I3K在L选择素和PSGL1信号通路中的作用分析

r; '"……..... fIlf f f Ir l Ir ll IIII fi lll ＼1 806037 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取 得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文 中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 学位论文使用授权 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编本学位 论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 日 期：翟121 2：竺 日 期： 差 学位论文作者签名澎量壁塾 指导教师签名： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 丁 a ‘ / 摘 要 在许多病理或生理条件下，白细胞将跨越血管内皮，迁移到下层组织从而离开血液， 这一过程称为白细胞跨内皮迁移(TEM)。目前已经明确，白细胞和内皮细胞上的许多粘 附分子以及调控粘附和趋化的胞内信号分子参与了白细胞的跨内皮迁移。一方面，这一 过程需要调控血管内皮的完整性。另一方面，血液中的白细胞需要被血管内皮捕获、沿 血管内皮滚动、粘附并穿越血管内皮，最终到达炎症部位。 参与白细胞跨内皮迁移的粘附分子主要有两类，即选择素家族分子和整合素家族分 子。其中，L一选择素和PSGL-1分别是一种选择素和选择素配体。它们均组成性地表达 于白细胞微绒毛顶端，在白细胞跨内皮迁移过程中最先接触血管内皮。因此，L一选择 素和PSGL-1在白细胞跨内皮迁移的起始粘附阶段起关键作用。事实上，它们不仅能够 识别并结合表达在活化的内皮细胞表面的相应配体，使白细胞在快速流动的血液中减 速，还能够作为信号受体向白细胞内转导并放大炎症信号，为白细胞和血管内皮之间建 立稳定粘附做准备。 有关L一选择素和PSGL一1信号通路的研究有很多。通过对比研究L一选择素和 PSGL-1所引起的信号通路，我们发现二者作为两种不同的信号分子，虽然其胞浆尾部 的氨基酸序列同源性很低，但是其信号通路却有很多相似性。二者的胞浆尾部都可以通 过ERM蛋白和细胞骨架结合；二者都可以通过胞浆尾部募集信号复合体，引起CSF一1 的表达上调。在某些条件下，L一选择素和PSGL-1甚至可以通过协同作用而相互补偿其 生理功能。然而，目前还没有明确L一选择素和PSGL-1如何引起相似的信号途径，也 没有找到这两条信号通路的整合点。在研究哪种激酶作为L一选择素和PSGL-1信号通 路的关键整合点起作用时，我们注意到了P13K这种特殊的激酶，它可以将磷脂酰肌醇 (4，5)7-磷酸磷酸化为脂类第二信使磷脂酰肌醇(3，4，5)三磷酸，从而参与调控 细胞骨架和基因转录调控。我们的研究表明，在白细胞跨内皮迁移的起始粘附阶段，L 一选择素和PSGL-1可以作为E一选择素的配体，引起F一肌动蛋白的聚合和重新分布， 从而维持白细胞在E一选择素上的滚动。P13K在L一选择素和PSGL—l受到E一选择素刺 激后被迅速活化，在刺激5分钟时活性最强，在刺激10分钟时仍然能够检测到其活性。 活化的P13K能够活化下游的细胞骨架调控者-Vavl，P13K的特异性抑制剂LY294002能 够抑制E一选择素刺激引起的Vavl的活化。P13K活化后通过调控F一肌动蛋白聚合和重 新分布来参与中性粒细胞在E一选择素上的滚动。但是P13K经典的上游激酶Syk／Zap70 不参与P13K的活化。此外，我们以Jurkat T细胞为材料，通过体外共转染和Realtime PCR实验证明L一选择素和PSGL-1还能够引起IL—18的表达，从而为L一选择素和PSGL一1 作为信号受体参与白细胞活化提供了证据。P13K也参与了L一选择素和PSGL-1抗体交 联所引起的IL-18基因的表达。 综上所述，我们的实验首次表明，L一选择素和PSGL-1可以通过P13K作为二者信 号通路的关键整合点之一，参与调控细胞骨架和前炎症基因IL-18基因的表达，进而在 白细胞跨内皮迁移和白细胞活化过程中起关键作用。 关键词：中性粒细胞滚动；细胞骨架；L一选择素；PSGL一1；P13K；IL一18 II Abstract Under numerous pathological or physiological conditions，leukocytes will transmigrate through the endothelium clefts to the underlying tissue，and this process is called leukocyte transendothelium migtation(TEM)．Till nOW，it is known that many adhesion molecules on leukocytes and endothelium，and the intracellular signals which regulate adhesion and chemotaxis play parts in the transendothelium migtation of leukocytes．On one hand，the integrity of endothelium needs to be regulated in the process．One the other，the leukocytes in the blood need to be caught and roll on the endothelium,adhere to and subsequently traverse the endothelium and finally reach the inflammation sites． There are mainly two kinds of adhesion molecules which are involved in leukocyte TEM，namely the selectin and integrin families，among which L-selectin and PSGL-1 are a kind of selectin and selectin ligand，respectively．They are both expressed constitutively on the tips of leukocyte microvilli，and are the first ones to get in touch with the endothelium during leukocyte TEM．Therefore，L-selectin and PSGL-1 function crucially during the initial adhesion of leukocyte TEM．In fact L-selectin and PSGL-l Can not only recognize and bind the corresponding ligands expressed on activated endothelium，which speeds down the leukocytes in the fast—running blood．They Can also function as signal receptors to transduce and amply inflammation signals which prepare for the stable adhesion between leukocytes and endothelium． There are quite a large number of researches on L-selectin and PSGL 1 signaling．By comparing the signaling pathways initiated from L·selectin and PSGL-l，we found that there are great similarities between them，although they are different signal molecules，and the amino acid sequences of their cytoplasmic domain are of low homology．Both their cytoplasmic domains are connected to cytoskeleton by ERM．Both of them recruit signal complexes through their cytoplasmic domains and upregulate CSF一1 gene expression．Under some conditions．L．selectin and PSGL 1 Can even function synergicly to compensate each other’S physiologic function．However,till now it is yet unknown how L-selectin and PSG【广1 initiate similar signaling pathways。nor any crosslinking between the two pathways has been found．During investigating which kinase integrates the L-selectin and PSGL-1 signaling pathways，we notified P13K，a kind of critical lipid kinase，which phosphorylates PtIns(4，5)P2 into the lipid second messenger PtIns(3，4，5)P3，and thereby involves in the regulation of cytoskeleton and gene transcription．The studies in this article demonstrate that during leukocyte TEM，L．selectin and PSGL．1 act as the ligands for E．selectin，and induce ■ F．actin assembly and redis雠bution．and thereby support leukocyte rolling on E—selectin． P13K activation．peaking within 5 minutes is induced rapidly upon L．selectin and PSGL-1 stimulation with E．selectin．and can be detected until 10 minute．After P13K activation，Vavl (the pivotal downstream effector of P13K signaling pathway involved in cytoskeleton regulation)is activated．Furthermore，the F．actin rearrangement and assembly mediated by III ligation witll E．selectin were blocked by LY294002．a P13K specific inhibitor．Additional experiments showed that P13K activity was involved in neutrophil rolling on E．selectin． However,Syk／Zap70，the well．known upstream kinase of P13K was not involved in this event．These data suggest that P13K is required for the F．actin．based cytoskeleton changes during neutrophil rolling on E—selectin，which may consequently regulate the rolling event． And LY294002，the P13K specific inhibitor can block the activation of Vavl upon E．selectin stimulation．P13K plays a part in neutrophil rolling on E-selectin after its activation by regulate F—actin assembly and redistribution．But the typical upstream P13K kinase Syk／Zap70 is not involved in the activation of P13K．Additionally，using Jurkat T cells，we demonstrated by cotransfection and Real time PCR that L-selectin and PSGL．1 Can alSO induce the expression of IL-1 8 and P13K is also required for the regulation of IL．1 8 gene expression． Taken together，our exprements imply for the first time that L-selectin and PSGL-1 Can use P13K as the crosslinker of their signaling pathways to regulate cytoskeleton and the expression of the pre—inflammation factor IL-1 8，and therefore play crucial parts in leukocyte transendothelium migration and leukocyte activation． Key words：Neutrophil Rolling；Cytoskeleton；L—selecfin；PSGL-1；P13K；IL‘。