自组装多肽水凝胶包埋大蒜精油的控释研究

粮食与油脂0416ls07-04142016年第29卷第7期0416ls07-04自组装多肽水凝胶包埋大蒜精油的控释研究周天啸，刘馥歌，杨　涛，张　琳（中南林业科技大学食品科学与工程学院，稻米及副产物深加工国家工程实验室，　湖南长沙　410004）摘　要：研究Fmoc–F自组装多肽水凝胶对大蒜精油的包埋作用、控释特性和稳定作用。结果明：该水凝胶对大蒜精油的包埋率可达到97.07%；当pH≥6.5时，包埋大蒜精油后的水凝胶结构分解率不高于12.17%，可提高大蒜精油的稳定性；当5＜pH＜6.5时，凝胶结构部分分解；当pH≤5.0时，凝胶结构迅速分解，快速释放大蒜精油抑制大肠杆菌的生长；感官评价表明Fmoc–F水凝胶可显著掩盖大蒜精油的不良气味。关键词：大蒜精油；水凝胶；控释Studyoncontrolled-releaseofaself-assembledpeptidehydrogelforgarlicessentialoilZHOUTian-xiao，LIUFu-ge，YANGTao，ZHANGLin（CollegeofFoodScienceandEngineering，NationalEngineeringLaboratoryforRiceandByproductsDeepProcessing，CentralSouthUniversityofForestryandTechnology，Changsha410004，Hunan，China）Abstract：Theeffectsofaself–assembledhydrogelbasedonFmoc–Fontheencapsulation，controlledreleaseandstabilitywerestudied.Theresultsshowedthattheencapsulationefficiencyofpeptidehydrogelforgarlicessentialoilwas97.07%.WhenpH≥6.5，thedecompositionrateofhydrogelwaslessthan12.17%，whichcouldpreventthevolatilizationofgarlicessentialoil.WhenpHwasadjustedfrom6.5to5，thestructureofhydrogelbegantodisaggregate.WhenpH≤5.0，hydrogeldisaggregatedcompletely.ThenthegarlicoilcouldbereleasedcompletelytoinhibitthegrowthofEscherichiacoli.Furthermore，theobjectionableodorsofgarlicessentialoilcouldbemaskedbyhydrogelbasedFmoc–F.Keywords：garlicessentialoil；hydrogel；controlled–release中图分类号：TS225.1＋9文献标识码：A文章编号：1008―9578（2016）07―0014―05收稿日期：2016–02–29基金项目：国家自然科学基金项目（81501619）；湖南省自然科学基金项目（2015JJ3177）；湖南省教育厅一般项目（14C1184）；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（湘教通2015，2014）；湖南省食品科学与工程类大学生创新训练中心项目（2014）；长沙市科技计划项目（k1501003–31）；中南林业科技大学人才引进项目（2013RJ009）作者简介：周天啸（1991―），男，硕士研究生，研究方向为食品科学与营养。通信作者：张琳（1984―），女，讲师，博士研究生。大蒜精油是大蒜经过水蒸气蒸馏所得的油状产品〔1〕，主要含有大蒜辣素、大蒜新素及多种烯丙基和甲基组成的硫醚类化合物，对细菌、真菌、病毒等常见致病微生物具有很强的抑菌效果〔2〕，但其强刺激性、易挥发性和较低的物化稳定性严重制约了其作为食品功能性成分的应用〔3〕。