水产品中微囊藻毒素的测定 标准文本（食品安全国家标准）

食品安全国家水产品中微囊藻毒素的测定范围本标准规定了液相色谱-串联质谱法和间接竞争酶联免疫吸附法测定水产品中微囊藻毒素（环状七肽）的方法。本标准适用于鱼、虾、河蚌等水产品中微囊藻毒素的测定。第一法液相色谱-串联质谱法2原理微囊藻毒素在波长238nm下有特异的吸收峰。不同的微囊藻毒素异构体在高效液相色谱中有不同的保留时间，与标准微囊藻毒素的保留时间相比较，可确定样品中微囊藻毒素的组成，依据电喷雾离子源离子化及多反应监测（MRM）方式检测，外标法定量。3试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.2甲酸(HCOOH)：色谱纯。3.1.3甲酸铵：色谱纯。3.1.4乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.1.5氮气：纯度≥99.99%。3.2试剂配制3.2.120%（体积分数）甲醇溶液：20mL甲醇（3.1.1）与80mL水混合。3.2.280%（体积分数）甲醇溶液：80mL甲醇（3.1.1）与20mL水混合。3.2.3淋洗溶液：10mL水；10mL20%甲醇溶液（3.2.1）。3.2.4洗脱溶液（酸化甲醇溶液）：用甲醇（3.1.1）将0.1mL甲酸（3.1.2）定容至100mL。3.2.5空白基质溶液:分别称取与待测样品基质相同的、不含所测微囊藻毒素的阴性试样10份于50mL离心管中。以下操作按5.1.1样品处理和5.1.2净化步骤进行。合并所得10份试样的纯化液，用尼龙针头过滤器（4.12）过滤。弃去前面的0.5mL滤液，接取少量滤液供液相色谱-质谱联用仪检测。获得色谱-质谱图后，对照相应的保留时间，应不含微囊藻毒素。剩余滤液转移至棕色瓶中-20℃保存，供配制标准系列溶液使用。3.3标准品3.3.1微囊藻毒素标准品：微囊藻毒素-LR(MC-LR)、微囊藻毒素-RR(MC-RR)，纯度不低于95%。3.4标准品配置3.4.1微囊藻毒素标准贮备液：分别称取微囊藻毒素标准品（3.3.1）MC-LR、MC-RR各0.5mg（按实际含量折算，精确度(0.05mg），用500(L甲醇（3.1.1）溶解，再用纯水定容至50mL，-20℃保存。此标准贮备溶液的浓度为10(g/mL。3.4.2微囊藻毒素标准系列溶液：吸取微囊藻毒素标准储备液（3.4.1）10μL于10mL容量瓶中，用氮气将甲醇吹至近干，空白基质溶液（3.2.5）定容至刻度，所得浓度为10ng/mL的微囊藻毒素标准中间溶液。再用空白基质溶液（3.2.5）将微囊藻毒素标准中间溶液稀释为0.1(g/L、0.2(g/L、0.5(g/L、1.0(g/L、2.0(g/L、5.0(g/L和10.0(g/L的系列标准工作液。4仪器和设备实验室常规仪器、设备及下列各项。4.1天平：感量为0.001g和0.00001g。4.2均质器。4.3容量瓶：10mL，50mL，100mL。4.4250mL具塞锥形瓶。4.5离心管：50mL。4.6固相萃取小柱：WatersSep-pak®ClassicC18，或同等性能的固相萃取小柱。4.7移液管：50(L，100(L，1000(L。4.850mL玻璃注射器和固相萃取装置。4.9旋转蒸发器或吹氮浓缩器。4.10涡旋混合器。4.11离心机，转速大于6000g。4.12尼龙针头过滤器，0.22μm。4.13玻璃纤维滤纸：WhatmanGF/F规格，或同等性能的玻璃纤维滤纸。4.14液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源。4.15色谱柱：MerkLiChroCART®125-2RP-18e，填料粒径5μm，或同等性能的色谱柱。4.16微量移液器：10μL，100μL，1mL，5mL。5分析步骤5.1试样制备取抽检样品可食部分约500g，充分均质或粉碎，装入洁净容器中，密封，并标明标记。试样置于-18℃以下避光保存，一个月内须完成检测。5.1.1提取鱼、虾、河蚌等水产品样品准确称取5g（精确至0.01g）试样，置于50mL离心管中，加入15mL80%甲醇水溶液，充分震荡均匀，6000g离心10min，取上清液于新离心管中。