18 { 3 IV 目 录 中文摘要 ．．：．．I 英文摘要 III 目 录 ．．V ● 英文缩写词 VIII 引 言 ．．1 一、选择素及其配体概述 3 (一)选择素的组成和结构 3 (--)选择素的表达调控及定位 ．．4 (三)选择素的配体 5 1．L一选择素和E一选择素的配体 ．．5 2．P一选择素的配体 ．6 (四)选择素与配体的生理功能 ．．7 1．选择素通过与其配体的相互作用参与白细胞的起始粘附 ．7 2．选择素及其配体作为信号受体向胞内传递信号 7 二、P13K概述 10 (一)P13K的分类及基本结构 ．．10 (二)P13K的活性调节 ．．12 (--)P13K的生理功能 ．．13 1．P13K与细胞凋亡 ．14 2．P13K与细胞周期调控 14 3．P13K与基因转录调控 14 4．P13K与细胞骨架 ．14 5．P13K的抑制剂 15 三、VAVI概述 ．．17 (一)vAv的组成与分布 ．．17 (二)VAvI在信号转导中的作用 ．18 (三)VAVl活性调控 ．．18 四、SYK／ZAP70概述 ．21 V (一)SYK／ZAP70的结构 ．．21 (二)SYK／ZAP70与白细胞信号转导 ．21 实验材料与方法 ．24 一、实验材料 24 (一)细胞 24 (二)抗体 24 (--)试剂 24 (四)质粒 25 (五)引物 25 (六)主要仪器及设备 ．．25 二、实验方法 25 (一)中性粒细胞的提取 25 (二)体外模拟毛细血管的层流实验 ．．26 (三)免疫荧光及流式细胞仪分析 26 (四)亚细胞组份的分离及提取 27 (五)蛋白质免疫共沉淀 28 (六)蛋白质电泳和免疫印迹(Western blot)检测 28 (七)Jurkat细胞的培养 29 (八)质粒的大量制备 ．．29 (九)瞬时转染 ．．31 (十)荧光素酶双检测 ．31 (十一)RT—PCR，Real-Time PCR ．．3l 实验结果与分析 ．34 一、 L一选择素／PSGL-I与E选择素相互作用介导中性粒细胞在E一选择素上的滚动34 二、用E一选择素交联中性粒细胞表面的L一选择素和PSGL-I能够引起F_肌动蛋白的 重新分布和聚合 ．．34 三、 中性粒细胞在E一选择素上的滚动依赖于E一选择素和L一选择素／PSGL-I相互作 用所引起的F一肌动蛋白重新分布和聚合 ． ．36 四、P13K在L一选择素和PSGL—l受到E一选择素交联后活化 ．．38 五、P13K参与E一选择素交联引起的F一肌动蛋白重新分布和聚合 ．41 六、中性粒细胞在E一选择素上的滚动依赖于P13K ．43 七、Syk／Zap70不参与中性粒细胞在E一选择素上滚动过程中P13K的活化 ．．44 八、P13K参与了L一选择素和PSGL-I交联引起的IL-18基因的表达 ．45 讨 论 ．48 结。论 ．51 Vl 主要创新点 ．． 参考文献 ． 致 谢 ． 在学期间公开发表论文及著作情况 Vn 8 尸 Bad Bcl．X】／Bcl．2 ● BCR C．Abl CSK．3 Cyc D1 elF2B FasL FOXO GEF Guanine exchange factor Grb2 Growth factor receptor bound protein 2 m Immunoblot IKK, Inhibitory rJ3 kinase IL．18 Interleukin-1 8 IP Immunoprecipitation ITAM Immunoreceptor tyrosine based activation motifs Lat B Latrunculin B Lck Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase M：APK Mitogen-activated protein l【inase mTOR Mammalian target of rapamycin NFlCB Nuclear factor rd3 PDKl Phosphoinositide-dependent kinase 1 PKB Protein kinase B(also called hkt) PKC Protein kinase C PLC? Phospholipase CY P13K Phosphatidylinositol 3-kinase PIP2 Phosphatidylinositol(4，5)-bisphosphate P口3 Phosphatidylinositol(3，4，5)-triphosphate Ras Rous avian sarcoma 王姐’-PCR Polymerase chain reaction with reverse transcription Sos Son of sevenless S6K S6 kinase TCR T-cell receptor TNFa Tumor necrosis factor TSC Tuberous sclerosis complex TSC2 而6erin VIII Zap70 Zata-associated protein 4E．BPl Eukaryotic initiation factor 4F binding Protein — IX 东北师范大学博士学位论文 引 言 炎症是机体抵御有害刺激或损伤的一种防御性反应，它是一个由多种因子和细胞参 与的复杂的病理过程。根据其病程可以分为急性炎症和慢性炎症。白细胞是炎症过程的 重要反应细胞。其中，中性粒细胞主要参与急性炎症，它们构筑了机体抵御微生物入侵 的第一道防线；巨噬细胞和淋巴细胞则主要参与慢性炎症。但在某些特定的条件下，部 分慢性炎症也可转化为急性炎症。 炎症反应的重要标志是以血管反应为核心的白细胞跨内皮迁移。这一过程可以被人 为地分为三个连续的阶段(图卜1)。第一阶段：白细胞被活化的血管内皮捕获，并在 血管剪切力的作用下向前滚动(起始粘附阶段)。第二阶段：白细胞在血管内皮上稳定 粘附并铺展。第三阶段：白细胞穿越血管内皮细胞之间的细胞间隙进入周围组织n，羽。 目前已知，在此过程中许多趋化因子和粘附分子扮演着重要角色。 wLeu!dia幻kocy_te扣捌酬阱啪g∞￡≥G嘴。喇‘嗍№—+—+_ 71mesca^e riise(： seconds subsecond seconds—minutes 壤纂 鑫，，删咖蜊 佟～t 图1-1白细胞跨内皮迁移过程及各阶段的参与分子 粘附分子是细胞表面表达的一类糖蛋白的总称。选择素是粘附分子的一类，它们通 过与表达于白细胞或血管内皮细胞表面的配体相互作用，参与白细胞的起始粘附(即滚 动过程)。L一选择素和PSGL—1分别是白细胞表面的选择素和选择素配体，它们组成性 地表达在白细胞微绒毛的顶端。这种特殊的定位关系决定了它们在白细胞与血管内皮相 互作用过程中最先行使功能。然而这两种粘附分子在白细胞起始粘附过程中的作用不仅 表现于作为锚定分子，将白细胞捕获到活化的内皮细胞上。它们还能作为信号受体向细 胞内转导信号，参与细胞的活化口’43。 近年来，对于L一选择素和PSGL一1的信号转导功能已有大量文献报道。一些研究 东北师范大学博士学位论文 表明，L一选择素被抗体交联可以引起淋巴细胞内由p56Lck、Grb2／Sos、Ras、MAPK以 及Rac2参与的细胞骨架改变璐’63和02一的合成口3，也可以引起NFAT的入核船1、神经酰胺 的合成旧1。在中性粒细胞中，L一选择素的抗体交联能够引起细胞内Ca2+的释放、过氧化 物的生成、整合素的活化、IL一8 mRNA的合成和细胞粘附能力的增强等n¨羽。此外，在 中性粒细胞粘附和跨内皮迁移过程中，L一选择素还可以为趋化因子提供共刺激信号 uA 141。PSGL一1作为信号分子受体的研究比L一选择素稍晚，PSGL-1被抗体交联能够增强 中性粒细胞酪氨酸的磷酸化水平，活化MAPK信号通路，引起中性粒细胞的细胞骨架改 变以及基因表达的上调n副。最近也有研究将L一选择素和PSGL-1与脂筏的研究相联系， 证明L一选择素和PSGL一1的信号转导功能与细胞膜上的脂筏粘附受体的结构密切相关 Ele，173 0 虽然PSGL一1是不同于L一选择素的信号分子受体，但是却可以引起细胞内一系列 和L一选择素信号转导相似的事件(图1-2)。主要体现在以下几方面：L一选择素和 PSGL一1的胞浆尾部都可以和ERM蛋白结合n蚴1；用L一选择素和PSGL-1的抗体分别刺 激白细胞，都可以引起整合素的活化、MAPK信号通路的活化、IL一8的分泌、CSF一1 的表达；用L一选择素和PSGL一1的抗体分别刺激淋巴细胞，都可以使细胞内的F一肌动 蛋白聚合并且重排瞳卜翱。由于L一选择素和PSGL-1是参与白细胞起始粘附的主要粘附分 子，而且其信号途径有很多相似性，所以探究这两种信号受体如何引起相同或相似的生 理事件对于深入了解炎症发生时白细胞与血管内皮之间的作用方式非常必要。对某些信 号事件的人为控制，还可以用于预防和治疗炎症。 图卜2由L-sel和PSGL一1所引起的相似信号 (实线箭头L—sel信号通路；虚线箭头PSGL-1信号通路) 2 (一)选择素的组成和结构 选择素是上世纪末发现的一类I型跨膜糖蛋白。包括三个成员，分别是L一、P一 和E一选择素。 三种选择素结构大致相同(图1--3)，都包含依赖Ca2+的凝集素样结构域(C—lectin domain)、表皮生长因子样结构域(EGF-like domain)以及短的补体重复结构域(SCRs， short consensus repeats)、跨膜结构域和胞浆尾部。不同之处在于不同选择素的补体 样重复结构的数目有所变化：L一选择素包含两个补体调节蛋白；P一选择素包含9个补 体调节蛋白；E一选择素包含6个补体调节蛋白船榭1。 图1-3选择素的结构 选择素家族成员(L一、E一、p-)结构包括Ca2+依赖的凝集素样结构域(C —lectin domain)，表皮生长因子样结构域(EGF-like domain)，2—9 个短的补体样重复结构域(SCRs，short consensus repeats)，跨膜结 构域和一个短的胞浆尾部结构域。 选择素的胞外结构(C-lectin domain，EGF-like domain，SCRs)在不同种属间呈 现出很高的同源性。其中，凝集素样结构域和表皮生长因子样结构域的同源性为60一 65％，SCR结构域的同源性为40--45％。这种高度保守的结构域为三种选择素识别同型 糖配体提供了结构基础。 依赖Ca2+的凝集素样结构域主要通过Ca2+与细胞表面的糖配体结合，从而参与细胞 3 东北师范大学博士学位论文 与细胞之间的粘附口71；表皮生长因子样结构域可以通过稳定凝集素样结构域的构象间 接起作用，也可以通过与配体结合而直接起作用，主要参与配体识别及细胞粘附啪]。 虽然单独的凝集素样结构域能够使白细胞之间发生粘附，却不能使粘附状态达到最佳 啪，州。只有在凝集素样结构域和表皮生长因子样结构域的共同参与下，选择素才能够以 最佳的构象与配体结合。 人们曾经认为SCR结构域在识别配体方面不发挥重要作用，这是由于哺乳动物选择 素的SCR结构域在进化过程中不断丢失，而且各种选择素的SCR结构域之间存在多变性。 然而，也有研究者发现SCR结构域能够稳定配体的结构，进而增强选择素与配体的亲和 力，并且在信号传导中也发挥重要作用。缺失SCR结构域的L一选择素与专一性识别其 凝集素样结构域的单克隆抗体(Mel-14)的亲和力很低，表明SCR结构域和稳定凝集素样 结构域的构象有关，也和增强L一选择素与配体的亲和力有关口¨。另有研究表明，能够 高效的识别E一和L一选择素SCR结构域的单克隆抗体(EL一246)在静止和流动状态下 均可有效的抑制L一和E一选择素的粘附功能口副。与这一体外实验结果相一致的体内研 究也表明，用EL一246单克隆抗体预先处理淋巴细胞将会明显抑制淋巴细胞向外周淋巴 结归巢，这就提示我们SCR结构域在淋巴细胞归巢过程中起重要作用盼刘。此外，在L一 选择素依赖的信号通路中，如在L一选择素被识别其SCR结构域的抗体(LAMI一14)交 联所引起的超氧离子形成过程中，SCR也起了重要作用阻’351。 三种选择素的跨膜区和胞浆尾部不具有同源性，但同一种选择素的跨膜区和胞浆 尾部在不同物种间的同源性却很高，表明跨膜区和胞浆尾部在功能上具有专一性口引。有 研究表明它们也参与了白细胞的粘附和胞外信号向胞内的传递。尤其是胞浆尾部在选择 素作为信号受体引起胞内信号过程中具有重要作用。 (二)选择素的表达调控及定位 选择素的表达分为组成性表达和非组成性表达。其中，L一选择素组成性的表达于 几乎所有的白细胞表面。P一选择素非组成性的表达于活化的血小板和血管内皮静脉上。 E一选择素非组成性的表达于活化的血管内皮上。在炎症过程中，白细胞与血管内皮之 间建立联系时，选择素与其配体的作用是必要的，所以选择素的表达对于白细胞在血管 内皮上的起始粘附具有重要意义。 三种选择素的基因位于人类和小鼠的第1号染色体上，长度大约为300kb，按照P／ L／E的顺序排列。同一基因的不同外显子负责编码选择素分子的大部分结构域，但胞 浆尾部是由两个外显子负责编码的口71。 E一选择素的表达主要局限于活化的内皮细胞。处于炎症环境中的内皮细胞在细胞 因子(如TNF—Q或IL一1 p)或脂多糖(LPS)的诱导下能够在转录水平调控E一选择素 的表达啪’391。在刺激3～4小时后在细胞表面的表达水平达到最大值H们。 P一选择素是一种分子量为140KD的糖蛋白，可通过以下两种方式被诱导表达。一 种是储存在血小板的Q颗粒中或内皮细胞的Weibel Palade小体中的P一选择素在受到 4 东北师范大学博士学位论文 血小板活化因子(PAF)、凝血酶或组胺等的刺激后，被迅速的转运到血小板和内皮细胞 表面。另一种是在TNF-Q、IL一4或oncostatin M的刺激下上调P一选择素的转录水平 和蛋白表达水平H1‘4钔。 L一选择素在白细胞表面的分布不是随机的，它优先表达于微绒毛顶端和细胞褶皱 的顶端阻5’拍1，这对于促进白细胞被内皮细胞捕获以及加强已经建立的白细胞在内皮细胞 上的滚动都有重要意义。然而，Stein等人证明L一选择素在微绒毛顶端的定位不具有 普遍意义，仅仅对于白细胞在直径20-40微米的小静脉上的起始粘附是有利的H71。此外， 活化的白细胞通过使L一选择素脱落来调控其在细胞表面的表达。当细胞受到细胞因子 (如C5a、fMLP、TN卜Q、GM—CSF、IL一8)和PMA的刺激时，L一选择素会从细胞表面 迅速脱落，从而在血清中检测到可溶性的L一选择素。有关L一选择素脱落的分子机制 的研究证明，在蛋白酶的作用下在靠近质膜的跨膜区附近裂解能够导致L一选择素的脱 落啪嘟3。但是哪种蛋白酶导致了L一选择素裂解以及哪些信号转导途径导致了L一选择 素脱落目前都不是很清楚。有研究表明，由金属蛋白酶介导的L一选择素断裂是由胞内 信号途径所引发的，这一过程不依赖于p56Lck酪氨酸激酶，但需要其它酪氨酸激酶以 及神经鞘脂酶的参与，而且脂筏很可能作为信号平台起到了一定的作用嘞1。