外用复方中药对兔耳增生性瘢痕挛缩的抑制作用

外用复方中药对兔耳增生性瘢痕挛缩的抑制作用 作者:牛占国 刘达恩 王润秀 高雁 夏炜 易成刚 刘丹 【摘要】 目的观察一种防治瘢痕的外用复方中药瘢痕膏对兔耳增生性瘢痕 挛缩的抑制作用。选用8只新西兰大耳白兔建立兔耳增生性瘢痕动物模型。 实验组于创面上皮化时即开始用瘢痕膏，并设立空白对照。用药后第30天及第 平100天观察两组瘢痕组织的外观形态，应用ABC免疫组织化学法染色测α 滑肌肌动蛋白(α)，利用计算机辅助病理图象系统测定并纪录每张 切片阳性反应区域的平均面积百分比和光密度值。结果实验组瘢痕反应较轻， 免疫组化染色瘢痕膏组兔耳瘢痕组织α平均面积百分比和光密度值明显 低于对照组(P<0.05)。结论用复方中药对兔耳增生性瘢痕挛缩有抑制作用， 对增生性瘢痕有防治作用。 【关键词】 增生性瘢痕 疾病模型 α 平滑肌肌动蛋白 Abstract:Objective To observe the effect of a compound traditional Chinese medicine ointment on the prevention of rabbit ears hypertrophic scar. MethodsEight New Zealand rabbits were selected as experiment animals. The ointment began to be used in the experimental group when the wound healed completely while nothing was done to the controls. Respectively ,after 30 days and 100 days the appearance of scar tissue morphology were observed, and the αα staining. Computer-aided image analysis system was used to determine and record the percentage of positive region and the optical density in each slice. ResultsThe percentage of αve region and the optical density in the experimental group are both significantly lower than that in the control group (P<0.05). ConclusionThe ointment can inhibit the hypertrophic scar contracture and prevent hypertrophic scars of rabbit ears. Key words:Hypertrophic scar; Disease model; α-smooth muscle actin 增生性瘢痕是创伤过度愈合的结果，后期的瘢痕挛缩严重影响了肢体功能。 防治增生性瘢痕的方法很多，如外科手术、加压、放射、激光、冷冻和药物瘢 痕内注射等疗法，但疗效均不十分理想。传统中医药对瘢痕的治疗积累了丰富 的经验，且有较显著的疗效。本课组根据验方进行改进的瘢痕膏，通过应用 于兔耳腹面瘢痕模型，观察该药对兔耳增生性瘢痕挛缩的影响，探讨瘢痕膏对 增生性瘢痕防治作用的可能机制，为其临床使用提供理论和实践依据。 1 器材 1.1 动物 实验在中国人民解放军第四军医大学西京医院整形外科中心实验室完成。 选用新西兰大耳白兔8只，清洁级，兔龄3,4个月，雌雄不拘，体重 (2.0?0.2)kg，由中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供 ,许可证号:SCXK(军)2002-005,。饲养室温度 18,22?，相对湿度60%,75%，人工混合饲料喂养。 1.2 药品及试剂 瘢痕膏，一种外用复方中药制剂，由广西医科大学药厂提供。其主要成分为丹参酮、积雪苷、黄芩苷、甘草酸、苦参碱等，按 3?3?2?2?1的比例加基质制作而成。