Hadaruga等〔4〕曾尝试用β–环糊精微胶囊法提高大蒜精油的稳定性，但β–环糊精对大蒜精油的包埋率较低，不能控制其释放。多肽水凝胶是以多肽分子为凝胶因子，通过自组装作用束缚住水分子形成的半固体透明状凝胶〔5〕。相比于其他传统的包埋材料，具有化学毒性小、生物相容性好、易于合成及pH响应等优点〔6〕。本课题以Fmoc–F（Phe）为凝胶因子包埋大蒜精油，测定其包埋效率和抑菌效果，将包埋了大蒜精油的多肽凝胶用于布丁食品，对其进行感官评价。为大蒜精油的控制释放、不良气味的掩盖及其在食品抑菌方面的应用奠定了一定的研究基础。1　材料与方法1.1　材料与试剂大蒜精油：江西雪松天然药用油有限公司；大肠杆菌（Escherichiacoli）：南京便诊生物科技有限公司；N–（9–芴甲氧羰基）–L–苯丙氨酸（Fmoc–F）：纯度大于99%，吉尔生化有限公司；葡萄糖酸内酯（Gluconolactone，GDL）：纯度大于99%，Sigma–Aldrich公司；β–环糊精、无水乙醇、酵母提取物、蛋白胨、营养琼脂、氯化钠、氢氧化钠等：均为分析纯。布丁粉：市售。1.2　仪器设备FA1004B电子分析天平：精度0.0001g，上海佑科仪器仪表有限公司；SW–CJ–1FD超净工作台：0416ls07-04粮食与油脂0416ls07-042016年第29卷第7期15AIRTECH公司；UV–1800紫外可见分光光度计：日本岛津；SHZ–D（III）循环水真空泵：上海精密科学仪器有限公司；G154DWS高压灭菌锅：致微仪器有限公司；XMTE–8112水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；WH–3微型旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；DH4000BII电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；IS–RDD3恒温振荡器：郑州南北仪器有限公司；PHS–3C型pH计：上海仪电科学仪器有限责任公司。1.3　试验方法1.3.1　�包埋大蒜精油的Fmoc–F自组装多肽水凝胶的制备、大蒜精油包埋率、凝胶pH响应特性研究1.3.1.1　包埋大蒜精油的多肽水凝胶的制备和操作要点๓㧈㇪⇥'NPD�þ'᫷⋍ᡛ㢍ڑὍ䲅㒚܉㘢ϓ➕䊱㏛Ⅰ/B0)⏢⋞(%-图1　多肽水凝胶的制备流程图制备方法：称取40mgFmoc–F，加入3mL的超纯水、1mL0.1mol/L的NaOH和100μL的大蒜精油，混匀后40℃水浴5min，加入4.0mgGDL，用1000r/min的涡旋振荡仪振荡10s，静置，约1h后包有大蒜精油的凝胶生成。1.3.1.2　Fmoc–F自组装多肽水凝胶对大蒜精油包埋率的研究大蒜精油曲线的测定：用无水乙醇分别将大蒜精油稀释成10.80、5.40、3.60、2.70、2.16，1.80mg/L的标准液。以无水乙醇为背景液，测定大蒜精油标准液在210nm处的吸光值，以OD210nm表示。做3次平行试验，以大蒜精油浓度（mg/L）为横坐标，OD210nm为纵坐标，绘制标准曲线。包埋率计算公式：包埋率=1–产品表面油含量产品中的总油含量×100%表面油含量测定：无水乙醇快速冲洗法间接测定；总油含量：100μL。做3次平行试验，计算平均值。1.3.1.3　Fmoc–F自组装多肽水凝胶的pH响应特性研究在4支试管中制备4mL的Fmoc–F自组装多肽水凝胶待用，分别配制pH为6.5、6.0、5.5、5.0的0.1mol/L的磷酸缓冲液，取5mL缓冲液于各试管的凝胶上，置于37℃水浴内。分别在5、30、60、90、120、150min时取100μL缓冲液，稀释后测定264nm下的吸光值，以表示缓冲液中的Fmoc–F凝胶分解情况。做3次平行试验，取平均值。1.3.2　�包埋大蒜精油的β-环糊精微胶囊制备及包埋率研究1.3.2.1　包埋大蒜精油的β–环糊精微胶囊制备方法60℃水浴、芯/壁材比1∶8（mL/g）条件下，将大蒜精油乙醇溶液（V精油∶V乙醇=1∶20）缓慢滴入β–环糊精的过饱和溶液并搅动，待白色沉淀析出，继续搅拌2h后停止加热，冷却至室温，放入4℃冰箱中静置24h，常温抽滤。