L一选择素 脱落似乎是一个受控的过程，但是目前尚不清楚其生理意义。有研究者认为，L一选择 素的组成性表达一脱落一再表达对于趋化作用很重要畸引。 总之，P一选择素和E一选择素只有在活化内皮细胞上才表达，在非活化的内皮细胞 上不表达；L一选择素组成性的表达于几乎所有的白细胞表面。这种表达特征保证了L 一选择素在正常情况下维持淋巴细胞的归巢，而在炎症发生时与内皮细胞表达的L一选 择素配体相结合，促使白细胞向炎症部位迁移。此外，P一和E一选择素也组成性的表 达于某些组织中。利用免疫组织化学方法在造血组织的内皮上检测到了E一选择素的组 成性表达。与之类似，未受致炎因子刺激的内皮静脉也表达P一选择素，这表明这些血 管也组成性的表达P一选择素。 (三)选择素的配体 选择素配体是一类经过特定糖基化修饰的糖蛋白或糖脂，其结构和动物凝集素配体 的结构类似。不同选择素配体的糖基化有所不同，大部分配体被唾液酸(sialic acid) 化、岩藻糖(fucose)化、甘露糖(mannose)化、硫酸化、半乳糖(galactose)化或磷脂化 呦’611。三种选择素主要通过与唾液酸化的路易糖X(SLel)或它的同分异构体(SLe8)相互 作用，从而对某些带有SLel或SLe8寡糖侧链的大分子表现出较高的亲和力，除E一选择 素外，L一和P一选择素还可以与硫酸化碳水化合物的非唾液酸化和岩藻糖化的SLe‘或 SLe8结合，如二者都可以结合硫酸肝素№2刊1。 1．L一选择素和E一选择素的配体 L一选择素的生理配体种类很多。其中，Sgp50又称为糖蛋白依赖的粘附分子一1 (GlyCAM-1)，在淋巴血管内皮细胞上表达∞51。Sgp90又称为CD34，在很多的血管内皮 东北师范大学博士学位论文 细胞和造血干细胞上表达∞6’671。另一种配体称为粘膜地址素(MadCAM-1)，是L一选择素 的特异性配体汹‘7叫。此外，免疫沉淀实验表明，Sgp200也能够作为L一选择素的配体C71}。 在中性粒细胞之间的二次粘附中，L一选择素还能够与PSGL-1相结合口2’731。 ESL一1(E一选择素配体一1)是小鼠中性粒细胞表达的特异的糖配体，可以作为E一选 择素的配体[74,75]但在人类的中性粒细胞表面尚未找到类似的配体。此外，L一选择素 和PSGL—l也可以作为E一选择素的配体口6啪1。然而，这种结合是否对细胞间的粘附起重 要作用还不是十分清楚口7’78J。 2．P一选择素的配体 PSGL一1(P一选择素糖配基一1)是P一选择素的高亲和力配体中研究得最透彻的一 种口9’舳1。然而，三种选择素都可以与PSGL一1结合。生化研究表明，PSGL-I是一种高度 唾液酸化的粘蛋白。其结构包括一个多肽骨架和向周围伸出的1—3个N一连聚糖和大 量的唾液酸化的O一连聚糖及唾液酸路易糖SLel或其同分异构体SLe虹793。人的PSGL一1 多肽骨架是由402个氨基酸残基构成的I型跨膜蛋白四妇(图1-4)，包括富含丝氨酸／ 苏氨酸／脯氨酸的胞外区、疏水氨基酸组成的跨膜区和短的胞内区。鼠的PSGL-1多肽骨 架与人的类似，是由397个氨基酸残基构成的I型跨膜蛋白[82]o胞外区的前18个氨基 酸残基为信号肽序列，接下来的19—41位氨基酸残基为前肽序列，在PSGL-I成熟过程 中被切除。成熟的PSGL—l的前19个氨基酸残基内存在酪氨酸残基的硫酸化位点，对于 抗体的识别和选择素的结合非常必要。专一性识别N一末端的单克隆抗体(PLl)可以 阻断纯化的P一选择素与PSGL-1结合。 Signal peptide Propeptido Ser／Thr／Pro rich region Cytopl鹄mic domain 图l-4．XL-60的eDNA显示的PSGL-1分子多肽结构 Signal Peptide一信号肽；Propeptide一前肽序列；16 Decamer Repeats---16 个重复序列；Transmembrane D伽ain一跨膜结构域；Cytoplasmic Domain一 胞浆尾部结构域 PSGL一1要经过必要的翻译后修饰才能与选择素结合。其糖基化修饰(岩藻糖化修 饰或者唾液酸化的O一连接的寡聚糖修饰或者N一端的一个或者多个酪氨酸硫酸化修饰 嘞1)需要核心一2一GlcNAc一转移酶，Q一2，3一唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶等的共 6 东北师范大学博士学位论文 同作用。这些酶主要表达于骨髓来源的白细胞，而胸腺来源的Jurkat T淋巴细胞缺少 这些酶。因此，中性粒细胞可以结合P一选择素，并在稳定表达P一选择素的CHO细胞 (CHO-P细胞)表面滚动，而Jurkat T细胞表面虽然表达PSGL一1，但是由于岩藻糖基 转移酶的缺乏而不能被岩藻糖化，因此观察不到其在CHO--P细胞表面的滚动陴4，853。 CD24是P一选择素的另一种配体。它是一种小分子糖蛋白，能够结合GPI (glycosylphosphatedylinosit01 anchor)嘲。在既表达CD24又表达PSGL一1的细胞中， P一选择素优先结合PSGL-1；在不表达PSGL-1的细胞中，P一选择素和CD24结合从而 介导细胞的粘附隅71。 (四)选择素与配体的生理功能 1．选择素通过与其配体的相互作用参与白细胞的起始粘附 L一选择素组成性的表达于白细胞微绒毛顶端，通过与GlyCAM-1和CD34结合介导 正常状态下白细胞向外周淋巴器官的归巢‘刚¨。当内皮细胞受到炎症相关因子的刺激时 表达E一选择素，L一选择素可以通过与之结合参与炎症过程中白细胞的跨内皮迁移憎引。 有研究发现，在生理相关剪切力下的中性粒细胞在固定的PSGL-1上的滚动和粘附可以 被PSGL-1的抗体(PL-1)或者被L一选择素的抗体(DREG200)阻断。PL-1可以将中性 粒细胞在已固着的中性粒细胞上的滚动阻断60％，而DREG200几乎可以彻底阻断旧3-9引。 P一选择素表达在活化的血小板和内皮细胞表面，可以与组成性表达在白细胞微绒 毛上的PSGL-1结合，介导白细胞在内皮细胞上依赖于P～选择素的滚动∞51。PSGL一1的 单克隆抗体PL-1完全阻断了中性粒细胞在P-selectin上的滚动嘞1。此外，PSGL一1也 是活化后的T细胞表达的与P一选择素作用的主要配体隅41。在P一选择素被封闭或缺失 掉之后，包被有功能性PSGL-1的微球将不能在外伤或TNF-Q刺激的鼠静脉血管中滚动 阳司。此外基因敲除PSGL-1的实验也表明PSGL一1是P一选择素介导中性粒细胞滚动和迁 移所必需的啪1。 E一选择素表达在活化的内皮细胞表面，可以通过结合L一选择素、PSGL—l或者ESL 介导白细胞在内皮细胞上的慢速滚动∞7-删。PSGL一1的单克隆抗体可以部分阻断白细胞 与E一选择素的粘附，而抗E一选择素的单克隆抗体可以完全阻断白细胞与E一选择素的 粘附，说明白细胞上除PSGL-1外还有其它E选择素的配体n唰。在体外条件下，PSGL一1 缺失的白细胞在E一选择素上的滚动数目显著减少n013。缺失或封闭E一选择素能够明显 增加包被有功能性PSGL-1的微球在外伤或TNF-Q刺激的鼠静脉血管中的滚动速度啪3。 此外，L一选择素还可以和PSGL-1结合，介导白细胞一白细胞之间的二次粘附。有 研究表明，依赖于L一选择素和PSGL一1的白细胞在其它白细胞上的滚动不仅能够促进 白细胞向炎症部位的募集，而且能够引起不表达P一／E一选择素配体的白细胞的粘附， 这一机制将导致更多种类的白细胞向炎症部位募集口蚴。 2．选择素及其配体作为信号受体向胞内传递信号 7 东北师范大学博士学位论文 选择素的作用不仅仅局限于作为锚定分子参与白细胞的起始粘附过程。越来越多的 实验表明，它们还能作为信号受体，引发细胞内一系列信号事件，从而为白细胞跨内皮 迁移的第二阶段，即白细胞稳定粘附并铺展在内皮细胞上做准备。 有关L一选择素作为信号受体的研究开展得较早，2005年Barkhausen等人对其信 号途径做了很好的综述(图1—5)。在以T淋巴细胞为材料的研究中，人们发现L一选择 素在被抗体交联后，能够引起如下几条信号途径：可以通过p56Lck、Grb2／Sos和Ras 活化Rac2和MAPK，从而导致氧负离子的合成和细胞骨架的重组n03’104]；可以引起酪氨 酸激酶的活化，从而导致NFAT从细胞质转运到细胞核内[tos]；可以引起神经酰胺的释放， 并分解为神经鞘磷脂来作为第二信使起作用n眠1071。当L一选择素和CD3共刺激时，可 以引起PKC Q和PKC 0和L一选择素胞浆尾部结合，而且这种结合可能和JNK的活化有 关u 08’1091；用PMA刺激T一细胞时，PKC 0和PKC l可以和L一选择素胞浆尾部结合n103。 在以中性粒细胞为材料的研究中，人们也发现：L一选择素活化后可以引起细胞内钙离 子向细胞质的短暂释放 卜u钔；可以引起一些酪氨酸激酶，如p38 MAPK的活化，进而引 起中性粒细胞脱颗粒 5’lle]；可以引起CDl8的表达和整合素粘附能力的增强n17’1183；可 以引起肌动蛋白的聚合和细胞变形能力的下降n1 9’1201；用fMLP或者TNF—Q和L一选择 素抗体共同刺激中性粒细胞，可以引起细胞内活性氧的爆发n1羽；用脑苷脂活化L一选择 素可以引起NF K B的活化，进而引起TNF—Q和IL一8基因转录的增强n2¨。最近的研究 也发现，脑苷脂所引起的L一选择素依赖的信号通路对于CXCR4的表达也有上调作用 【1翻 图1—5 L一选择素在中性粒细胞和淋巴细胞中的信号转导通路 近年来对PSGL—l信号功能的研究也越来越多。有实验表明鼠的PSGL-I能够转导信 号并导致13。整合素的活化，但可溶性的P一选择素或者PSGL-I的抗体与PSGL-1结合 后产生的信号不足以活化B：整合素。PSGL—1只有与二价的单克隆抗体或固定的P一选 东北师范大学博士学位论文 择素结合才能引发人中性粒细胞中某些蛋白质激酶的活化，如具有GTP酶活性的Ras 及Erkl／2 MAPK家族激酶发生快速的酪氨酸磷酸化n翱。PSGL一1与单克隆抗体的结合能 够促使人中性粒细胞分泌IL-8，这一过程可以被抑制酪氨酸磷酸化的抑制剂阻断n2引。 可溶性P一选择素嵌合蛋白可以触发PMN酪氨酸磷酸化依赖的信号，并上调Mac一1的功 能，进而参与B：整合素介导的依赖于酪氨酸激酶的同型PMN的凝聚n25J。此外，有关中 性粒细胞的研究表明，PSGL-1也与E一选择素作用引起MAPK信号通路的活化，进而导 致B：整合素的活化n嘲。单核细胞的PSGL-1受到固定的P一选择素和血小板活化因子的 共同刺激后能够活化转录因子NF K B，进而促进细胞因子TNF-Q和单核细胞趋化蛋白 一1的合成口9’堋。中性粒细胞活化后，PSGL-1可以通过其胞浆尾部的S336、$348、R337、 K338与ERM(ezrin—radixin—moesin)复合体相互作用，参与PSGL-1在细胞表面的重 新分布n掘1嬲。1驯。在淋巴细胞和U937细胞中，PSGL一1的刺激能够引发酪氨酸蛋白激酶 Syk的磷酸化，磷酸化的Syk可以与ERM蛋白的ITAM区结合而募集到PSGL一1胞浆尾部 n3妇并诱导SRE(serum response element)依赖的c-fos的转录。在Jurkat细胞中转染 野生型的Syk可以增强CSF一1基因的表达水平，而转染激酶缺失型的Syk却不能u321。 此外，有研究者也发现PSGL-1交联能够诱导活化的T细胞走向死亡u331。 9 东北师范大学博士学位论文 二、P I 3K概述 磷酸肌醇3一激酶(Phosphoinositide 3-kinase)也称磷脂酰肌醇3一激酶 (Phosphatidylinositol 3-kinase，P13K)，是指能够磷酸化磷脂酰肌醇 (Phosphatidylinositol，Ptdlns)及其衍生物肌醇环3位羟基的磷酸激酶。这种激酶 可以把PtdIns(4，5)P2磷酸化为Ptdlns(3，4，5)P3，从而作为第二信使介导相应蛋白向 质膜的选择性募聚。目前认为，P13K参与了一系列细胞应答，如有丝分裂、细胞存活 与生长、代谢调控、囊泡运输、脱颗粒、骨架重构和细胞迁移等生理过程n卅13引。在抗 肿瘤药物的研发中，P13K信号通路也引起了人们的极大兴趣。在过去的几十年里，P13K 和癌症之间的联系已经得到了证实。通过突变生长因子受体或突变编码P13K Q的基因 座等方式可以实现对P13K信号通路的负调节，从而对细胞生长和增殖产生影响n37叫4们。 另有研究表明，对P13K Y和P13K 6基因敲除能够调控白细胞的趋化和肥大细胞的脱颗 粒，这也印证了这两种P13K亚型在炎症和过敏反应过程中的核心作用。针对P13K Y的 特异性分子能够成功的延缓大鼠的风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的病程。此外，P13K 被认为参与调控一系列细胞活动而且是生长代谢的调控中心。通过对P13K信号通路基 因修饰鼠的研究以及对运动失调性毛细管扩张综合症等人类遗传病发病机理的阐明，人 们进一步了解了磷酸肌醇信号通路在细胞水平和机体水平的作用。总之，使磷酸肌醇水 平失调，尤其是打乱I类P13K的产物--Ptdlns(3，4，5)P3的平衡，与癌症和慢性炎症、 过敏、代谢疾病、糖尿病和心血管疾病的发病机理有关n371。 (一)P13K的分类及基本结构 P13K是一类酶家族，依据结构特征以及对体外脂类底物的特异性，可以将它们分 为四类(图1—6)[141,142]。 p13K，镰倒鳓昭subunits P13_I‘inases。幽筠 p85B RasB C2 P13Ka P13Kc I^ P13Ka P13K8 P13K蠡 瞎 pRegB 附 P13K7 P13∞2旺 PIK3C2p PIK3C'≈ Vps34 10 P13K。regulatory 8曲un泌 I髯‘冀激邵爵 Cl黼lB 1弦 躲瓣 瓣 ∞卿 ClassⅢ I(i脯参e d鲥I毒in HEAT d哪拍静隅．WD‘O擅，n瞄n墓 删 的 'I∞枷 ●----_-●-__一 ^—■●Oa嘛 图1--6 P13K催化亚基和调节亚基的结构示意图 I类P13K是由催化亚基和调节亚基形成的异源二聚体。催化亚基包括四种关系较近 的的分子量约1lOkDa的蛋白；调节亚基属于两个不同的家族。体外实验表明，它们能 够将磷脂酰肌醇(PtdIns)转化成Ptdlns一3一P，Ptdlns一4一P，PtdIns一(3，4)一P2， PtdIns-(4，5)-P2和PtdIns-(3，4，5)-P3。但I类P13K的体内底物却是Ptdlns一(4， 5)-P2n43’14钔。这一类P13K可以被多种细胞表面受体活化，包括生长因子受体和G一蛋白 偶联受体‘14副。 II类P13K在体外可以磷酸化PtdIns和PtdIns-4一P，但其体内底物尚待研究。这一 类高分子量的酶(120—170kDa)有三个成员，特点是都有一个C一端C2类似结构域。 这一结构域对钙离子不敏感，因为他们缺少保守的天冬氨酸残基n捌。