丹参酮ⅡA等活血化瘀类中药抗内毒素作用的筛选

丹参酮ⅡA等活血化瘀类中药抗内毒素作用的筛选 丹参酮?A等活血化瘀类中药抗内毒素作 用的筛选 山西医科大学学报(JShanxiMedUniv)2010年(Z DOI:10.3969/J.ISSN.1007—6611.2010.07.012 丹参酮?A等活血化瘀类中药抗内毒素作用的筛选 张萃(广东药学院微生物学与免疫学教研室,广州510006) ? 62l? 摘要:目的探讨丹参酮?A,丹参酮I,丹参总酮,隐丹参酮,盐酸川芎嗪,阿魏酸,姜黄素,莪术油8种活血化瘀类中药成 分抗内毒素的作用.方法实验分为药物组,细胞模型组(LPS诱导的细胞模型),正常对照组,地塞米松组(阳性对照). 采用wST-8试剂盒测定丹参酮?A等对内毒素模型细胞增殖的抑制作用;采用ELISA法检测细胞培养上清中TNF—d和IL-113 产生的影响.结果丹参酮?A,丹参酮I和丹参总酮抑制细胞增殖效果较好,对细胞增殖的抑制率分别为36.7%, 33.2%,40.8%.隐丹参酮,丹参酮?A和丹参总酮对模型细胞产生TNF-有明显抑制作用,丹参酮?A,隐丹参酮和姜黄素 对模型细胞产生IL一113有明显抑制作用,与细胞模型组比较差异显着(P<0.叭).结论丹参酮?A,丹参酮I和隐丹参酮 可不同程度抑制内毒素炎症过程中的炎症因子变化以及巨噬细胞 的过度活化增殖. 关键词:活血化瘀类中药;抗内毒素作用;THP?1细胞 中图分类号:R285;R967文献标志码:A文章编 号:1007—6611(2010)07—0621—03 ScreeningofeightChineseherbalmedicinesactivatingbloodcirculationanddissipatingbloodstasisagainstendotoxin ZHANGCui(GuangdongCollegeofPharmacy,Guangzhou510006,China) Abstract:0bjectiveToinvestigatetheanti—endotoxineffectofeightChinese herbalmedicines,includingtanshinone1IA,tanshinone I,totaltanshinones,cryptotanshinone,tetreamethylpyrazine,ferulicacid,curcumin,andzedoaryturmericoil.MethodsMacrophages weredividedintolipopolysaccharide(LPS)modelgroup,druggroups,dexmethasonegroup(positivecontrolgroup),andnormalcontrol group.WST一 8kitwasusedtodeterminethecellproliferationrate.ThelevelsofTNF—QandI L一1Binsupernatantweremeasuredby ELISA.ResultsThetanshinone1IA.tanshinoneIandtotaltanshinonesshowedabetterinhibitiveeffectonLPS—inducedeellproli. feration,andtheirinhibitoryrateswere36.7%,33.2%,40.8%,respectively.Cryptotanshinone,tanshinonelIAandtotaltanshinones inhibitedTNF一 levelincellsexposedtoLPS,whileTanshinoneIIA,cryptotanshinone,andcurcumininhibitedIL一113production. ConclusionTanshinone? A.tanshinoneIandtotaltanshinonescouldinhibittheendotoxin.inducedinflammatorycytokineproduction andcellproliferationinvariousdegree,thuspreventingtheexcessiveactivationofmacrophages. Keywords:Chineseherbalmedicineactivatingbloodcirculationanddissipatingbloodstasis;anti-endotoxineffect;THP-1cells 凡以通畅血行,消除淤血为主要作用的药物,称 活血化瘀药.活血化瘀中药具有广泛的生物活性, 并能预防和改善内毒素所致的心,脑微血管内皮细 胞超微结构的损伤?j,但其抗炎机制不清.因此从 抗炎角度探讨活血化瘀中药有效成分在抗内毒素作 用过程中的作用将有更重要的应用意义.由于内毒 素主要指革兰阴性菌中的脂多糖(LPS),可导致内 毒素血症等的全身性炎症反应.