滤渣用无水乙醇快速冲洗至微胶囊表面无大蒜精油气味，将滤渣连同滤纸一同取出，置于40℃烘箱中干燥至恒重，得白色微胶囊产物。1.3.2.2　β–环糊精对大蒜精油的包埋率研究包埋率计算如上所述。表面大蒜精油含量测定：无水乙醇快速冲洗法间接测定；大蒜精油总含量测定：破坏微胶囊壁材后，用无水乙醇提取大蒜精油后进行测定。1.3.3　大蒜精油及包埋产物抑菌特性研究以大肠杆菌作为供试菌株，采用滤纸片扩散法（固体培养基）和分光光度法（液体培养基）进行抑菌试验。1.3.3.1　LB培养基的配制酵母提取物2.5g、蛋白胨5.0g、NaCl5.0g用超纯水加热溶解。再加入7.5g琼脂，搅动至溶液透明，定容至500mL后，放入高压灭菌锅（121℃，20min）中灭菌待用，制成LB固体培养基。LB液体培养基不加入琼脂，其他过程如上所述。1.3.3.2　大蒜精油的抑菌作用研究向培养皿中倒入约20mL培养基，紫外灭菌30min，待培养基冷却后，制成LB固体培养基，吸取150μL大肠杆菌菌悬液（约1×106CFU/mL）于培养基上涂布均匀，在37℃恒温培养箱中培养1h。1h后取出培养皿，将5mm滤纸片贴于培养基上，并依次滴加10μL分别稀释了90、100、110、120、130倍的大蒜精油，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h，测量粮食与油脂0416ls07-04162016年第29卷第7期0416ls07-04抑菌圈的直径，做3次平行试验，计算平均值。以完全不长菌的平板对应的浓度为大蒜精油的最低抑菌浓度（MIC）。1.3.3.3　凝胶包埋产物的抑菌特性研究在无菌条件下，分别向A、B、C三个锥形瓶中加入18mL的LB液体培养基以及大肠杆菌悬液150μL。其中向A瓶中加入12mLFmoc–F自组装多肽水凝胶和300μL无菌水，作为空白组；向B瓶中加入12mLFmoc–F自组装多肽水凝胶和300μL大蒜精油，作为对照组；向C瓶中加入包埋了300μL大蒜精油的12mLFmoc–F自组装多肽水凝胶，作为试验组。将三个锥形瓶于37℃振荡培养10h，转速200r/min，在无菌条件下，分别在0、2、4、6、8、10h时测定600nm下的吸光值，以OD600nm表示，表示大肠杆菌的浓度。做3次平行试验，取平均值。1.3.4　布丁果冻的感官评价参与感官评价的人员共30名，皆为食品专业在校大学生志愿者，年龄在21~24岁，其中男女比例为13∶17，在试验前对参与本次感官评价的人员进行集中培训，所有感官试验均由这30人完成。采用GB/T12311–2012《感官分析方法三点检验》中的差别检验法对经凝胶包埋的大蒜精油布丁果冻和未经包埋的大蒜精油布丁果冻进行感官评价。具体流程：制备经凝胶包埋的大蒜精油布丁果冻（A样品）和未经包埋的大蒜精油布丁果冻（B样品），每三个样品为一组，其中两个为同一样品。将ABB、AAB、ABA、BAA、BBA、BAB六组随机分发给30位评价员。告知评价员有一个样品与其他两个不同，并让评价员指出不同的样品。待所有评价员检测完成后，对正确答案数进行统计，再参考表1，确定样品间有无显著差异。表1　三点检验确定存在显著性差别所需最少正确答案数〔7〕nα0.200.100.050.010.001301314151719注：α–显著性水平；n–评价员数2　结果与分析2.1　Fmoc–F自组装多肽水凝胶的形成如图2所示，将Fmoc–F溶解在NaOH溶液后，溶液中的Fmoc–F分子呈现无规则状态（图2A）。加入GDL后，GDL水解生成的H+使溶液pH逐渐下降至Fmoc–F的等电点附近。此时，分子间的非共价键力（疏水作用力、氢键、π–π堆积等）使Fmoc–F分子逐步聚集，组装成规则有序的一维纳米结构（图2B），随着组装的进一步深入，一维纳米结构相互缠结成三维的多孔状网络，从而束缚住水分子形成了透明的、自支撑的半固体凝胶（图2C）〔8〕。