残渣重复提取一次，合并两次提取液，以玻璃纤维滤纸（4.13）过滤。取6mL滤液加入20mL水稀释。待净化。5.1.2净化C18固相萃取小柱（4.6）使用前依次用10mL甲醇（3.1.1）和10mL水活化，流速控制在1~2滴/秒，活化过程中保持萃取小柱始终充满液体。将5.1.1提取液全部过柱后，以10mL20%甲醇水溶液(3.2.1)对C18固相萃取柱进行淋洗，清楚部分杂质，最后以10mL含有0.1%甲酸的甲醇（3.2.4）洗脱微囊藻毒素，待吹干定容。5.1.3定容吹氮浓缩器（4.9）浓缩5.1.2净化样品至近干。加入1mL20%甲醇水溶液(3.2.1)充分溶解，用尼龙针头过滤器（4.12）过滤后待上机检测。5.2仪器参考条件5.2.1液相色谱参考条件流动相：A液，水溶液（含有0.1%甲酸，5mmol甲酸铵）；B液，95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸，5mmol甲酸铵）。梯度洗脱：参见附录A中的A.1。流动相流动速度：0.3mL/min。柱温：30℃。进样量：10μL。5.2.2质谱参考条件离子源：电喷雾离子源（ESI）。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监测（MRM）。离子源电压：5500V。离子源温度：650℃。雾化气、气帘气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。多反应监测（MRM）参数详见表1。表1MRM参数 微囊藻毒素 母离子（m/z） 子离子（m/z） 采集时间（ms） 去簇电压（V） 碰撞能量（V） MC-LR 498.4 135.1* 100 42 18 861.5 100 42 15 MC-RR 519.9 135.1* 100 80 42 127.1 100 80 60*为定量子离子标准曲线的制作5.3.1定性试样中微囊藻毒素色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰保留时间相比较，变化范围应在±2.5%之内。微囊藻毒素的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥10）。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一种化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液比，其允许偏差不超过表2规定的范围。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%各检测目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样品中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20%），同时要求被测试样品中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。空白试验不称取样品，按5.3.1的步骤做空白试验。应确认不含有干扰被测组分的物质。定量用进样器分别吸取10μL标准系列溶液（3.4.2），注入液相色谱-串联质谱仪（4.14）。按照5.3.1和5.3.2确立的条件，测定标准系列溶液中微囊藻毒素的离子强度，外标法定量。将标准系列溶液（3.4.2）由低到高浓度进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。5.4试样溶液的测定吸取10μL试样（5.1.3）注入液相色谱仪-质谱联用仪（4.14），依据标准曲线计算样品中微囊藻毒素的含量。色谱峰参考保留时间：MC-LR6.4min；MC-RR5.8min。待测样液中被测组分的响应值若超过线性范围，则将样液用空白基质溶液稀释后重新进样分析或减少称样量，重新按5.1.1进行处理后再进样分析。6分析结果的表述外标法定量，按式（1）计算微囊藻毒素的残留量。