目前尚未发现这 类P13K的接头蛋白。已有研究表明，这类激酶对P13K抑制剂(LY294002和Wortmanin) 的敏感性不同。事实上，与I类P13K相比，P13KC2 Q对于这两种抑制剂的抗性更强。 然而P13KC2 13对LY294002极不敏感，但对Wortmanin敏感。可是对于抑制剂敏感度的 差异还不足以作为区分P13K生物功能的标志。虽然II类P13K已经被定位到高尔基体 的反式网面结构(Trans-Golgi Network)和低密度微粒体中，它们的活动方式仍没有 了解透彻。据报道，只有P13KC2 Gt这种亚型与网格蛋白组装以及网格蛋白参与的囊泡 运输有关n47’148I。越来越多的刺激物被证明可以活化II类P13K。它们包括，趋化因子 (MCP-1)、细胞因子(1eptin和TNF Q)、LPA和胰岛素。其它实验表明P13KC2 Q的活 化也与EGF一、PDGF一、SCF一受体有关。近来的研究表明P13KC2 B可能与LPA引起的 东北师范大学博士学位论文 卵巢癌和子宫颈癌细胞的迁移有关。 III类P13K只能将Ptdlns磷酸化为PtdIns一3-P。这类P13K的唯一成员是Vps34， 其原型是酵母(S．cerevisiae)的Vps34p(vacuolar protein sorting mutant 34 protein)。在新合成的蛋白质从高尔基体转运到酵母芽泡的过程中，Vps34p起重要作 用。在过去几年里，Vps34p在葡萄糖衍生细胞的自吞噬过程中的作用也得到了广泛研 究。目前研究表明，在mToR下游氨基酸的活化及其随后的p70s非1和4E—BP的磷酸化方 面，Vps34p也起作用n挣15l】。 IV类P13K是一类和P13K催化核心相似的P13K相关蛋白。包括mTOR(又称FRAP)、 DNA—PKcs(DNA—dependent protein kinase)、ATM(ataxia telangiectasia mutated gene product)、ATR(ataxia telangiectasia—related)和SMG等。这类蛋白参与基因组／转 录组的监视n521以及紫外照射引发的DNA损伤修复Ⅱ53。1553。SMG-I还参与mRNA的监视n弱1。 mTOR是IV类P13K中唯一不参与DNA损伤修复的蛋白。它受到生长因子以及养分供应 的调控，并与蛋白合成，细胞生长和增殖有关n弘1571。 (二)P I 3K的活性调节 ， P13K信号途径是控制细胞生长、增殖、存活以及迁移的关键信号转导途径。它们 可以被许多不同刺激物活化。包括生长因子、炎症介质、激素、神经递质、免疫球蛋白 和抗原n睁1631。IA类P13K中的P13K Q、B、6都结合一个调节亚基(p85／p55／p50之一)。 调节亚基具有两个SH2结构域，可以结合磷酸化的Tyr-X-X-Met基序n％1晒3。生长因子 受体产物、许多接头蛋白和蛋白激酶都带有这种基序。IB类P13K的唯一成员是P13K Y，其催化亚基结合p101、p84或p87Ⅳ灿接头蛋白。可以被G一蛋白异源三聚体中的B Y亚基结合后带到质膜上并活化n睁1曲3。同源异形体P13K Q、P13K B和P13K 8复合体以 及它们的底物在生长因子受体和趋化因子受体下游被活化。而P13K Y却在G protein—Coupled receptors(GPCRs)下游被活化。生长因子和其共价受体的结合能够 Cell gr／owth i＼Cel l Y cycle Transcription Cell survival progression Translation Apoptosis 东北师范大学博士学位论文 导致受体的二聚化和胞浆尾部的YXXM基序的酪氨酸残基的磷酸化(pY，蓝色圈)。这些 pYXXM基序为IA类P13K调节亚基(p85，p55，和p50)的SH2结构域提供停泊位点， 从而将IA类P13K的催化亚基带到细胞膜上并在将其活化；趋化因子和其受体的结合引 起Gi一蛋白的解离，进而促使B、Y亚基与p110 Y和p101／p84／p87N附结合，从而活 化P13K y。活化后的P13K在细胞膜上起始Ptdlns(4，5)--P2向PtdIns(3，4，5)--P3 的转化，并通过Ptdlns(3，4，5)--P3募集一些含有Pleckstrin Homology(PH)结构域 的蛋白，从而扩大生长因子信号途径(图卜7)。 P13K信号通路的活化被两种磷酸肌醇磷酸酶负调控。SHIP2(SH2 domain—containing inositol phosphatase)的5’一磷酸肌醇磷酸酶活性可以将PtdIns (3，4，5)--P3去磷酸化为Ptdlns(3，4)--P2n静删。另外一种磷酸肌醇磷酸酶是 PTEN(phosphatase and tensin homog deleted inchromosome ten)。在癌症中PTEN 也叫MMAC，TEPl或TGF B一调控的表皮细胞富集的磷酸酶一1，它可以把PtdIns(3，4， 5)--P3去磷酸化为Ptdlns(4，5)--P2【1733。在许多肿瘤中，PTEN常发生突变、缺失 或活性下调，因此导致了P13K信号通路的组成性活化。 此外，P13K在体内还可以通过自身的丝氨酸激酶活性来调控其激酶活性。P13K的 p110催化亚基本身具有蛋白激酶活性，可以将p85 Q亚基的Ser608磷酸化，从而下调 其激酶活性，且p110 B磷酸化p85 Q的活性较弱n743。 (三)P13K的生理功能 I类P13K的活化将导致Ptdlns(3，4，5)--P3的产生，从而募集接头蛋白和含有PH一 结构域的效应蛋白(PH结构域在图1—8中用黑点标出)，如蛋白激酶B(PKB／Akt)。PKB／Akt I．‘落皂J。搴置舛J上 图1--8 P13K信号通路在细胞生长、增殖、存活、运动等过程中的核心作用 东北师范大学博士学位论文 一旦被募集到膜上，它的Thr308将被PDKl(Phosphoinositide—Dependent Kinase 1，) 磷酸化。PKB／Akt的彻底磷酸化是通过PKD2激酶将其Ser473去磷酸化而实现的。在其 活化过程中，mTOR复合体2Ⅱ75’1761和DNA-PKcsn71·1783似乎起了很重要的作用。PKB／Akt活 化后能够磷酸化一系列蛋白，从而调控它们的活性n793。被其调控的分子参与许多细胞 活动，如细胞周期的调控、细胞存活、脱颗粒、新陈代谢、基因转录和细胞运动等过程。 1．P13K与细胞凋亡 P13K／PKB途径的活化对于抵抗细胞凋亡有作用。PKB／Akt磷酸化并抑制半胱天冬 酶(Caspase 9)的活性，而后者是一种引发凋亡的关键蛋白酶n驯。同时，PKB／Akt也可 以将死亡驱动因子(BAD)的Serl36磷酸化，从而释放凋亡抑制蛋白Bcl一2和BcI-K。n8h 婚羽。PKB／Akt也能活化I KB激酶，后者将I KB磷酸化，从而解除其对NFK B的抑制作 用，结果，NFKB进入细胞核并激活抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-K。)的转录n83’1843。最 后，FOXO失活并在胞质中驻留，从而抑制FasL的转录，干扰配体介导的细胞凋亡。 2．P13K与细胞周期调控 细胞周期受到周期蛋白、周期蛋白激酶以及周期蛋白激酶抑制因子的严格调控。活 化的PKB／Akt可以磷酸化FOXOs(class 0 of transcription factors)的三个不同位点。 后者可以结合14-3-3蛋白从而在胞质中形成FOXO／14-3-3复合体n8明。细胞核内FOXO 的缺失会增强周期蛋白D1的转录并降低CDK抑制因子p27nm的转录n蹶培钉。此外，磷酸 化的PKB／Akt抑制GSK3 13(glycogen synthase kinase 3 B)的活性口嘲。周期蛋白D1 的增加和p27酣阱的减少是细胞从G1期走向S期的必备条件。 3．P13K与基因转录调控 P13K在TCR(T cell receptor)信号通路中的作用既包括正向也包括负向调控。 有人曾经报道，活化型P13K的过表达能够抑制TCR介导的NEAT转录活性的增强，相反， 过表达P13K的功能缺失突变体将大大增加NFAT的活性n蹭J。随后的研究却发现，在正 常的淋巴窦T细胞(PBL)中，P13K参与了TCR介导的IL-2的基因表达。抑制P13K 的活性能够抑制ERK(extracellular signa卜related protein kinase)信号通路。 过表达P13K的功能缺失突变体或者用药物抑制P13K活性能够抑制AP-I和NFAT的转录 活性[190]。 4．P13K与细胞骨架 最近一些关于白细胞和成纤维细胞的研究表明，P13K在放大不均等的胞内信号从 而实现细胞极化过程中起重要作用n913。早期用P13K抑制剂LY294002和Wortmannin的 研究表明，P13K在趋化过程中起重要作用。针对IA类P13K的pllO亚基的特异性抗体 的实验是有关P13K的特定亚型在调控哺乳动物的细胞迁移及骨架改变的最早证据。显 微注射6或B型P13K的抗体能够抑制CSF-I所引起的肌动蛋白重组和细胞迁移，而注 射Q型P13K的抗体却不能n921。此外，向NK细胞内导入Y(而非Q)亚型P13K的阻断 性抗体能够抑制细胞的趋化现象n∞1。另外也有证据表明P13K参与了PDGF介导的趋化 作用n941。缺失P13K的细胞或者将野生型细胞用LY294002处理后，再用趋化因子刺激 会看到F一肌动蛋白的重组被干扰，少量的F一肌动蛋白增加。这些细胞在趋化因子出现 14 东北师范大学博士学位论文 时不再发生有效的极化，也没有趋化因子介导的肌球蛋白II的聚合。P13K Y基因敲除 鼠的白细胞实验表明P13K Y参与趋化因子介导的细胞运动和迁移。此外，从P13K Y无 效突变的小鼠中分离提取的中性粒细胞和巨噬细胞表现出细胞运动能力的损坏和趋化 因子引起的细胞迁移能力的降低。进一步实验表明，这些细胞不能在趋化因子梯度的作 用下极化，但参与调控细胞的定向运动。在成纤维细胞向PDGF迁移的实验中发现极化 产物(3’一磷脂酰肌醇)和膜的快速铺展之间表现出高度的协同作用，从而表明3’一 磷脂酰肌醇是受体酪氨酸激酶信号通路中细胞极化和迁移的主要介质。这些研究都支持 PIP3在趋化过程中可能导致细胞产生不对称性并进一步放大这种不对称性。在细胞迁 移和白细胞趋化过程中，P13K对于F一肌动蛋白的调控非常重要。Dictyostelium的P13K 缺失细胞或野生型细胞用LY294002处理后，会导致趋化因子介导的F一肌动蛋白聚合降 低30％，其细胞动力比野生型细胞慢n951。F一肌动蛋白聚合的降低很可能使这些细胞对趋 化因子浓度方向改变的应答能力降低。当趋化因子释放微管的位置改变时， coronin—GFP(一种进化上高度保守的F-肌动蛋白结合蛋白，可以作为F一肌动蛋白聚合 的Marker)很快在原来的前端消失并且在新形成的前端聚集。然而P13K缺陷的细胞却 不能看到这种现象。在哺乳动物的REF一52细胞中，Vav交换因子Rac受到P13K底物的 调控。P13K底物PI(4，5)--P2抑制Lck酪氨酸激酶对Vav的活化过程。而P13K产 物PIP3增强Lck介导的Vav的磷酸化和活化。此外，PIP3结合Racl和RhoA并促进GDP 交换n 961，从而提供了P13K在前端调控F一肌动蛋白聚合的途径。 5．P13K的抑制剂 P13K抑制剂的种类繁多，Wortmanin和LY294002是应用最广泛的两种特异性抑制 剂。在过去几十年内，有关这两种抑制剂与P13K相互作用的机制已经研究清楚。它们 针对于P13K催化结构域的ATP结合位点起作用n97'1983。P13K的ATP结合位点位于催化 结构域的C一端叶结构和N一端叶结构(C--lobe，N--lobe)之间的缝隙。构成P13K y ATP结合位点的蛋白骨架的氨基酸残基有Met804、Trp812、Glu880、Val882和Met953。 这些氨基酸残基为Wortmanin和LY294002的结合提供了自由的空间(图1—9)n∞’2唰。 图1—9 P13K的抑制剂与P13K的ATP结合位点相互作用模式 LY294002是一种P13K抑制剂，在体内可作为一种高度特异的P13K抑制剂起作用。 15 东北师范大学博士学位论文 当浓度达到50 u M时，可以特异的抑制P13K的激酶活性，但是不抑制脂类激酶，如 P14K，PKC，MAPK或者c-Src。LY294002溶于DMSO或乙醇。用于体外实验或用于细胞 实验时，应用缓冲液将其稀释到所需浓度。用于培养细胞时，建议用LY294002预先处 理细胞一小时。LY294002可以抑制P13K依赖的Akt磷酸化及Akt活化(Cell Signalig Technology)。由于对P13K的研究逐渐走向治疗慢性、非致命性疾病，对P13K抑制剂 安全性能的考虑也在增加。 16 东北师范大学博士学位论文 三、Vavl概述 GTP水解酶中的Rho／Rac家族参与细胞对胞外刺激的应答过程乜叭'202]。它们的活性 对于促进细胞骨架结构的形成有重要作用。形成的细胞骨架参与细胞形变和细胞运动、 脂激酶和蛋白激酶级联反应的活化、细胞发育和增殖过程中关键基因的表达。在静息状 态的细胞中，Rho／Rac蛋白结合GDP而处于非活化状态。细胞活化后，GDP转化为GTP， Rho／Rac蛋白被活化。在此活化过程中，还需要鸟苷酸交换因子(GEFs，guanosine nucleotide exchange factors)的参与。目前已知的Rho／Rac蛋白的交换因子有两类： 第一类包括Rho GDP解离刺激因子(GDSs，Rho GDP dissociation stimulators)，这 类蛋白和Ras特异性GEFs的Cdc25结构域的同源性很低。另一类包括许多带有DH和 PH结构域的蛋白，它们的催化活性直接针对Rho／Rac GTPase。Vav是这类GEFs中的 一员，属于Ras超家族(图1一10)。 ． 玲髻可 ’ } } 早-Pr。o-pT{y r { 。 删hVav鹅々防’●鼍卜 峨 土 ； ÷ ” ◆ Cytoskeleton 0rganization Dr。vav鬣]嘲刻暖F该·俑_}—+—童◇ 图1一10 Vav结构及其作用机制示意图 (一)Vav的组成与分布 Vav家族在哺乳动物和线虫中都存在乜03’20钔。此家族中的第一个成员--Vavl是在 1989年被Katzav发现。此后，这一家族的其它成员相继被发现。所有Vav的结构都很 相似。哺乳动物Vav的结构如图所示(图1—10)。包含一个CH(calponin homology) 结构域、一个酸性区域(Ac)、一个DH结构域、一个PH结构域、一个C1结构域(锌 东北师范大学博士学位论文 指结构)、两个SH3结构域和一个SH2结构域心033。