用前景. _1ll'M(1199I47247—248. Gmnn】Klse,~harlCE,RiceRet【i.e]ttilieationof occultmi,rYlll1ltb…?perit~ll?I?lnphnodesofDukesB celo~tteltal1..patientsusingm,mt,clona[antibc,,tiesagainst 【-)tokeratinandCC49:Cotxelationwithlong-termsur~ivalIJ1 Cancer.199473563—569 CutaitR.AIvesVALopesLCetalRqmlaging.fcoloreet~l tlm~ughim川?ldeslainngoE^…Idcwoka?【J DisColonR[unt[991.34917—920 7]Hav~hi,Ito1,YanagisawaA.ela【Geneti(diagJmsisnf lymph—nt,demLaincol(mx:lelcaJ】er【Jj[~ncet,I995 345:12571259 sjB?JL【t.~ntcogenesinhuman?-…?Y…wfJiCan(-r Res.I98949:46824689 9ILevine^J.Mot.andJ-Finla?CA+Thep531~nlOUF】…s目 gene『】JNature.199【,35【453457 101Moll11.SchilIDLFrankeWwIdentificafonofpmleinIT1f theintestinaleytoskeletonasnoveltypeI【.ytokemtinwilh unusualproperliesandexpre~ionpatterns『J1JCellBiol 1990.11I'567—580 111GunnJ,McCallJL,YunK,etal_Deta4tionofmicmmetastases p~lymerasechain~action[】1-LabInvest.I99675:6Il616 f12fMollR』h^1mullerJHalCltokeratin2Oinhuman ca~'inomaAwhJs"ldl1markerdetectedIJymonoclonal anfbodies[】】AmJPathel,1992.j40:427447 【131BaderBL.Magi]lfM,tlalzfeldM,elalAmino…l~quenee andgentorganization0feytokeralinn0l9arIexceptional tail…1sintermediatfilamentprotellt[】1EMBOJ.1986.5 I865一l875 『14lMafunt:K.SainiKS,Rav】k…TS.alDiffemmcesinmessenger RNAexpression(1I?洲…b.mantigenin…a}sp~:imens ofc0lo~ctalcarcinoma『】】TurnoutBoil,1992,13330—337 [15lGerhardM,JuhlH.KelthoffH.alSI)eoificdet~6on0f …DD哪}H…antigen—exposinglucellsJnbonem… ~piratesby~mlymeraseeltain~actionlJ1JClinOnco1.L994. 12:725—729 f编辑殛校对:杨允贵1 , ,柏?一?…一m -景?帅 三戛 oe5?m kH_蕃__岍一 考队 一 ,鎏