……………………（1）式中：X​—试样中微囊藻毒素的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；c—试样中微囊藻毒素的浓度，单位为微克每升（(g/L）；V—样品定容体积，单位毫升（mL）；m—试样的称样量，单位克（g）。计算结果以重复性条件下获得的三次独立测定结果的计算平均值表示，结果保留三位有效数字（或小数点后2位）。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他方法检出限为0.3μg/kg，定量限为1(g/kg。第二法间接竞争酶联免疫吸附法9原理水产品中的微囊藻毒素经提取及净化处理后与过量的针对微囊藻毒素的特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的预包被微囊藻毒素人工抗原结合。加入针对微囊藻抗体的酶标二抗和酶对应的底物显色，与标准微囊藻毒素的该反应结果比较，计算样品中微囊藻毒素的含量。10试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的一级水。10.1试剂10.1.1抗微囊藻毒素（MC-LR）的单克隆抗体：杂交瘤技术制备，经亲和层析纯化。10.1.2人工抗原：MC-LR-牛血清白蛋白偶联物（MC-LR-BSA）。10.1.3牛血清白蛋白(BSA)：生化试剂。10.1.4酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG。10.2试剂配制10.2.120%（体积分数）乙醇溶液：20mL乙醇与80mL水混合。10.2.2标准稀释液：称取0.005g明胶和0.1g叠氮化钠，用水溶解，定容至100mL。10.2.3磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）：分别称取0.2g磷酸氢二钾、2.9g磷酸氢二钠（Na2HPO4(12H2O）、8.0g氯化钠、0.2g氯化钾，混合，用水溶解，定容至1000mL。10.2.4乙酸钠溶液（0.1mol/L）：称取1.36g三水合乙酸钠，用水溶解，定容至100mL。10.2.5乙酸溶液（1mol/L）：量取5.88mL冰乙酸，加水定容至100mL。10.2.6硫酸溶液(1mol/L)：量取55.6mL浓硫酸,沿玻棒缓缓注入约200mL水中，搅拌，冷却至室温，加水定容至1000mL。10.2.7包被溶液：称取1mg人工抗原（3.1.2），溶解于1000mL磷酸盐缓冲溶液（3.2.3）中。10.2.8封闭溶液：称取0.5g明胶，加少量磷酸盐缓冲溶液（3.2.3），加热溶解，冷却后定容至1000mL。10.2.9洗涤溶液（PBS-T）：量取0.5mL吐温-20，用磷酸盐缓冲溶液（3.2.3）定容至1000mL。10.2.10抗体稀释溶液：称取0.5g明胶，加少量洗涤溶液（3.2.9），加热溶解，冷却后定容至1000mL。10.2.11二抗溶液：1体积酶标二抗（3.1.4）与5000体积抗体稀释溶液（3.2.10）混合。10.2.12底物缓冲溶液：用乙酸溶液（3.2.5）调整乙酸钠溶液（3.2.4）的pH为5.0。10.2.13底物贮备溶液：称取10mg四甲基联苯胺(TMB)，溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。10.2.14底物溶液：量取100(L底物贮备溶液（3.2.13），加2(L30%过氧化氢和10mL底物缓冲溶液(10.2.12)。临用时配制。10.3标准品10.3.1微囊藻毒素标准品：微囊藻毒素-LR(MC-LR)、微囊藻毒素-RR(MC-RR)，纯度不低于95%。10.4标准品配置10.4.1微囊藻毒素（MC-LR）标准系列溶液：称取适量微囊藻毒素（MC-LR）（3.3.1），用20%乙醇溶液（3.2.1）配制成MC-LR含量为0.5mg/mL的溶液。再用标准稀释液（3.2.2）稀释至MC-LR含量为10(g/mL的溶液。继续配制MC-LR含量分别为0.1(g/L、0.2(g/L、0.5(g/L、1(g/L、2(g/L的标准系列溶液。11仪器和设备11.1不锈钢筛：500目。11.2离心机，转速大于6000g。11.3电动振荡器。