线虫Vav蛋白的C短变异很大，而哺 乳动物Vav蛋白的远端SH3随着进化过程不断缩短，而近端SH3的序列也与常规的SH3 序列差异很大，这一结构域的作用可能很小瞳叫。 Vavl大多表达于造血细胞，从多向性干细胞到大多数成熟的淋巴细胞和中性粒细 胞均有表达。此外，Vavl的表达还见于一些非造血组织，如胰腺、牙釉质、滋养母细 胞等啪耵。但是Vav3的表达很广泛，而Vav2的表达随处可见嘲瑚刀。 尽管Vav家族的 基因在造血细胞中均有表达，Vavl的转录水平远远高于Vav2和Vav3啪踟。 在静息状态的淋巴细胞中，Vav存在于细胞质中。TCR刺激使其转移至细胞质膜上。 这一过程很可能有Zap-70啪3或者LAT-SLP-76的参与。用不同细胞类型(包括Jurkat 细胞)的实验也发现细胞核中也存在Vavl。在肥大细胞中，刺激Fc￡RI(一种TCR相 关受体)30分钟后，Vavl会向细胞核聚集，并与转录因子NFAT、NFK B结合舱m]。 (二)Vavl在信号转导中的作用 由于其在细胞信号转导中不可或缺的作用，Vav家族引起了研究者的关注。通过基 因敲除鼠的研究证明Vav的表达对于细胞骨架、细胞增殖、细胞凋亡是必不可少的。打 破Vav家族正常的活化一去活化循环会严重的改变细胞的行为，引起肿瘤发生、F一肌动 蛋白重组、细胞迁移能力的获得。此外，在本身具有酪氨酸激酶活性的或与酪氨酸激酶 活性相关的一些细胞表面受体通过Rho／Rac蛋白调控有丝分裂和细胞骨架的过程中， Vav家族是上述受体与Rho／Rac蛋白的直接连接点。 Vavl在T细胞中的大量研究大都关注其在TCR信号通路中的作用。当T细胞与抗原呈 递细胞结合时，会引发很多需要细胞骨架重组的事件。Vavl可以通过Cdc42和WASP转导 TCR信号至UArp2／3，从而调控肌动蛋白聚合。在Vavl缺失或者Racl缺失的T细胞中，TCR 引起的ERM蛋白的去磷酸化程度被大幅度抑制，表明Vavl／Rac途径能够转导TCR信号从而 使ERM蛋白失活堙儿3。因此，Vavl可以转导TCR引发的信号，参与细胞骨架的重组。 然而，Vav蛋白在许多细胞受体被活化后都会发生磷酸化。如趋化因子受体、细胞 因子受体、整合素、生长因子受体口111。因此，Vav蛋白很可能在TCR信号通路以外的其 它信号通路中也起作用。然而目前这方面的证据不多。在Vavl功能缺失的T细胞中， B 1和8 2信号通路都正常瞄12—133。不过，这可能是由于三种Vav蛋白间存在补偿。Vav3 功能缺失的成纤维细胞和Vavl／3功能缺失的中性粒细胞的Q v 13 3和0 2信号通路分别 受到抑制乜14’2153。用趋化因子SDF(stromal cell-derived factors)刺激T细胞引起 Vavl的磷酸化，过表达Vavl的突变体抑制SDF引发的细胞极化和迁移口删。 (三)Vavl活性调控 1．Vavl的磷酸化与Vavl的活化 Vav蛋白的酸性结构域至少包含三个酪氨酸磷酸化位点。结构分析结果表明，Vavl 的Tyrl74(三个位酪氨酸磷酸化点之一)和它的DH结构域相结合，抑制其鸟苷酸交换 东北师范大学博士学位论文 因子活性。Tyrl74被磷酸化后离开DH结构域，抑制作用得到解除。此外，DH结构域的 活性也受到CH结构域的抑制，因为这一结构域的缺失导致鸟苷酸交换因子的组成性活 化雎¨3。最近的研究发现CH结构域能够结合C1区域，表明分子间的作用能够封闭DH结 构域，从而抑制DH结构域接触底物GTPase(图l一11)。 图1—11 Yavl活化模式图 在细胞受到刺激后，Vavl的酪氨酸残基迅速出现短暂的磷酸化，从而引起其对 Rho／Rac蛋白的GDP-GTP交换能力的活化。最近的研究发现，酪氨酸磷酸化的出现对这 些蛋白的其它功能也有调控作用。包括对酪氨酸激酶和接头蛋白的结合，形成异源蛋白 复合体以调节这些GEFs信号的出口或在活化结束后终止Vavl活性口171。 2．P13K与Vavl活化 Vavl的PH结构域能够调节其鸟苷酸交换因子的活性。体外实验证明，PH结构域结 合PIP2和PIP3后可以分别抑制和激活Vavl的鸟苷酸交换因子活性乜1引。将PH结构域 内的Ar9422突变成Gly后结合PIP2和PIP3的能力受到抑制瞳191。磷酸化的Vavl的酶 活性可以被PI-3，4-P2和PIP3(P13K的两种激酶产物)上调2倍；相反，如果反应体 系中存在P13K的底物-PIP2，Vav的GDP-GTP交换活性将被彻底抑制心邪3。与此一致，体 内结果显示与P13K共同表达时Vavl的活性增强乜2¨。同样，P13K似乎在CD5和Fc受 体I(FcRI)信号通路中也位于Vavl上游。P13K的抑制剂Wortmanin能够抑制这两条 通路中Vavl依赖的细胞反应乜22’2231。 但是，磷酸肌醇不能活化没有磷酸化的vavl‘删。因此，P13K和Vavl的磷酸化对 Vavl的活性似乎起了很好的协调作用，二者以相互协调的方式起作用，而不是互不依 赖。这种调节方式似乎是在Vavl没有达到最大磷酸化程度时采用的，这种解释与近期 的研究成果一致。有研究发现，通过CD3抗体刺激胸腺细胞或过表达Vavl和Syk的CHO 细胞，P13K的抑制剂对Vavl介导的信号转导没有影响瞳24’2261。P13K产物是否调节Vav2 19 东北师范大学博士学位论文 和Vav3的酶活性目前还不清楚。 总之，Vav家族的最大特点是其酶活性受到酪氨酸磷酸化的调控。目前为止，Ras 超家族的任何其它GDP-GTP交换因子都不具有这种调控。近期的结果表明，Vav酶活性 也受到P13K的激酶产物(一种第二信使)的调节。这种调节方式也见于其它Ras超家 族成员，如Sos、ARNO(Arf nucleotide binding-site opener)乜她2271。研究这些蛋白 的转化形式的实验表明，活细胞中也存在其它的调控其活性的环节。 3．Vavl与细胞骨架 生化研究表明，Vav的DH结构域有鸟昔酸交换因子活性，它们所活化的GTPases 的特定类别存在分歧。一些实验已经证明Vavl是Racl、Rac2和RhoG的鸟苷酸交换因 子；Vav2是RhoA、RhoB和RhoG的鸟苷酸交换因子；而Vav3优先活化RhoA和RhoG， 其次活化Racl。其它实验则证明Vavl可能也活化Racl和CDC42乜28]。 20 东北师范大学博士学位论文 四、Syk／Zap70概述 (～)Syk／Zap70的结构 Syk和Zap70都是细胞的非受体酪氨酸激酶，二者同属于Syk家族。Syk家族激酶含有 一个C一端激酶结构域和串联的N一端SH2结构域，能够结合磷酸化的ITAMs。其“接头"区 被定义为interdomain B，富含酪氨酸，将激酶结构域和SH2结构域分开(图l一12)。这 些酪氨酸残基在磷酸化后可以募集许多蛋白，比如磷脂酶C1(PLC91)、Vav和CBL，这 些蛋白可能是Syk和Zap70的底物心跳3¨。催化结构域外侧的酪氨酸残基突变成苯丙氨酸 后成为功能获得性突变体。这些C一端酪氨酸对其激酶活性进行负调控的机制目前还不明 确。但是一些能够将Syk去磷酸化的磷酸酶可能参与其中。 虽然二者的结构总体相似，Syk和Zap70之间也有重要的差别。大多数Syk在接头区 包含一个由23个氨基酸残基组成的插入片段，而Zap70没有。Syk的另一种选择性剪切产 物，SykB，没有上述插入片段，因此和Zap70结构很相近。近期的实验已经找到了这种 结构差异所带来的后果：Syk联系肥大细胞表面的FcgRI受体和下游的胞内信号的能力远 远强于SykB乜32】。这种差别和Syk对磷酸化ITAMs的亲和力比SykB的强有关。与这些结果 一致，Zap70的行为更像SykB。它联系FcgRI受体信号的能力很弱，与磷酸化的ITAMs的 亲和力也不女ISyk强。 图1—12 Syk家族激酶结构示意图 (二)Syk／Zap70与白细胞信号转导 尽管有大量证据表明，Syk也表达在许多非造血细胞中并且可以负调控癌症[233]oSyk 家族一直以来都被认为是造血细胞特异的信号分子。Northern和Western印迹检测发 21 东北师范大学博士学位论文 现Zap70特异的表达于T细胞和NK细胞乜34’2351。在所有的胸腺细胞和成熟的外周T细胞 中均有Zap70存在p51。这样的表达模式与Syk不同：Syk主要表达于B细胞，在其它细 胞类型，如T细胞、血小板和骨髓来源的细胞中也有较低水平的表达乜静2捌。目前，Syk 家族在白细胞中的功能已经比较清楚。 在TCR和BCR信号通路里，Zap70和Syk分别扮演重要角色。抗原受体被刺激后， 蛋白酪氨酸激酶家族(PTKs)中的Src家族将TCR和BCR的信号基序(ITAMs)的酪氨 酸磷酸化。这一磷酸化的基序进一步募集Syk／Zap70。同时，Syk／Zap70也受到Src家 族的磷酸化。在体外实验中，当细胞经过TCR刺激后，Zap70和Src家族中的Lck可以 形成稳定的复合体乜40’删。 在L一选择素信号通路中Zap70结合到c-AbI-SH2结构域，从而和L一选择素胞浆 尾部形成复合体，参与L一选择素抗体交联所引起的CSF-I的基因表达。在这一过程中， Zap70在c-Abl激酶的作用下磷酸化Y319，从而调节CSF-1基因的表达乜421。 在PSGL—l信号通路中，用Syk／Zap70的特异性抑制剂处理细胞或向细胞内转染Syk 的永久失活型突变体(SykKD)，会阻碍PSGL一1抗体交联所引起的CSF一1基因表达。Syk 可以结合PSGL-1胞浆尾部的ERM蛋白结合，参与PSGL-I信号通路的向下传递n3羽。 此外，在中性粒细胞的整合素介导的outside-in信号通路中，Syk也发挥了重要 作用乜4羽。Syk 6突变的小鼠，其中性粒细胞的趋化作用大大降低阻钔。 白细胞活化和外渗是白细胞参与免疫应答的两个重要生理过程。L一选择素和 PSGL一1均表达于白细胞表面的微绒毛顶端，这种特殊的分布决定了它们在白细胞跨内 皮迁移过程中最先接触到内皮细胞表面表达的配体。此外，它们还是参与白细胞活化的 主要粘附分子。 用L一选择素和PSGL一1的抗体刺激白细胞，可以引起细胞内F一肌动蛋白的聚合和 重新分布、可以上调CSF-1和ILl8基因的表达水平。两种不同的信号受体引起相同或 相似的生理事件可能主要有以下两种方式：一是信号受体的胞浆尾部序列存在同源性， 可以募集相同的信号分子(复合体)从而引起相似的生理事件；二是信号受体通过各自 的胞浆尾部募集不同的信号分子将信号向下传递，然后经过某些／某种特定的信号分子 将信号加以整合，从而引起相似的生理事件。但是序列分析发现L一选择素和PSGL一1 胞浆尾部的氨基酸序列差异很大，这就提示我们L一选择素和PSGL—l很可能是通过共 同的信号分子的整合作用引起相同的信号事件，从而活化白细胞的。因此，本论文的研 究重点就是找到L一选择素和PSGL-1信号通路的整合点。 关于P13K与细胞骨架关系的研究主要集中在P13K在嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋 巴细胞的趋化作用方面。尽管大量的实验结果表明，P13K参与的细胞骨架改变在趋化 反应中扮演着十分重要的角色。但目前还没有人研究P13K与粘附分子介导的白细胞起 始粘附以及白细胞活化之间的关系。我们的结果揭示P13K是L一选择素和PSGL一1信号 通路的关键整合点之一。当中性粒细胞在E一选择素上滚动时，L一选择素和PSGL一1与 E一选择素结合，从而活化P13K。活化的P13K通过调控F一肌动蛋白的聚合和重新分布 参与了由L一选择素和PSGL-1所介导的中性粒细胞在E一选择素上滚动。此外，在 Jurkat细胞中，P13K也参与了由L一选择素和PSGL一1抗体交联所引起的ILl8基因的 表达。 因此，我们把P13K作为L一选择素以及PSGL-1信号通路的一个关键整合点引入到 白细胞信号通路的研究中，深入研究了P13K在白细胞起始粘附过程中发挥作用的机制， 为P13K作为药物研究的靶点提供了新的实验证据。本论文相关内容的阐明对于深入了 解炎症过程中白细胞活化的分子机制以及筛选新的细胞信号通路靶点作为抗炎症药物 都具有重要的意义。 东北师范大学博士学位论文 实验材料与方法 一、实验材料 (一)细胞 1．Jurkat(clone E61)细胞购自上海细胞所。 2．人中性粒细胞从健康人的全血中分离得到。 (二)抗体 1．DREG56：鼠源抗人L一选择素单克隆抗体，能特异的识别L一选择素的凝集素样结构 域。购自Santa．Cruz公司(scl8851)，用于抗体交联时，用量为10 IJ g／ml。 2．KPL一1：鼠源抗人PSGL一1单克隆抗体，购自Santa．Cruz公司(scl3535)。用于抗 体交联时，用量为lO u g／ml。 3．rhE-Fc：重组人E一选择素一鼠Fc嵌合蛋白，购自R&D公司。 4．W6／32：人HLA-ABC的单抗，购自eBioscence。 5．AC-15：鼠源抗actin单克隆抗体(A5441)，购自Sigma公司。 6．PY20：泛酪氨酸磷酸化的抗体购自Sigma公司(P 4110)，1：2000稀释。 7．丝氨酸抗体：Anti—phosphoserine clone 4A4，购自Upstate(05一1000X)，1： 2000稀释。 8．C-14： 兔源抗人Vavl多克隆抗体。购自Santa．Cruz公司(SC一132)，l：1000稀 释。 9．p85抗体：购自Upstate(06—195)和Santa．Cruz公司(sc一1637)，1：2000稀释。 lO．1E7．2：鼠源抗人Zap70单克隆抗体。购自Santa．Cruz公司(SC一32760)，1：1000 稀释。 11．4DlO：鼠源抗人Syk单克隆抗体。购自Santa．Cruz公司(sc一1240)，1：1000 稀释。 12．荧光标记的二抗、鼠-HRP(Horseradish peroxidase)和兔--HRP购于北京中杉公 司，均从Jackson Laboratory进口后分装。 (三)试剂 1．FITC一鬼笔环肽(FITC—phalloidin，P5282)，工作浓度为0．33 p mol／L，购于Sigma 公司。 2．Latruncul in B购自Sigma公司，工作浓度为50 p mol／L，溶于DMSO。能和单体肌 动蛋白结合，从而抑制肌动蛋白聚合。 3．LY294002购自Sigma公司，工作浓度为10 u mol／L，溶于DMSO。P13K的特异抑制 24 东北师范大学博士学位论文 剂。 4．Piceatannol购自Sigma公司，溶于DMSO，是Syk／Zap70家族的特异性抑制剂。 5．硝酸纤维素(NC)膜，购于Invitrogen公司。 6．RNA提取试剂(Trizol，15596—026)，购于Invitrogen公司。 7．逆转录试剂盒(A3801)，购自Promega公司。 8．RealTime PCR试剂盒(DRR033A)，购自Takara公司。 9．荧光素酶双报告系统(E1960)，购自Promega公司。 10．DEPC(D5758)，工作浓度为1：1000，购于Sigma。 11．