本文对活血化瘀类 中药有效成分进行抗内毒素作用筛选,亦为抗内毒 素性炎症机制提供实验依据. 1材料与方法 1.1仪器和试剂 1.1.1细胞株来源THP一1细胞株,广州中医药大 学免疫实验室保存,来源于美国生物品收藏中 基金项目:广东药学院博士启动基金资助项目(2006JCX08) 心(ATCC). 1.1.2实验仪器及其主要试剂主要仪器:二氧化 碳培养箱(13本SANYO公司,MC0175CO培养 箱);倒置显微镜(OLYMPUS);实验医用型洁净工 作台(DL—CJ—IF,北京东联哈尔仪器制造有限公司); 多功能酶标仪(瑞典TECANSpectraFLUORplus); 恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂HHW21—600): 台式离心机;细胞计数板;液氮罐等. 主要试剂:中药有效成分丹参酮?A(tanshinone ?A,TanlIA),丹参酮I(tanshinoneI,TanI),丹 参总酮(TotalTanshinones),隐丹参酮(cryptotanshi. none),盐酸川芎嗪(tetreamethylpyrazine,TMP),阿 魏酸(ferulicacid),姜黄素(curcumin),莪术油(zed oaryturmericoil)等均购于中国药品生物制品检定 ? 622?西医科学学报(JShanxiMedUniv)2010年7月,41(7 所;WST-8试剂(日本同仁化学研究所,批号: PX696);PMA(佛波酯,Sigma公司);LPS(from Escherichia,coli.serotype055:135:Sigma公司,批 号:12K4090);其他见试剂文献.TNF.和IL一113 试剂盒为上海森雄科技实业有限公司生产. 1.2方法 1.2.1丹参酮?A等对LPS诱导的THP一1细胞模 型增殖的作用LPS诱导的细胞模型见文献[2]. 即THP一1细胞在佛波酯诱导成熟后,用1g/ml的 LPS诱导24h为内毒素模型组用于实验.实验分 为药物组,细胞模型组(LPS诱导的细胞模型),正 常对照组,地塞米松组(阳性对照).选择具有代表 性的活血化瘀药类中药丹参酮?A,丹参酮I,丹参 总酮,隐丹参酮,盐酸川芎嗪,阿魏酸,姜黄素,莪术 油,其中,丹参酮类(包括丹参酮?A,丹参酮I,丹 参总酮,隐丹参酮)脂溶性中药有效成分用含 0.02%二甲亚砜溶解,每一中药有效成分的稀释度 为4个浓度:50,10,1,0.1Ixg/ml,莪术油为1:10, 1:100,1:1000,1:10000稀释,每一浓度3复孔, LPS诱导的细胞模型组与正常对照组加培养液,地 塞米松浓度为50,10,1,0.1g/ml.细胞以96孑L培 养板进行培养,加入前面各组中药后继续培养24h, 培养结束前用WST一8试剂盒测定细胞增殖活性,酶 标仪测定A..选择各组中药浓度1Ixg/ml时计 算对模型细胞的抑制率. 1.2.2丹参酮?A等对LPS诱导的THP一1细胞模 型分泌细胞因子的影响分组同1.2.1.在以上测 定细胞增殖同时收集各组细胞培养上清,并利用 ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子TNF一仅和 IL.113,按照试剂盒说明书操作. 1.2.3统计学分析实验结果数据用元?S表示, 采用SPSSI1.0统计软件进行t检验. 2结果 2.1丹参酮?A等对LPS诱导的细胞模型增殖作 用的影响本实验在前期基础上成功建立LPS诱 导的细胞模型,可用于该实验的药物作用筛选.作 用结果表明,丹参酮?A,丹参酮I,丹参总酮类抑 制细胞增殖效果较好,其次为隐丹参酮,莪术油和姜 黄素,对细胞的增殖抑制作用呈现剂量依赖性,与细 胞模型组比较差异显着(P<0.01),以上药物剂 量为1ml一10Ixg/ml,其中莪术油为1:100— 1:1000.8种中药对细胞模型的影响见图1(见第 664页),各中药对模型细胞增殖抑制率结果见 表1. 表1各中药浓度1ml时对模型细胞增殖的抑制率 Tab1InhibitoryrateofdifferentChineseherbalmedi- cinestoLPS-inducedcellproliferation 与细胞模型组比较,P<0.05 2.2丹参酮?A等对LPS诱导的细胞模型分泌 TNF-d,IL一113的影响丹参酮?A和丹参总酮均不 同程度抑制细胞因子作用,与细胞模型组比较,丹参 酮?A组TNF.仅,IL一113含量均下降(P<0.01或P <0.05).隐丹参酮和丹参酮I能明显抑制模型细 胞产生TNF.Or.(P<0.05);隐丹参酮,姜黄素能明显 使模型细胞产生IL一113下降(P<0.01),结果见表2. 