在该水凝胶体系中，Fmoc–F的浓度仅为1%（g/mL），即一分子Fmoc–F可以束缚2152个水分子，说明Fmoc–F具有非常强的截留能力。图2　Fmoc-F凝胶制备示意图"'NPD�'⏢⋞'NPD�'ᰵᎻ㜖㏰㷱̵㏓㑽㐈㏿Ჰᒎ᜼#$2.2　Fmoc–F自组装多肽水凝胶及β–环糊精对大蒜精油的包埋率图3　大蒜精油含量标准曲线048120.00.20.40.60.81.0๓㧈㇪⇥≿Ꮢ� NH�-OD���ON以大蒜精油浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作大蒜精油含量标准曲线，如图3。由图3可知，浓度在1.80~10.80mg/L时，大蒜精油在210nm下的吸光值与大蒜精油浓度呈良好的线性关系，标准曲线方程为Y=0.0146+0.0761X（R2=0.996）。分别利用Fmoc–F自组装多肽水凝胶和β–环糊精对大蒜精油进行包埋，利用大蒜精油含量标准曲线计算包埋率，比较包埋物的芯材壁材比，结果如表2。表2　Fmoc-F自组装多肽水凝胶及β-环糊精包埋产物性质包埋材料包埋率/%芯/壁材比/（mL/g）Fmoc–F自组装多肽水凝胶97.071∶0.42β–环糊精60.601∶8从表2可知，Fmoc–F自组装多肽水凝胶对大蒜精油的包埋率（97.07%）显著大于β–环糊精（60.60%），而且包埋1mL芯材所需要的Fmoc–F质量（0.42g）仅为β–环糊精（8g）的5.25%。因此，0416ls07-04粮食与油脂0416ls07-042016年第29卷第7期17Fmoc–F自组装多肽水凝胶是一种高效的大蒜精油包埋材料。2.3　Fmoc–F自组装多肽水凝胶的pH响应特性为了研究Fmoc–F自组装多肽水凝胶在不同pH条件下的分解情况，分别将Fmoc–F凝胶置于不同pH的缓冲溶液中检测其分解率，如图4。图4　不同pH条件下Fmoc-F自组装多肽水凝胶的分解率0306090120150020406080100'NPD�'܉㘢ܲ㼏⢳��ᬢ䬠�NJOQ)����Q)����Q)����Q)����Fmoc–F成胶后，测得其pH为7.2。在pH6.5的缓冲液中，凝胶仅在最初的5min内分解了11.1%，在随后的5~150min内几乎没有分解（150min，分解率12.17%）。在pH为6.0和5.5的缓冲液中，凝胶的分解率逐渐增长，到90min时其分解率分别为35.44%和51.48%，90~150min内分解率没有显著变化。在pH为5.0的缓冲液中，前90minFmoc–F的分解率不断增加，90min时有91.45%的Fmoc–F凝胶分解，在150min时凝胶彻底分解（分解率100%）。以上结果表明，Fmoc–F凝胶对pH有显著响应。在pH为7.2时，分子之间的非共价键力作用使得凝胶形成；在pH≥6.5时，凝胶几乎不分解，其三级网络结构稳定且完整；当pH＜6.5时，随着溶液的pH降低，Fmoc–F分子所带的正电荷量逐渐增加，分子间的静电斥力逐渐增大，凝胶内部分子间力的平衡被破坏，凝胶三级网络结构坍塌，凝胶结构分解〔9〕。2.4　大蒜精油的抑菌作用大蒜精油中所含的大蒜素、大蒜烯等有机硫化物可以与大肠杆菌细胞内含巯基的蛋白反应，破坏蛋白结构，抑制细菌生长〔10〕。为了测定大蒜精油对大肠杆菌的有效抑菌浓度，测量了不同浓度下大蒜精油的抑菌圈大小，结果如表3所示。由表3可知，在8.31~12.00mg/L浓度范围内，大蒜精油对大肠杆菌均有良好的抑菌效果。当浓度为10.80mg/L（稀释100倍）时，抑菌圈直径为0.94±0.064cm；当浓度为12.00mg/L（稀释90倍）时，平板完全不长菌，即大蒜精油对大肠杆菌的最小抑菌浓度为12.00mg/L。2.5　Fmoc–F自组装多肽水凝胶包埋产物的抑菌作用为了研究Fmoc–F水凝胶对大蒜精油抑菌效果的影响，对大蒜精油、多肽水凝胶包埋的大蒜精油做液体抑菌试验。分别设置空白组A（不含大蒜精油组）、对照组B（含大蒜精油抑菌组）和试验组C（Fmoc–F水凝胶包埋等量大蒜精油抑菌组）（其中B、C中精油浓度均为10.80mg/L），测定3组培养液中大肠杆菌的OD600nm值（试验方法如1.3.3.3）及此时培养液的pH，结果如表4所示。