反转录随机引物和dNTP购于Takara公司。 12．PCR预混体液和Pfu酶购于Takara公司。 13．RPMI 1640和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司。 (四)质粒 1．PTEN表达质粒由Dr．Maria Georgescu(The Rockefeller University)惠赠。 2．pREP7一Rluc由Dr．Keji Zhao(NIH，Maryland)惠赠 3．IL一18一luc质粒为本实验室所有。 (五)引物 IL一18 primers： forward 5’ ACCTGCTGCAGTCTACACAG3’： reverse 5’ GTCCTGGGA-CACTTCTCTGA3’： 13一actin primers： forward：， 5’ATGCCAGGGTACATGGTGGT3’： reverse： 5’TCGTGCGTGACATTAAGGAG3’： (六)主要仪器及设备 超净工作台(Air Tech，苏州净化仪器厂)、CO。培养箱(Thermo Forma 31 11)、倒置 显微镜(Olympus)、台式高速冷冻离心机(Beckman Coulter)、双报告系统检测仪 (Promega)、Real—t ime PCR仪(ABI PRISM 7000 Sequence Detecti on System，AB Applied Biosystems)、PCR仪(Thermo Electron Corporation)、电转仪(Bio—Rad Gene Pulser X—celll’E1ectroporation System)、电泳仪及电转移装置(Bio Rad)、水平摇 床和垂直摇床(北京市六～仪器厂)、荧光分光光度仪(Turner Designs TD20／20)、漩 涡震荡器(Vortex genie一2，Scientific Industries)。 二、实验方法 (一)中性粒细胞的提取 1．试剂 东北师范大学博士学位论文 6％Dextran T-500盐平衡液：用100 mlPBS溶解6 gDextran T-500，现用现 配。 聚合蔗糖一泛影葡胺分层液(d=1．007) 红细胞裂解液(Tris-NI-hCl缓冲液)： 0．17 M Tris： 2．060 g／100 ml： O．16 M NH4C1：8．30 g／1000 ml， 将100 ml Tris与900 ml NH,C1混合，调pH 7．2。 2．步骤 (1)向3—10 m1抗凝血加入1／3体积的6％DextranT-500盐平衡液，混匀后4℃静置 l一2 h使其分层，以上层无红细胞(红色)为最佳。 (2)转移上层液体至新的lOml离心管中，沿管壁轻轻按5：3加入聚合蔗糖一泛影葡胺 分层液(3／8)。2000 rpm，4℃离心20 min。 (3)轻轻移去上清，用红细胞裂解液悬起沉淀，4℃放置10一15 min。1200 rpm，4℃ 离心10 min。 (4)移去上清，沉淀即为中性粒细胞。用HBSS buffer(pH 7．4，不含Ca2+)重悬为 4．0×107个／m1，检验细胞存活率，并判定细胞活化程度。用于实验前需添加CaCI： 至终浓度为1．5 IIlM。通过这种方法，可以使中性粒细胞在分离后大约4 h内处于 非活化状态。 (二)体外模拟毛细血管的层流实验 1．重组人E一选择素一鼠Fc嵌合体(rhE—selectin—Fc)溶于TBS，使其终浓度为2．5 u g／ml。 2．取上述rhE—selectin—Fc溶液100 p l，铺在35mm平板的底部。4℃冰箱内静置过 夜。 3．吸掉上层液体，用2％HAS(human serum albumin)的TBS室温封闭平板底部30 min， 用PBS／Ca2+／M92VBSA灌流液洗涤后与层流装置连接备用。 4．用含有1．5 II】M CaCl。的HBSS洗涤中性粒细胞后重悬为1．OX 107个／ml。分别用特定 浓度的DREG56、KPLl、Latrunculin B、LY294002或Piceatannol与中性粒细胞在 冰上孵育30 min。 5．用处理后的中性粒细胞在1．2 dyn／cm2的剪切力作用下灌入层流小室。 6．在倒置显微镜(Panasonic，Yokohama，Japan)下观察中性粒细胞与E一选择素之间 的作用，并通过和层流装置相连的视频装置记录层流过程约3 min。 7．在2—3 min之间随机选取10个视野，数出滚动在E一选择素表面的中性粒细胞数， 计算出各个实验组与对照组之间的比率。 (三)免疫荧光分析及流式细胞仪分析 1． (1) (3) 200 p l Triton X-100用PBS溶液配制，终体积100 ml，4。C保存。 (4)0．5％BSA封闭液： 0．5 g BSA用100 ml PBS溶液溶解，4。C保存。 2．步骤 (1)前处理过程 每个样品收集1×106个中性粒细胞，用PBS洗一次后用RMPI 1640培养基重悬为 50u 1体系。分别加入20 u g／m1的W6／32、DREG56、KPLl、DREG56+KPLl、rhE—Fc， 或者不加抗体，冰上孵育20min。PBS洗一次，重悬为50 u l体系，加入20 u g／ml 的羊抗鼠抗体的F(ab’)2段冰上继续孵育20 min。37℃交联i0 min。 (2)固定 向上述样品中各加入终浓度为1％的甲醛溶液，室温固定20 min，加入冰预冷的 PBS终止反应。离心，用PBS洗细胞2次。 (3)透化 向各管中加入透化液，室温透化5 min，离心，用PBS洗两次。 (4)抗体染色 用PBS重悬各样品至100 p l，加入33|l l FITC-鬼笔环肽贮存液，室温避光反 应30 min。 (5)PBS洗3次后，重悬为50 u l细胞悬液，于倒置荧光显微镜(Nikon，日本)下观察 并照相。或者用500 u 1PBS重悬后制成单细胞悬液，用流式细胞分析仪检测。 (四)亚细胞组份的分离及提取 1．中性粒细胞与10 11 g／ml的rhE—Fc在冰上孵育30 min。在37℃刺激合适的时间后， 加入冰预冷的PBS于冰上终止反应。1500 rpm，4℃离心2 min后，参照Martin 等人的方法分离细胞膜和细胞质组份，且以下所有过程都在冰上进行。 27 东北师范大学博士学位论文 2．中性粒细胞用冰预冷的低渗缓冲液(42 mM KCl，lO mM HEPES[pH 7．4]，5 mM MgCl：， 10 u g／m1 aprotinin和leupeptin)重悬后，在冰上孵育15 min。 3．200 g，4℃离心i0 min后收集上清到新的离心管。 4．13000 g，4℃离心60 min，上清即为细胞质。 5．上一步离心得到的沉淀用裂解液(20 IIlM Tris—HCl[pH 7．5]，150 mM NaCI，1％ Nonidet P一40，i0 u g／ml aprotinin和leupeptin)重悬。4℃涡旋5 min。 6．13000 g，4℃继续离心60 min，上清即为细胞膜。 7．向细胞质和细胞膜成份各加入等体积的2 X Laemmli缓冲液。煮沸5 min，-20℃ 保存，或直接用于SDS—PAGE。 (五)蛋白质免疫共沉淀 1．中性粒细胞与10|l g／ml rhE—selectin—Fc冰上孵育30 min后在37℃刺激5 min。 2．加入冰预冷的PBS终止反应，1300 rpm，离心。 3．细胞沉淀用冰预冷的裂解液重悬，冰上裂解30 min。 [裂解液配方：50 IIlM Tris(pH 7．5)，150 mM NaCI，1 mM EDTA，1 IIlM EGTA，1％Nonidet P一40，2．5 mM sodium pyrophosphate，1mM NaF、Na3V04和glycerolphosphate，20 u g／ml aprotinin／leupeptin] 4．13000 g，4℃离心30 min。 5．上清转到新的离心管后用蛋白A protein A琼脂糖珠子预清除1 h。 6．离心后转移上清到新的离心管，加入3 p g所需抗体4℃摇动过夜。 7．免疫沉淀产物用裂解液洗6次后，加入等体积的2 X Laemml i缓冲液。煮沸5 min， 一20℃保存，或直接用于SDS-PAGE。 (六)蛋白质电泳和免疫印迹(Western blot)检测 1．试剂 (1)丙烯酰胺贮备液：Acrylamide／bis(29．1 g／0．9 g)，溶解后定容至i00 ml。 (2)分离胶缓冲液：1．5 M Tris-HCl(pH 8．8)。 (3)浓缩胶缓冲液：0．5 M Tris—HCI(pH 6．8)。 (4)i0％(w／v)SDS： i0 g SDS／100 ml水。 (5)i0％(w／v)过硫酸铵溶液： 10 g过硫酸铵／lOO ml水，临用前配制。 (6)丽春红染液：溶解于1 mL醋酸中，加ddH20至100 ml。 (7)TBST(pH7．5)：TBS加Tween一20至终浓度为0．05％。 2．步骤 (1)待检测的蛋白样品进行SDS—PAGE电泳，分离胶浓度为10％。 (2)在常规配置转移缓冲液(pH 8．3)中将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。 转模条件：冰浴，IOOV转移1一1．5 h。 (3)对转移到硝酸纤维素膜上的蛋白质染色：将膜放入丽春红染液中染色2 min左右， 在蒸馏水中脱色至出现蛋白条带。在水中浸泡2 min或直接用TBST浸泡，使完全脱 色。 (4)将硝酸纤维素将膜转入含5％脱脂奶粉的TBST(封闭液)中，常温封闭1—2 h，以 封闭掉硝酸纤维素膜上的免疫球蛋白的非特异性结合位点。 (5)用封闭液或TBST稀释一抗，放入印有蛋白的硝酸纤维素膜在水平摇床上摇1h。置 于TBST缓冲液中洗三次，5—10 min／次。 (6)用TBST稀释的二抗，与硝酸纤维素膜在水平摇床上摇l h，用TBST缓冲液洗3—4 次，5 min／次。 (7)ECL显色。将膜在底物溶液中孵育5 min后立即压上X光片，放入曝光盒中曝光。 大约2 min后取出X光片，将其放入显影液至蛋白条带显现清楚时立即放入定影液 终止反应。 (8)根据实验需要，可以把硝酸纤维素膜放入55℃的Stripping Buffer作用20—30 min，TBST洗膜20 min后，可继续加入其它一抗，对同一张硝酸纤维素膜进行下 一个Western检测。 (七)Jurkat细胞的培养 Jurkat重悬于含1％青霉素、1％链霉素和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中， 置于含5％C0。的37。C培养箱中培养。 (八)质粒的大量制备 1．试剂 (1) LB培养基 l L PH值7．2 蛋白胨 10 g 酵母粉 5 g NaC】 5 g 121。C高压灭菌 20 min 固体培养基制作时，需要添加15％的琼脂粉。 (2) 溶液I 1000 L 25 mM Tris-HCl 25 ml 1．O M Tris-HCl(PH 8．0) 10 mM EDTA 20 ml 0．5 M EDTA(PH 8．0) (3) 溶液II 500 ml 0．2 M NaOH 4 g 1％SDS 5 g (4) 溶液III(PH 4．8—5．0) 500 ml 5 M I(AC 300 ml 冰醋酸 57．5 m1 29 东北师范大学博士学位论文 无菌水 142．5 ml (5) 5 M LiCl l L 212 g LiCl 定容至l L (6) 5 M Khc l L 409．7 g Khc 定容至1 L (7) 13％PEG8000(添加1．6M NaCl，促进DNA沉淀) 100 ml PEG8000 13 g NaCl 9．35 g o 121 C 20 min (8)无菌水121。C高压灭菌20 min 2．步骤 (1)4。C，4000 rpm离心5 min，收集生长饱和的200--300 ml茵液。 (2)弃上清，用20 ml冰预冷的溶液I重悬沉淀。 (3)加入20 ml冰预冷的溶液II，混匀时轻轻转动瓶子2—5 min，直至溶液变透明。 (4)加入20 m1冰预冷的溶液III，充分混匀，冰浴10 min。 (5)4。C，13000 rpm离心30 min。 (6)上清转入新的100 ml离心管中，加0．7倍的异丙醇，混匀，冰浴10 min。 (7)4。C，13000 rpm离心30 min。 (8)沉淀用2 m1无菌水充分溶解后转入50 m1离心管中。 (9)用1 ml无菌水分两次洗涤原离心管中残留的DNA。 (10)等体积加入5 M的LiCl，混匀。 (11)4。C，13000 rpm离心10 min。 (12)上清转入新的50 ml离心管后加入等体积异丙醇，冰浴10 min，4。C，13000 rpm 离心15 min。 ． (13)弃上清，沉淀用70％乙醇洗1次，抽干。 (14)用500 la l无菌水溶解，转入1．5 m1 EP管中(用200 la 1和300|I 1无菌水分2 次洗)。 (15)加入20 u 1 10 mg／ml Rnase h，37。C，温育30 min。 (16)加入等体积的13％PEG8000(500 la 1)混匀，室温作用l h。 (17)4。C，13000 rpm离心10 min。弃上清，将管倒扣在滤纸上吸干余下的液体。 (18)用400 u 1无菌水溶解沉淀。 (19)加入等体积的酚／氯仿，振荡混匀。 (20)4。C，13800 rpm离心5 min。轻移上层水相到另一离心管中。 (21)加入200|l 1无菌水到酚／氯仿中，4。C，13000 rpm离心5 min。轻移上层水相 到另一离心管中合并两次水相。 (22)加入1／lO体积的3 M NaAc(PH 5．2)。 30 东北师范大学博士学位论文 (23)加入2倍体积的无水乙醇，--20。C，30 min。 (24)4。C，13000 rpm离心15 min。 (25)弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，抽干。 (26)用400 gl无菌水溶解DNA沉淀，测量光吸收值，A260／280 nm应为1．7—1．9。 (九)瞬时转染 (1)转染时将Jurkat T细胞状态调整到最佳状态。刚复苏的细胞在体外传代一周以后 用于实验。 (2)转染前收集细胞，用大约10 m1不含血清的培养基洗涤细胞。 (3)吸出培养基，用不含血清的培养基重悬为单细胞悬液调整细胞浓度到2×107个／ml。 (4)将200 gl细胞加到电转杯中，并将欲转染的质粒加入电转杯中，轻轻混匀后利用 电穿孔仪Gene Pulser X-cell僵(BIO-ROD)，电压250 V，960 pF进行电击。 (5)电击后，室温放置10 min，尽快将细胞转移到细胞培养板中，补足培养基和血清。 将细胞放在37。C的CO：培养箱中培养24—48 h后，观察或检测。 ’ (十)荧光素酶双报告检测 向Jurkat T细胞共转染3 gg PTEN表达质粒(或者3 gg pcDNA3．1(一))、3 gg报告 质粒ILl8-1uc和250 ng的pREP7一Rluc，置于125L板中，37。C培养24 h后，用抗L一选择 素或PSGL一1的抗体交联6 h。然后收集细胞进行裂解，用TD20／20光度计中的双荧光素酶 实验系统测定并计算荧光素酶的相对活性(萤火虫荧光素酶／水母荧光素酶)： (1)收集细胞，用PBS洗涤2次，吸出PBS。 (2)加入200 gl PBS，吹打收集细胞于1．5 ml离心管中。 (3)离心1400 rpm／min，4 min，收集细胞沉淀。 (4)根据细胞量加入100 gl左右的细胞裂解液，轻轻吹打相同次数裂解细胞。11000 rpm 离@30 S。 (5)吸取10肛l上清液置于新的1．5 m1离心管中。加入50“l荧光素酶检测试剂(LARII)， 利用TD20／20光度计测定萤火虫荧光素酶的表达值。 (6)再向同一个管中加入50肛1停止试剂(stop)，利用TD20／20光度计测定水母荧光素 酶的表达值。计算用萤火虫荧光素酶的表达值与水母荧光素酶的表达值相除，即得 到荧光素酶的相对活性。 (-p一)RT-PCR，RealTime PCR Jurkat细胞分别转染3 ggPTEN表达质粒或者3雌空载pcDNA3．1(～)，于六孔板中 37。C培养24 h后提取RNA。取2 Pg RNA逆转录为cDNA，PCR扩增IL一18基因(30个循 环)，或内参B-actin(18个循环)。Realtime PCR按照Takara公司的SYBR"Premix Ex TaqTM试剂盒说明书中的操作方法进行。实验步骤如下： 1．RNA的提取 东北师范大学博士学位论文 (1)将经过处理的细胞分别收入1．5 ml离心管中，1200 rpm离,b5 min，PBS洗细胞一次， 根据细胞沉淀的多少加入约500 u l Trizol，吹打至溶液变得澄清。 (2)在室温下，放置5 min分离RNA(使核蛋白与DNA、RNA分离)，加入250 la 1氯仿，盖 好盖子，用手剧烈震荡1 min，静置3 min后12000 rpm室温离心5 min。离心结束后 RNA进入上层水相。 (3)将上清转到新的离心管中，再加入250 p l的异丙醇沉淀RNA，室温静置lO min后12000 rpm离，5,5 min。离心后在管底可见RNA沉淀。 (4)倒掉上清，加入至少1 ml 75％乙醇，震荡混匀以洗涤RNA。室温12000 rpm离,b5 min 后小心倒掉上清。瞬时离心并吸出液体(尽量不要有残留液体)。 (5)RNA的溶解：洗涤后的RNA在室温干燥5—10 min(不要完全干燥，否则不易于RNA 的溶解)，用20 Ixl DEPC水溶解RNA。放多J-20或-80。C保存。 2．RNA的逆转录 在实验前，Jurkat细胞用无血清RPMI 1640培养基洗1次，重悬计数。用DREG56、 KPLl刺激细胞一定时间。在一些抑剂实验中，细胞需要先用10 u l LY294002处理30 min。利用Promega公司的Reverse Transcription System试剂盒进行实验，具体步骤 如下： (1)将用DEPC水处理过的无菌1．5 ml离心管插于冰上预冷。 (2)在每管中加入大约1 Pg RNA(4 p1)的模板，20 pM(1“1)的随机引物，混匀后 70。C温育5 min。快速置于冰水混合物中保存，直到进行逆转录反应。 (3)向新的离心管中依次加入以下药品(15 pl体系)： MgCl2 25 mM 2．4“1 Reverse Transcription lO×buffer 4 pl dNTP mixture，lO mM l灿 Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0．5 pl Improm-II用Reverse Transcriptase 1 Ul 用无核酶的水补足至 15蛆 轻轻混匀，加入上述预处理的模板混合物中。 (4)25。C，退火5 min；42。C，延伸120 min；70。C，15 min。-20或一80。C 保存或直接进行下一步PCR扩增反应。 (5)取2 pl cDNA作为模板，加入扩增目的基因(IL-18)及内参基因(actin)的引物 和其它试剂进行普通PCR或者荧光适时定量Real--time PCR。 3．PCR反应 (1)普通PCR PCR反应在Biometra@T-Gradient Thermoblock(德国)PCR仪上进行，反应条件为 94。C， 1 min，循环1次； 94。C， 30 S，退火温度1 min，72。C，45 S，循环 32 东北师范大学博士学位论文 20—40次；然后72。C， 5 min，循环1次。退火温度根据各个实验中所使用的引物的 退火温度进行调节。 PCR反应体系为25 ll 1，其中： Premix Ex Taq 12．5 U l Sense弓I物(i0 M) l u l Antisense弓I物(10 IJ M) l lI 1 模板 1—4 u l dH。0(灭菌蒸馏水) 补足至25|I l (2)Real--time PCR Real--time PCR实验在ABI PRISt一7700序列检测系统(PE Applied Biosystems， 美国)上进行。PCR反应用两步法进行，条件是95。C 60 S，循环1次，95。C 15 sSn60。C 60 S，持续循环45次。反应过程中使用的染料是带有荧光染料的PCR反应混合物SYBR Green Realtime PCR Master Mix。所得结果的Ct值(threshold cycle)定义为达到超 一A ACt 出荧光信号的检测阈值时所需要的循环数。 所得数据用2 的方法来计算。 反应体系为25|1．1，其中： SYBR Green Realtime PCR Master Mix 12．5 p 1 Sense弓l物(10IJ M) 2．5 u 1 Antisense弓I物(10 p M) 2．5 U l 模板 2 U 1 dH。0(灭菌蒸馏水) 5．5 u 1 33 东北师范大学博士学位论文、 实验结果与分析 一、 L一选择素／PSGL-I与E选择素相互作用介导中性粒细胞在E一选择 素上的滚动 Green等人报道，E一选择素可以识别L一选择素和PSGL-I上唾液酸化的sLel (sialyl Lewisx)，从而作为L一选择素和PSGL-I的配体。其他人的体外实验也证明重 组猪E一选择素一人Fc嵌合体能够与L一选择素和PSGL-I免疫共沉淀∞2一删。在炎症反 应中，内皮细胞被周围环境中的炎症介质活化，表达E一选择素。我们通过体外模拟毛 细血管的层流实验，检测了中性粒细胞上的L一选择素和PSGL-I与中性粒细胞在E一选 择素上滚动的关系。将中性粒细胞分别与L一选择素或PSGL-l的抗体(DREG56或KPLl) 在冰上孵育30 min后在E一选择素上滚动，此时中性粒细胞在E一选择素上的相对滚动 数与对照组(没有加抗体孵育，直接进行层流实验，No Ab)相比，分别降低了48％和 60％；如果用DREG56和KPLI同时处理中性粒细胞，滚动数被进一步降低至25％；用 金属离子鳌合剂EGTA除去金属离子后，滚动几乎被彻底抑制(图3．1)。这～结果表明， 虽然在中性粒细胞表面存在其它的E一选择素配体，但其在E一选择素上的滚动主要由 L一选择素和PSGL一1介导的。 120 100 80 60 ^_o．I-曩ou零一篁盘Q≯Q 40 20 w罱霉一。篙 O 图3．1 L一选择素和PSGL-I介导了中性粒细胞在E一选择素上的滚动 中性粒细胞不加抗体(No Ab)或者加入DREG56、KPLI、EGTA冰上作用30 rain后在固定 的rh—E-Fc上滚动。单位时间内对照组在E一选择素上滚动的细胞数当作i00％，实验组 在E一选择素上滚动的细胞数与对照组的相除得到滚动数的百分率。 二、 用E一选择素交联中性粒细胞表面的L一选择素和PSGL-I能够引起 东北师范大学博士学位论文 F一肌动蛋白的重新分布和聚合 本实验室以前的实验证明，L一选择素和PSGL一1抗体分别交联中性粒细胞能够引起 F一肌动蛋白细胞骨架的重排和聚合眩1’刎。在本实验中，我们用E一选择素同时交联L一 选择素和PSGL一1来研究这两种粘附分子对细胞骨架的影响。实验结果表明，在静息的 中性粒细胞(没有加入抗体交联细胞)中，F一肌动蛋白在细胞质中均匀分布(图3．2 A： №Ab)：用DREG56或KPLl分别交联中性粒细胞10 min后， F一肌动蛋白聚集成簇(图 3．2A：DR；KP)，而用L一选择素和PSGL-1的非相关抗体交联，却不能引起这种成簇现 象(图3．2A：W6／32)；当中性粒细胞被DREG56和KPLl同时交联后，F一肌动蛋白的成 簇分布更加明显(图3．2A：DR+l【P)；用E一选择素交联10 min后，中性粒细胞 A ■■■■ ■圜■田 B 120％ 100％ 80％ 60％ 40％ 20％ 0％ ∥夕一 东北师范大学博士学位论文 rhE—Fc)。如果在加入抗体或E一选择素交联前，用Latrunculin B预先结合细胞内单 体形式的肌动蛋白，从而干扰交联引起的F一肌动蛋白聚合，将不能观察到由L一选择素 和PSGL-1交联所产生的F一肌动蛋白簇(图3．2A"LatB before DR+KP；LatB before thE—Fc)。这一结果表明，L一选择素和PSGL-1可以与E一选择素结合，引起F一肌动蛋 白的成簇分布。如果干扰肌动蛋白的聚合，F一肌动蛋白的成簇现象会受到抑制。图3．2B 分别统计了视野范围内F一肌动蛋白成簇分布的细胞和静息状态的细胞与细胞总数的比 率。进一步说明图3．2A中展示的是实验中大多数细胞F一肌动蛋白的分布情况。 由于干扰F一肌动蛋白的聚合会抑制F一肌动蛋白成簇。我们进一步检测了L一选择 素和PSGL一1交联与F一肌动蛋白聚合的关系。将实验组的平均荧光强度与对照组细胞的 平均荧光强度相除得到相对荧光强度(RFI)，并用相对荧光强度来反应肌动蛋白的聚合 情况。与实验室的前期工作相一致，我们的结果显示L一选择素和PSGL一1抗体分别交 联中性粒细胞，可以使相对荧光强度增加到1．75和1．83=但是当用两种抗体同时交联 时，相对荧光强度的值却增加到2．84；同样，用E一选择素交联中性粒细胞也可以使相 对性光强度增加。如果在交联前用Latrunculin B预处理，会使相对荧光强度降低到本 底水平。这一结果表明E一选择素可以交联L一选择素和PSGL-1，引起F一肌动蛋白的聚 合(图3．3) 4 3．S 3 2．5 2 1．S l O．S O ．≯≯夺 图3．3 E一选择素交联L一选择素和PSGL-I能使F-actin重新分布和聚合 中性粒细胞用抗体或E一选择索交联lOmin后，卜肌动蛋白的分布情况。对照组 (No Ab)：不加一抗，直接与二抗作用后交联； 实验组中性粒细胞加入特定一 抗后，在加入二抗交联。用FITe-鬼笔环肽染色后，通过流式细胞仪分析F一肌 动蛋白的量。有抑制剂Latrunculin B加入的实验组，先用抑制剂处理再加入 抗体交联。流式细胞仪检测所得的平均荧光强度可以反映F一肌动蛋白的含量， 相对荧光强度(RFI)=实验组平均荧光强度／对照组平均荧光强度。 三、 中性粒细胞在E一选择素上的滚动依赖于E一选择素和L一选择素 36 东北师范大学博士学位论文 ／PSGL-1相互作用所引起的F一肌动蛋白重新分布和聚合 因为细胞骨架对于细胞运动非常重要，而Latrunculin B能够抑制E一选择素交联 引起的F一肌动蛋白重新分布和聚合(图3．2，3．3)，我们在本实验中用Latrunculin B 来进一步研究F一肌动蛋白的聚合和重新分布与中性粒细胞在E一选择素上滚动的关系。 实验结果显示，中性粒细胞在E一选择素上的滚动被Latrunculin B抑制，且这种抑制 和Latrunculin B浓度之间存在剂量依赖的关系(图3．4 unblocked)，表明卜肌动蛋 白的重新分布和聚合对于中性粒细胞在E一选择素上的滚动至关重要：如果在层流实 验之前先用抗体将中性粒细胞的L一选择素和PSGL—l封闭，Latrunculin B对上述滚动 事件没有产生明显影响，说明Latrunculin B所抑制的F一肌动蛋白的重新分布和聚合 是由E一选择素和L一选择素／PSGL一1的作用所引起的(图3．4 blocked)。 120 lOO 80 60 40 20 一一oJluou寥葛ua言泓墨lo宙 O 0 25 50 75 Conce ntration of Lat B(raM) 图3．4 Latrunculin B抑制中性粒细胞在E一选择素上的滚动 unblocked：中性粒细胞与不同浓度的Latrunculin B孵育10 min后用于在 rh_E—Fc上的层流实验；blocked：用Latrunculin B处理前，先将中性粒细胞 与L一选择素和PSGL-I用抗体封闭。 滚动率=实验组的滚动数／对照组的滚动 数。对照组(0 uM Lat B)的滚动率看作100％。 随后我们按照图3．4的方法，用Latruncul in B处理中性粒细胞，并用试剂盒检测 了不同浓度的Latrunculin B对细胞活性的影响。结果显示中性粒细胞在经过 Latrunculin B处理后，其活细胞的比率在92-96％之间，表明本实验中Latrunculin B 的用量没有对中性粒细胞的活性造成影响(图3．5)。 至此，我们可以得出结论：中性粒细胞在E一选择素上滚动的过程中，L一选择素 和PSGL-I受到E一选择素的作用，从而引起细胞内F一肌动蛋白的重新分布和合成，新 生成的F一肌动蛋白和其在细胞内的重新分布反过来维持中性粒细胞在E一选择素上的 滚动。 37 东北师范大学博士学位论文 120 100 80 60 ^10暑皇ou慕．)sI弓u 40 20 oAlrI 0 Conce ntration ofLat B(pM) 图3．5 Latrunculin B不影响中性粒细胞的活性 中性粒细胞处理方法与图3．3 unblocked组的方法相同。细胞活性用相对活细 胞数表示。对照组(O u M Lat B)的细胞活性当做100％， 实验组的细胞活性 与对照组相除得到相对活细胞数。 四、P l 3K在L二-选择素和PSGL-1受到E一选择素交联后活化 1．酪氨酸磷酸化的p85在中性粒细胞受到E一选择素交联后向细胞膜募集 F一肌动蛋白的重新分布和聚合受到很多蛋白激酶的调控。如c-Abl分别参与中性粒 细胞中L一选择素和PSGL-1抗体交联所引起的F一肌动蛋白重排和聚合口1’矧；PKC 0和 Vavl相互作用，参与TCR介导的细胞骨架改变乜矧； Vavl和Rac可以调控T细胞脂筏 聚集所依赖的细胞骨架的重组n34’溯。另外，蛋白的酪氨酸磷酸化并向细胞膜的募集是 激酶活化的经典方式。因此，我们将中性粒细胞用rhE-Fc交联不同时间段后，提取细 胞膜。