鼠抗人单克隆抗体，北京中杉金桥技术有限公司提供，货号 。ABC试剂，武汉博士德生物技术有限公司提供，货号 SA1020。HRP DAB底物显色试剂盒，北京TIANGEN 技术有限公司提供，货号 PA109。 2 方法 2.1 造模方法 肌注速眠新(长春农牧大学兽医研究所生产)将兔麻醉后，于兔耳腹侧沿长轴制作直径为1 cm 的圆形创面，每耳6处，每两处间间隔至少2 cm，完整切除全层皮肤，去除软骨膜，保留软骨，创面不予任何处理，任其自然愈合。21 d左右创面上皮化，无一创面感染不愈或愈合不良。 2.2 分组干预 随机将实验动物分别设为瘢痕膏组(瘢痕组织涂抹瘢痕膏干预)和对照组(空白对照)，每组8只兔耳，48个创面。瘢痕膏组于创面完全上皮化时即20 d后开始用药，将瘢痕膏涂在瘢痕部位，并轻揉直到药物吸收，3 次/d，连续用药100 d，分别于用药后第30天，第100天取材，每次每只兔耳随机取3处。 2.3 观察项目 2.3.1 大体观察 观察对比用药后瘢痕膏组与对照组瘢痕组织颜色、质地的变化。对比分析实验组与对照组瘢痕发生率及外观形态的差异。 2.3.2 病理切片 将所取标本用4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋切片，每个标本切两张，分别进行HE染色以及ABC法免疫组织化学染色。镜下观察胶原排列情况及α平滑肌肌动蛋白染色情况。每张切片在高倍显微镜下(×40)中央区与周边区随机选4个视野，应用计算机病理图像分析软件分析其阳性面积比例、光密度。 2.4 统计学分析 数据由第一作者采用SPSS11.5统计软件进行t检验，检验水准α,0.05。 3 结果 3.1 动物数量分析 所有实验动物8只(16 耳)均纳入结果分析，中途无脱失。 3.2 大体观察结果用药30 d后瘢痕膏组瘢痕局部稍隆起，颜色淡红，压之褪色，解压后立即恢复原色。对照组亦有如上表现，但颜色稍淡，挛缩较明显，质地较硬。用药100 d后瘢痕膏组瘢痕组织退化表现较明显，颜色接近兔耳正常，略高出皮面，质地软，有皱褶。对照组瘢痕明显高出兔耳皮肤表面， 颜色暗红色，质地较硬。 3.3 HE染色结果 用药后30 d瘢痕膏组下可见一定数量的成纤维细胞，胶原排列较紊乱，而对照组可见大量的成纤维细胞，胶原排列十分紊乱，并可见漩涡状排列结构。用药100 d后，瘢痕膏组少见成纤维细胞，胶原排列较规整，数量明显减少，已接近正常组织;对照组胶原排列仍较紊乱，数量较多。 3.4 免疫组化结果 两组的α平滑肌肌动蛋白染色均可见阳性结果，前后两次的染色阳性率均成递减趋势，但瘢痕膏组的阳性面积百分比和光密度值均明显低于对照组(P<0.05)。结果见表1。 4 讨论 创伤愈合后，如何防治瘢痕挛缩一直是烧(创)伤外科的热门问题之一，各种防治方法都在不断地探索之中，但尚无一种方法具有绝对的权威性。传统中医药对瘢痕的治疗有较丰富的经验及较显著的疗效，但中医药的应用尚未引起人们足够的重视。目前对中药的研究多局限于单体，祁少海等,1，2,研究了积雪草甙对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的影响;张玄等,3,通过体外实验发现丹参能抑制成纤维细胞的生长，停滞在细胞分裂周期的期，抑制DNA的合成，抑制瘢痕成纤维细胞分泌细胞外基质及胶原量明显减少;苦参碱能使凋亡相关调控蛋白bax表达上调，p53，表达下调，促进瘢痕FB细胞凋亡,4,;罗志晓等,5，6,通过实验黄芩能够抑制β诱导的细胞间黏附分子,1在牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞上表达使成纤维细胞的细胞周期分布变化，G2M、S期细胞比例降低从而发挥抑制其增殖作用。然而许多中药是靠配伍来发挥作用的，药物的配伍应用是中医用药的主要形式，方剂是药物配伍的发展，也是药物配伍应用的较高形式。经过配伍可以增强单体药物疗效，降低副作用，从中医角度来看就是达到药物之间相须、相使的目的。复方药物的疗效和作用机制并不是其单体疗效和作用机制的简单相加，所以有必要将一个复方药物作为一个整体来研究。复方中药治疗瘢痕已有先例，杨运伟,7,报道用五倍子、五灵脂、紫草、乳香、没药、蜈蚣浸泡于麻油5 d后加温煎至焦黄，过滤，加入二甲基亚砜制成消痕油，外涂治疗瘢痕，总有效率为96.6%。