表2各药物浓度1tc,/nu对模型细胞产生TNF-,IL- 1B的影响(?s) Tab2EffecIsofdifferentChineseherbalmedicineson TNF-仅,IL-1BproductioninLPS-inducedcells (互?s) 细胞模型组与正常对照组比较,P<0.05;与细胞模型 组比较,一P<0.01,P<0.05 山西医科大学学报(JShanxiMedUniv)2010年7月,41(7 3讨论 丹参属于活血化瘀类药物,对于慢性炎症性疾 病有明确的防治效果J,是临床上用于心血管疾病 的常见中药,具有祛瘀止痛,活血通经,清心除烦和 滋补之功效.目前发现丹参的药理作用有减轻心 肌,脑缺血再灌注损伤,抑制血小板凝聚和血栓形 成,抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白降解,清除 自由基等,主要用于治疗心脑血管疾病,如冠心病, 高血压,脑卒中,动脉粥样硬化等.由于丹参中有效 成分多,随着研究的深入,对其认识也在不断地改变 中,所以对其有效成分抗内毒素性作用进行探讨,有 利于更好地研究和发掘丹参的药用价值. 本实验目的为探讨丹参酮?A等活血化瘀中药 抗内毒素机制.巨噬细胞是炎症病理过程的主要参 与者,用LPS诱导使其增殖并产生炎症性细胞因子 TNF一0【,IL一1G,符合炎症细胞发生,发展的病理变 化,因此用LPS诱导的THP一1细胞株作为炎症细胞 模型筛选活血化瘀中药的抗内毒素作用,为进一步 研究活血化瘀中药伴随炎症过程中的心脑血管疾病 的防治提供基础.通过实验,结果表明8种单体成 分中具有明显抑制细胞增殖作用的是丹参酮?A, 丹参酮I(P<0.O1).同时以临床上经常应用的地 塞米松明显抑制LPS诱导的细胞增殖做对照,活血 化瘀中药抑制炎症细胞增殖的趋势与地塞米松药物 ? 623? 组一致,说明活丹参酮?A等对内毒素细胞损伤具 有保护作用,与覃筱燕等报道相符. 另外本实验选择细胞因子TNF—o【,IL-1B作为 炎症因子的代表性指标具有重要意义J,结果表明 丹参素具有明显抑制炎症因子作用,同时结合抑制 内毒素诱导的细胞增殖性测定,说明活血化瘀类中 药在炎症过程中可改善内毒素致炎过程中的炎症因 子变化,以及巨噬细胞的过度活化,为下一步研究活 血化瘀中药的抗炎机制提供实验依据. 参考文献: [1]杨海贤,白景文,张宏,等.活血化瘀中药对内毒素性休克内皮 细胞的保护作用[J].中国中西医结合急救杂志,2000,7(6): 343—345. [2]张萃.LPS等丝裂原所致THP-1细胞活化增殖的优化因素 [J].山西医科大学学报,2010,41(3):222—224. [3]XiaWJ,YangM,FokTF,eta1.Partialneuroprotectiveeffectof pretreatmentwithtanshinoneIIAOnneonatalhypoxia—isehemia braindamage[J].PediatrRes,2005,58(4):784—790. [4]覃筱燕,唐丽,严莉,等.T淋巴细胞亚群在丹参酮?A抗免疫 性肝损伤中的作用[J].辽宁中医杂志,2010,37(1):6—8. [5]代渊,徐世军,彭玉华.蚁附蠲痹颗粒对大鼠佐剂性关节炎大 鼠血清NO,TNFct和IL-1的影响[J].四川中医,2008,24(7): l6一l7. 作者简介:张萃,1962—03生,博士,副教授,E.mail:ccui— zhang@126.tom. [收稿13期:2010—03—24] 山西医科大学学报(JShanxiMedUniv)2010年7月,41(7 TRX-1和STAT-3在结直肠癌组织中的表达及相关性研究(正文见第594页) ProteinexpressionofTRX-1andSTAT-3incolorectalcancerandtheircorrela tion(seepage594) A.正常对照组B.大肠腺癌组 图1大肠组织中TRX-1表达(DAB,×400) Fig1TheimmunohistochemiclstainingofTRX一1incolorectalmucosa(DAB,×400) A.正常对照组B.大肠腺癌组 图2大肠组织STAT一3(DAB,×400) Fig1TheimmunohistochemiclstainingofSTAT-3incolorecta|mucosa(DA B,x400) 丹参酮?A等活血化瘀类中药抗内毒素作用的筛选(正文见第621页) ScreeningofeightChineseherbalmedicinesactivatingbloodcirculationand dissipatingbloodstasisagainst endotoxin(seepage621) g 晷 磐 爱 再 丹参酮I 丹参酮?A 丹参总酮 隐丹参酮 盐酸川芎嗪 阿魏酸 姜黄素 莪术油 地塞米松 细胞模型组 正常对照组 各药物浓度 莪术油浓度为1:10,1:100,1:1000,1:10000 图1各中药对模型细胞增殖的影响 Fig1EffectsofdifferentChineseherbalmedicinesonLPS—inducedcellprol iferation