表4　大蒜精油凝胶包埋产物抑菌效果时间/hA组ODD600nm（pH）B组OD600nm（pH）C组OD600nm（pH）00（7.0）0（7.0）0（7.0）0.50.080（6.7）0.068（6.7）0.092（6.6）20.332（5.8）0.183（6.0）0.328（5.6）40.628（5.1）0.408（5.5）0.385（5.2）60.896（4.7）0.485（5.2）0.242（5.0）81.315（4.4）0.647（4.9）0.267（5.1）101.369（4.3）0.697（4.7）0.293（5.2）由表4可知，A组未加大蒜精油只加入多肽水凝胶，其大肠杆菌与正常大肠杆菌的生长周期一致，0~2h为调整期（OD600nm值为0~0.332），2~8h对数期（OD600nm值为0.332~1.315），8~10h为稳定期（OD600nm值为1.315~1.369）。该结果表明，Fmoc–F水凝胶不影响大肠杆菌的正常生长。B组添加了10.80mg/L大蒜精油，0~2h内大肠杆菌生长明显受到抑制（OD600nm值为0~0.183），2~10h内大肠杆菌的浓度却上升（OD600nm值为0.183~0.697），这是由于大蒜精油的易挥发性和不稳定性，培养液中大蒜精油浓度随着培养时间的增加而逐渐降低，抑菌效果逐渐减弱。试验组C添加了10.80mg/L的Fmoc–F水凝胶包埋的大蒜精油，0~2h内大肠杆菌浓度有所增加（OD600nm值为0~0.328），与对照组A组并无显著性差异，但之后的4~6h内，大肠杆菌数量显著下降（OD600nm值为0.385~0.242），大肠杆菌的生长被明显抑制，并在6~10h内大肠杆菌的数量保持稳定（OD600nm值为0.242~0.293）。对比不同培养时间下培养液的pH，A组中培养液的pH因为大肠杆菌数量的增多而明显下降。在添表3　大蒜精油对大肠杆菌的抑菌效果大蒜精油浓度/（mg/L）12.0010.809.829.008.31抑菌圈直径/cm–0.94±0.0640.67±0.1050.64±0.0640.47±0.075注：–表示无菌生长粮食与油脂0416ls07-04182016年第29卷第7期加了大蒜精油的B组中，培养液的pH也在不断降低，但其降低的程度较A组小。在添加包裹了大蒜精油的多肽水凝胶样品C中，培养液的pH也在不断降低，其降低的程度比前两组都小。结合培养液的OD600nm值可见，培养液的pH与大肠杆菌的数量成反比关系。该结果，大蒜精油可以抑制大肠杆菌的生长，但在后期（2~10h）大蒜精油易挥发性，导致培养液中精油浓度逐渐降低，使得抑菌效果逐渐减弱。在加入经凝胶包埋的大蒜精油C组中，刚开始（0~0.5h）该包埋物的抑菌效果不明显，随着大肠杆菌的生长，pH不断降低，当pH降低至5.5后，Fmoc–F水凝胶结构开始快速分解，大蒜精油被迅速释放到溶液中，开始有效抑制大肠杆菌的生长。以上结果表明：Fmoc–F自组装多肽水凝胶能降低培养液中大蒜精油的挥发，提高大蒜精油的稳定性，并且由于Fmoc–F自组装多肽水凝胶的pH响应特性，其可以对大蒜精油进行有效的控制释放。2.6　含大蒜精油凝胶包埋产物的布丁果冻感官评定为评价Fmoc–F凝胶对大蒜精油刺激性气味的掩盖作用，选定30个评价员通过三点检验的差别检验法，对经凝胶包埋的大蒜精油布丁果冻（A）和未经包埋的大蒜精油布丁果冻（B）样品进行评价，结果如表5所示。表5　三点检验实验结果评价员人数/人正确答案数/人显著性302323＞19α＜0.001注：α–显著性水平由表5可知，三点检验回答正确数为23人，由于23＞19（当n=30，α=0.001时，所需最少正确答案数为19），所以α＜0.001，A、B两个样品存在极显著差别。给出正确答案的评价人员均表示，B样品有强烈的刺激性大蒜气味，而A样品几乎不存在不良气味，这说明Fmoc–F凝胶几乎可以完全掩盖大蒜精油的不良气味。3　结论本课题以Fmoc–F为凝胶因子将大蒜精油包埋制成凝胶，研究该多肽水凝胶提高大蒜精油的稳定性、控释作用和对大蒜精油不良气味的掩盖作用。