11.4酶标仪：内置450nm滤光片。11.5培养箱：可控温度，37℃。11.6酶标微孔板：96孔。11.7微量加样器及配套吸头。11.8真空旋转浓缩器或吹氮浓缩器。12分析步骤12.1试样制备12.1.1样品提取可按第一法5.1.1操作。12.1.2样品净化按第一法5.1.2操作。12.1.3定容样品以真空旋转浓缩器（4.8）浓缩至近干。以纯水定容至500(L，冰冻保存待检测。注：亦可采用吹氮浓缩器浓缩样品至近干。12.2仪器参考条件12.2.1包被酶标微孔板将包被溶液（3.2.7）加入酶标微孔板（100微升/孔），4℃下放置过夜。12.2.2封闭酶标微孔板用洗涤液（3.2.9）洗涤3次放置过夜的酶标微孔板（每次洗涤3min），加入封闭溶液（3.2.8）封闭酶标微孔板（200微升/孔），37℃下放置2h，或4℃下放置过夜。12.2.3酶标仪（4.4）在450nm处测定吸光度。12.3标准曲线的制作12.3.1抗原抗体反应量取500(L抗微囊藻毒素MC-LR的单克隆抗体（3.1.1）和500(L微囊藻毒素标准系列溶液（3.4.1中的0.1(g/L溶液）于1.5mL试管中，混合后用电动振荡器（4.3）振荡均匀，室温静置30min。按以上操作配制其余反应液。这些反应液用于制作微囊藻毒素标准竞争曲线。12.3.2竞争反应用洗涤液（3.2.9）洗涤3次封闭过的酶标微孔板（每次洗涤3min），滴加抗体抗原反应溶液（5.3.1）（100微升/孔）。不同浓度做3次平行试验。37℃或室温放置90min。在酶标微孔板的适当孔位滴加抗体稀释溶液（3.2.10），作为阴性对照。12.3.3二抗溶液与抗微囊藻毒素（MC-LR）的单克隆抗体反应用洗涤液（3.2.9）洗涤3次竞争反应后的酶标微孔板（每次洗涤3min），滴加二抗溶液（3.2.11）（100微升/孔），37℃或室温放置30min。12.3.4显色及显色后吸光度的确定用洗涤液（3.2.9）洗涤5次经5.3.3反应的酶标微孔板（每次洗涤3min）。滴加底物溶液（3.2.14）（100微升/孔），37℃或室温放置15min-20min，显色。滴加1mol/L硫酸（3.2.6）（50微升/孔），终止显色反应。30min内，用酶标仪（4.4）在450nm处，测定显色后的吸光度。12.3.5标准曲线取经5.3.4测定的标准系列溶液的吸光度平均值与水样吸光度平均值，按式(2)分别计算标准系列溶液吸光度（或水样吸光度）与阴性对照试验的比值（X2）。 X2(%)= OD1 (100 …………………………….(2) OD2 式中：OD1——标准系列溶液的吸光度平均值；OD2——样品吸光度平均值。以X2%为纵坐标，不同标准系列溶液浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。依据测定样品的吸光度，在标准曲线上查出（或用回归方程计算出）样品中微囊藻毒素的浓度（A）。12.4试样溶液的测定量取500(L抗微囊藻毒素MC-LR的单克隆抗体（3.1.1）和500(L样品（5.1.3）于1.5mL试管中，混合后用电动振荡器（4.3）振荡，室温静置30min。此反应液用于测定样品中微囊藻毒素的含量。13分析结果的表述样品中微囊藻毒素的含量（X3）以(g/kg表示，按式（3）计算：……………………………（3）式中：A—试样中微囊藻毒素的浓度，单位为微克每升（(g/L）；V—样品定容体积，单位毫升（mL）；f—样液稀释因子；m—试样的称样量，单位克（g）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的计算平均值表示，结果保留三位有效数字（或小数点后2位）。14精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他方法检出限为0.03(g/kg，定量限为0.1(g/kg。附录A表A.1流动相时间梯度 时间 流速μL/min A% B% 0 300 75 25 5.0 300 20 80 7.0 300 20 80 7.1 300 75 25 12.0 300 75 2587_1234567890.unknown_1234567891.unknown