表1 不同时间各组瘢痕内α平滑肌肌动蛋白表达的图像分析结果(略) 由于缺乏合适的增生性瘢痕动物模型，对中药防治瘢痕的研究大都局限在细胞培养上。1997年，Morris等,8,在多年兔耳创面研究过程中，发现在兔耳的急性、慢性创面上可以发生类似人类增生性瘢痕样的改变。1998年，李荟元等,9，10,开始了在兔耳建立增生性瘢痕动物模型的系列研究，证实兔耳可以产生与人类类似的病理性瘢痕，并且从多个侧面验证了兔耳增生块与人类瘢痕的相似性。此研究成果受到了众多学者的广泛关注，不断的被成功复制，并在增生性瘢痕发生机制及药物抗瘢痕效应等研究中成功应用,4，11,15,。 陈远征,16,通过建立兔耳增生性瘢痕模型来检验改进后复方中草药瘢痕膏的疗效，初步证明了其对瘢痕具有防治作用。本实验再次建立兔耳增生性瘢痕模型，进一步研究中药瘢痕膏对瘢痕挛缩的防治功能，并探讨其可能机制。该瘢痕模型瘢痕增生最明显时期是30,60 d，80,100 d后开始逐渐减退,9，10,。 该实验在用药后30 d(建立模型后50 d)取材，为瘢痕增生明显时期的标本，在用药后100 d取材为瘢痕减退时期的标本。从实验结果我们可以看出，在瘢痕增生明显时期实验组的瘢痕增生较轻微，镜下可见胶原数量明显少于对照组，而在用药后100天瘢痕明显消退，对照组的消退不很明显，从而进一步验证了瘢痕膏的疗效。 两个时期α的检测，实验组的阳性面积百分比和光密度值均低于对照组，表明试验组α的表达明显低于对照组。α是肌成纤维细胞骨架成分中具有收缩性质的一种蛋白结构，是体内肌成纤维细胞最常见的标志,17，18,。肌成纤维细胞是一种特殊形式的纤维母细胞，具有纤维母细胞和平滑肌细胞二者的特点:象纤维母细胞一样能合成胶原;另一方面，胞浆内含大量排列成束的微丝和肌动蛋白，以及这种细胞对许多药物的反应表现等都类 ,。肌成纤维细胞在创面的愈合过程中发挥着重要作用，似于平滑肌细胞,19 正常创面愈合后，肌成纤维细胞可能经过凋亡途径很快消失，但在增生性瘢痕及纤维化病灶中，α阳性的肌成纤维细胞持续存在,20,22,。现代医学认为，瘢痕的挛缩可能与肌成纤维细胞有关，而与胶原形成无关。肌成纤维细胞在细胞和细胞之间、细胞和胶原纤维之间有广泛而紧密的连接，因而细胞收缩时，可引起整个肉芽组织或瘢痕组织的收缩，这是引起瘢痕挛缩的主要原因,23,25,。由此可以推测，瘢痕膏是通过抑制α的表达来达到防治瘢痕挛缩的效果的。本实验是坚持中医中药的整体观念，从整体上验证了该药防治增生性瘢痕增生及挛缩的疗效，至于是何种单体，通过何种途径来抑制α的，或是多种单体相互作用的结果，尚需进一步的研究。 【参考文献】 ,1,祁少海,谢举临,利天增,等.积雪草苷对烧伤增生性瘢痕作用的实验研究,J,.中华烧伤杂志,2000,16(1):53. ,2,潘姝,利天增,李叶扬,等. 积雪草苷对瘢痕成纤维细胞增殖与磷酸化Smad2和Smad7表达的影响,J,.中国临床康复,2005,9(10):230. ,3,张玄,李世荣,李荟元,等.丹参对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响及增殖抑制初探,J,.中华医学美容杂志,1999,5(2):73. ,4,汤苏阳,蔡宝仁,徐获荣,等.苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及相关调控蛋白表达的影响,J,.中华烧伤杂志,2002,18(5):299. ,5,罗志晓,李成章,曹正国.黄芩苷对牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞上ICAM-1表达调节的研究,J,.口腔医学研究,2004,20(2):123. ,6,王砚宁,毕新岭,顾 军,等.黄芩甙治疗银屑病的机制研究,J,.中国中西医结合皮肤性病学杂志,2003,2(4):209. ,7,杨运伟.中西医结合治疗烧伤后疤痕增生30例,J,.中国中西医结合杂志,1995,15(9):573. ,8,Morris DE, Wu L, Zhao LL ,et al. 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