结果表明：Fmoc–F自组装多肽水凝胶对大蒜精油的包埋率可达到97.07%；当pH≥6.5时，Fmoc–F水凝胶结构稳定，该pH与没有大肠杆菌生长的环境下培养液的pH相近，包埋作用保持了大蒜精油的稳定性，降低了大蒜精油的挥发性；pH＜6.5时，凝胶结构开始分解，该pH与大肠杆菌开始生长的pH相近，可以缓慢释放大蒜精油，部分抑制大肠杆菌的生长；大肠杆菌的继续生长将使pH进一步降低，当pH≤5.0时，Fmoc–F水凝胶结构快速分解，快速释放大量大蒜精油，大肠杆菌的生长被抑制。对添加包埋了大蒜精油的Fmoc–F水凝胶的布丁食品进行的感官评价结果表明，Fmoc–F水凝胶几乎可以完全掩盖大蒜精油的不良气味。〔参考文献〕〔1〕TOCMOR，WANGC，LIANGD，etal.Organosulphideprofileandhydrogensulphide–releasingcapacityofgarlic（AlliumsativumL.）scapeoil：EffectsofpHandcooking[J].JournalofFunctionalFoods，2015，17：410–421.〔2〕VISWANATHANV，PHADATAREAG，MUKNEA.AntimycobacterialandantibacterialactivityofAlliumsativumbulbs[J].IndianJournalofPharmaceuticalSciences，2014，76（3）：256.〔3〕WANGJ，CAOY，SUNB，etal.Physicochemicalandreleasecharacterisationofgarlicoil–β–cyclodextrininclusioncomplexes[J].FoodChemistry，2011，127（4）：1680–1685.〔4〕HADARUGADI，HADARUGANG，RIVISA，etal.ThermalandoxidativestabilityoftheAlliumsativumL.bioactivecompounds/alpha–andbeta–cyclodextrinnanoparticles[J].RevistadeChimie，2007，58（11）：1009–1015.〔5〕WHITESIDESGM，GRZYBOWSKIB.Self–assemblyatallscales[J].Science，2002，295（5564）：2418–2421.〔6〕SHARMAPP，RATHIB，RODRIGUESJ，etal.Self–assembledpeptidenanoarchitectures：Applicationsandfutureaspects[J].CurrentTopicsinMedicinalChemistry，2015，15（13）：1268–1289.〔7〕感管分析方法三点检验：GB/T12311–2012[S].〔8〕JACLYNR，ZAMITHCA，ADAMSDJ.Theimportanceoftheself–assemblyprocesstocontrolmechanicalpropertiesoflowmolecularweighthydrogels[J].Cheminform，2013，44（12）：5143–5156.〔9〕SINGHV，SNIGDHAK，SINGHC，etal.Understandingtheself–assemblyofFmoc–phenylalaninetohydrogelformation[J].SoftMatter，2015，11（26）：5353–5364.〔10〕KYUNGKH.Antimicrobialpropertiesofalliumspecies[J].CurrentOpinioninBiotechnology，2012，23（2）：142–147.更正信息　　刊于本刊2016年第六期中《小麦制粉工艺与面粉溶剂保持能力的关联性研究》一文，作者更正如下：陆娅，陈慧，包成龙，张进萍。