通过检测细胞膜组份中蛋白的酪氨酸磷酸化水平来研究哪些蛋白可能参与E一选 择素交联所引起的中性粒细胞F一肌动蛋白改变。Western检测结果表明：在中性粒细胞 用E一选择素交联1—10 min的特定时间内，有一种大约85 kDa的蛋白以酪氨酸磷酸 化的方式出现在细胞膜上。而且这种磷酸化蛋白向细胞膜募集的量随着E一选择素交联 时间的延长逐渐增多，交联5 min后达到最大量，交联lO min后仍能够检测到酪氨酸 的磷酸化(图3．6 A)。根据其分子量的大小，我们推测这种磷酸化的蛋白可能是P13K 的调节亚基p85。为了验证这一假设，我们将用于上述Western检测的膜除去结合的抗 体后，用p85的特异性抗体进行了第二次Western检测。结果表明我们在图3．6A中看 到的85 kDa的蛋白就是p85(图3．6 B)。与此过程相似，针对同一张膜的第三次Western 检测表明在E一选择素交联中性粒细胞过程中没有发生p85的丝氨酸磷酸化(图3．6 C)。 但是，与上述实验上样量相同的另一个平行的Western检测却发现肌动蛋白在细胞膜上 的含量随着E一选择素交联时间的延长没有明显变化，因此我们用肌动蛋白的Western 检测结果作为上样量的内参(图3．6D)。 38 ■ B rhE-F霉(min) IB：pS5 WL 0 l 3 S 7 lO M e IB：飘一thE-除(rain) Wl。0 l 3 5 7 10 M D IB：actin rh E-Fc(min) WL 0 I 3 5 7 10 M 图3．6 E一选择素交联中性粒细胞使酪氨酸磷酸化的p85向细胞膜募集 39 东北师范大学博士学位论文 A：中性粒细胞与E一选择素(rhE—Fc)在37℃作用一定时间后，分离膜成份。各 取20 p 1进行SDS-PAGE。转膜后检测酪氨酸磷酸化水平(TyrP)；B：本图A中的 硝酸纤维素膜与stripping缓冲液在50℃孵育20 min，检测p85；C：按照本图B 的方法，检测丝氨酸的磷酸化水平(SerP)；D：另取中性粒细胞各20 u l进行 SDS-PAGE，转膜后检测肌动蛋白的量(actin)；M：蛋白预染marker：WL：中性粒 细胞的全细胞裂解液。 2．E一选择素交联使p85从中性粒细胞的细胞质募集到细胞膜 细胞膜上某种蛋白量的增加可能是由于这种蛋白表达量的增加引起的，也可能是由 于细胞内的蛋白向膜运动引起的。目前已有的大量文献也表明p85的磷酸化并由细胞质 向细胞膜运动的过程是P13K活化的经典方式之一n3叫。因此，在接下来的实验中，我们 进一步研究了中性粒细胞膜上出现的p85的来源。实验结果显示，在E一选择素交联后 细胞质中的p85减少，而细胞膜上的p85从无到有。因而，我们在图3．6中检测到的 p85至少有一部分来源于细胞质。 A —DR KP rhE—Fc IB：p85 1．0 0．9 0．9 IB：actin 1．0 0．9 1．0 0．9 B 一DR KP rhE—Fc IB：p85 1．O 0．6 0．4 0．4 IB：acfin 图3．7 E一选择素交联使中性粒细胞胞质中的p85向膜募集 中性粒细胞分别用L一选择素(DR)和PSGL-1(KP)抗体，或用E一选择素(rhE-Fc) 交联7 min后提取细胞膜组份和细胞质组份。A：各取20 p l细胞膜组分进行 SDS—PAGE后转膜并检测p85的量。actin为上样量的参照。B：各取20 p 1细胞质 组份SDS-PAGE后转膜并检测p85的量。actin为上样量的参照。用Image—Pro Plus 6．0图像处理软件分析各特异性条带的相对光密度值(IOD／area)，把A中的(DR) 组，B中的(一)组的值当作1，其它实验组的值分别与之相除得到的相对值作为衡 量特定蛋白含量多少的依据。 3．E一选择素交联中性粒细胞能够使Vavl以P13K活性依赖的方式活化 前面的结果提示我们中性粒细胞很可能在E一选择素交联后，通过p85的磷酸化并 向膜募集而活化P13K。为了进一步证实这一结论，我们选取P13K信号通路下游的Vavl 东北师范大学博士学位论文 进行研究。Vavl可以通过结合P13K的激酶产物PIP3被带到膜上进而活化其鸟苷酸交 换因子的活性，并通过下游的Rac2参与细胞骨架的重排Ⅱ3制。Western检测结果显示， 当中性粒细胞受到E一选择素交联时，细胞膜上的Vavl迅速增加(图3．8A)，而细胞质 中的Vavl相应减少(图3．8B)，这一结果表明中性粒细胞Vavl在受到E一选择素交联 时，会从细胞质募集到细胞膜上。 由于Vavl的活化依赖于酪氨酸的磷酸化。我们进一步检测了细胞膜上的Vavl的磷 酸化水平。结果显示，如果在E一选择素刺激前用P13K的抑制剂LY294002预处理，细 胞膜和细胞质中Vavl的量均没有明显变化(图3．8 c，D)，而细胞膜上Vavl的酪氨酸 磷酸化不能发生。 A B -DR KP rhE-Fc ． DR 时rh嘶 IB：Vavl m：Vavl■■鞠鞠删 1．O 0．6 0．5 0．2 IB：actin IB：actin—麓痢蟊■■■曛 1．0 1．o 1．0 1．0 C ． D 吐 吖嘛 ++ + LY ． + - - + + IB：Vavl rhE．Fc IB：Vavl IB：TyrP鍪葛瀣萱 蠢 舞匿?’叫-■口■黔4圈节 释州疆I m．a晌●离 圈 ． ．0- IB：actin 1．0 0．9 O．8 图3．8 E一选择素交联后Vavl向膜募集并活化 A，B：中性粒细胞用E一选择素刺激7 rain后，分离细胞质和细胞膜组份，检测 细胞膜(A)和细胞质(B)中Vavl的含量。C，D：在中性粒细胞用E一选择素 刺激前先用LY294002或DMSO(一)处理，分离细胞质和细胞膜组份，检测细胞 膜(C)和细胞质(D)中VavI的含量，或Vavl的磷酸化情况(C)。 五、P13K参与E一选择素交联引起的F一肌动蛋白重新分布和聚合 以上结果表明，中性粒细胞的L一选择素和PSGL-1受到E一选择素的交联后能够活 化P13K，进而活化Vavl，这也为P13K参与中性粒细胞在E一选择素上滚动过程中所产 生的细胞骨架变化提供了可能。为了验证这种可能性，我们将中性粒细胞用P13K的特 异性抑制剂处理后再用E一选择素交联，结果表明50 u M的LY294002抑制可以将E一 选择素交联中性粒细胞所引起的F一肌动蛋白的重新分布抑制，此类细胞内F一肌动蛋白 的分布情况与静息状态的细胞相似，不能形成F一肌动蛋白簇(图3．9A)。图3．9B给出 41 东北师范大学博士学位论文 了F一肌动蛋白成簇的中性粒细胞或者静息状态的中性粒细胞与视野内细胞总数的比 率，说明在图3．9A中展示的细胞是视野内绝大多数细胞的F一肌动蛋白分布情况。 A ■■一 圈■圈 B 120％ 口resting 口clustered 100％ 80％ 60％ 40％ 20％ O％ 图3．9 P13K的活化参与中性粒细胞F．肌动蛋白的重新分布 A：中性粒细胞与50 p M LY294002[LY(+)]或等体积的DMSO ELY(一)]预孵育 后，用DREG56和KPLI同时交联或用E一选择素交联。 固定、透化后用O．33 p M的FITC一鬼笔环肽染色观察。B：按图3．2B的方法计算静息状态的细胞 和F一肌动蛋白成簇的细胞所占比例。 此外，我们用流式细胞仪分析了P13K与F一肌动蛋白聚合之间的关系。图3．10表 明，用LY294002可以将E一选择素交联所引起的F一肌动蛋白聚合降低到本底水平，而 等体积的DMSO却不能对F一肌动蛋白的聚合产生影响。 这一结果表明，P13K参与了中性粒细胞内由E一选择素交联所引起的F一肌动蛋白 的重新分布和聚合，为P13K参与L一选择素和PSGL一1介导的中性粒细胞在E一选择素 上的滚动提供了可能。 42 东北师范大学博士学位论文 3．5 3 2．5 亨 2 一 篮1．5 l o．5 O 图3．10 P13K的活化参与中性粒细胞F_肌动蛋白的聚合 中性粒细胞与50 uM LY294002 ELY(+)]或等体积的DMs0[LY(一)]预孵育后，分别用 DREG56、KPLl单独交联或同时交联，或用E一选择素交联。固定、透化后用0．33 u M的FITC-鬼笔环肽染色流式细胞仪检测各个样品的平均荧光强度。按照图3．3的方 法计算RFI。No Ab：对照组，其RFI代表本底水平的卜肌动蛋白量。w6／32：非相 关抗体对照。 六、中性粒细胞在E一选择素上的滚动依赖于P l 3K 为了研究P13K与中性粒细胞滚动的关系，我们将中性粒细胞与浓度逐渐增大的 LY294002(5--75 u M)或与等体积的DMS0孵育后，在固定的E一选择素上滚动。结 果发现，与对照相比，P13K抑制剂的加入使中性粒细胞在E一选择素上的滚动受到抑制， 而且随着P13K抑制剂浓度的增大，这种抑制效果越来越明显：5 u M LY294002使中性 粒细胞在E一选择素的滚动降低了33％；当抑制剂的浓度增加到50 u M时，降低了44％； 当抑制剂浓度增大到75 u M时，滚动不再继续降低。这表明中性粒细胞在E一选择素 上的滚动依赖于P13K的活性。 120 100 _，、 暑薯、80 言皇 ∞g 60 要邑4 0 圣一 20 O LY294002(弘M) 43 东flttJ币范大学博士学位论文 图3．11 P13K参与中性粒细胞在E一选择素上的滚动 中性粒细胞分别与5 uM，50 uM，75 pM的LY294002，或者等体积的DMSO 冰上作用30 min。IIBSS洗涤后，用灌流液重悬并用于层流实验。按照图3．1的 方法统计结果并作图。 七、Syk／Zap70不参与中性粒细胞在E一选择素上滚动过程中P I 3K的活化 有文献表明在BCR信号通路中，P13K是Syk／Zap70的下游底物【248，2491。Syk和 Zap70是白细胞滚动和信号转导过程中的重要激酶n 7’2421。那么Syk／Zap70是否参与P13K 依赖的中性粒细胞在E一选择素上的滚动呢?我们用Syk／Zap 70的特异性抑制剂 piceatannol预先处理中性粒细胞来研究抑制剂对滚动的影响。图3．12显示，足够抑 制Syk／Zap70活性的抑SU齐fJ浓度无法抑制中性粒细胞在E一选择素上的滚动。表明 Syk／Zap70不参与这一滚动事件。这一结果与之前的报道一致n刀。 140 沈 120 ；弓100 巴苗8 0 ∞高 量岩6 0 基墓 星 o 岛 40 20 O O 5 lO 20 Piceatannol(pM) 图3．12 Syk参与中性粒细胞在E一选择素上的滚动 中性粒细胞分别与5 u M，10 Il M，20 Il M的piceatannol，或者等体积的DMS0冰 上作用30 min。HBSS洗涤后，用灌流液重悬并用于层流实验。按照图3．1的方法统 计结果并作图。 另有文献报道Syk和Zap70可以与p85相结合乜49|， 因此我们检测了Syk／Zap70 与p85的共沉淀情况。我们的结果表明，p85免疫沉淀复合物中没有Zap70(图3．13 A)。Syk虽然可以和p85存在于同一复合体，但二者是不依赖于E一选择素的刺激而组 成性结合的(图3．13 B)。这表明在中性粒细胞在E一选择素上的滚动过程中，Syk／Zap70 可能不是P13K的上游激酶。’ 东北师范大学博士学位论文 A wL rhB．Fc - IP：p85 IB：Zap70 + IB：p85 + 1．O 0．9 B 、)l，L rhE-Fc 一 IP：p85 IB：Syk + 1．0 O．9 IB：p85 + 1．O 1．O 图3．13 p85与ZapTO或Syk的免疫共沉淀 A：中性粒细胞rhE—Fc刺激5 min后裂解细胞，用p85抗体进行免疫沉淀， Western blotting检测免疫沉淀复合物中的Zap70； B：中性粒细胞rhE—Fc 刺激5 min后裂解细胞，用p85抗体进行免疫沉淀，Western blotting检测 免疫沉淀复合物中的Syk。p85为上样量的内参。用Image—Pro Plus 6．0对 各条带定量分析。 八、P13K参与了L一选择素和PSGL-1交联引起的lL-18基因的表达 1．L一选择素和PSGL-I抗体交联能够引起IL-18基因表达的上调 白细胞介素-18(IL-18)是近年新发现的一种前炎症因子，能够强烈诱导干扰素 一Y和其他炎症细胞因子如IL一1 B和肿瘤坏死因子一a及各种趋化因子的表达硷50嗡4|， 增强NK细胞的活性乜砜2511，活化Fas配体一介导的细胞毒性乜铂’2驯。因此被认为是一种重 要的免疫调节因子。我们首先检测了L一选择素和PSGL-I抗体交联是否能够引起IL-18 基因的表达变化。将IL一18的报告质粒(IL-18-1uc)瞬时转染到Jurkat细胞中。转 染后的细胞在孵箱中培养24小时后，用抗L一选择素和PSGL-I的抗体交联6小时。然 后收集细胞进行裂解，做荧光报告分析。从图3．14A我们可以看到L一选择素和PSGL一1 抗体交联能够引起IL-18-1uc表达水平的显著上调。 此外，我们提取了由L一选择素和PSGL-1抗体交联活化的Jurkat细胞的RNA进行 Realtime-PCR实验，结果如图3．14B所示，在受到L一选择素和PSGL—l抗体交联后， 内源的IL-18也能在很短的时间内升高。在L一选择素与其抗体交联60分钟的时候 IL-18的基因表达水平达到最高值，随着交联时间的增加，表达水平有所回落。 45 东北师范大学博士学位论文 A 3．5 3 2．5 0 2 o 盏1．5 l O．5 O B 3 2．5 2 O ·一 ；1·5 筮 l O．5 O 图3．14 L一选择素和PsGL-1抗体交联能够引起IL-18的表达上调 A：Jurkat细胞瞬时转染IL一18一luc，培养24小时后用适当抗体交联活化，6小时 后裂解细胞，测定并比较荧光素酶相对活性。转染时，每个样都要共转染 pREP7一Rluc质粒，其表达的renelia的量做内参。B：L一选择素和PSGL-1交联 Jurkat细胞一定时间后提取RNA，进行Real Time PCR分析。三次的实验结果以平 均值±标准差(mean±S．D)表示。 2．P13K参与了由L一选择素和PSGL一1交联引起的IL-18基因的表达 参与白细胞的活化的激酶有很多。我们的研究结果表明P13K参与了由L一选择素 和PSGL一1交联所引起的细胞骨架的变化。那么它是否也调控了L一选择素交联引起的 白细胞内的基因转录。为此我们将IL-18-1uc质粒和水解P13K激酶产物并对P13K信号 通路起负调控作用的PTEN表达质粒共转染Jurakt细胞，用抗L一选择素和PSGL一1的 抗体和阴性对照抗体处理转染后的细胞，收集细胞，进行裂解，做荧光素酶分析。结果 显示，在过表达PTEN时，L一选择素和PSGL-1抗体交联而引起的IL-18-1uc的表达上 调被抑制。然而，共转染空载质粒pCMV却不能抑制抗体交联对IL-18一luc表达的上调 (图3．15A)。在用抗体活化前，如果用P13K的特异性抑制剂LY294002处理细胞，内 源的IL一18基因的表达明显下降(图3．15 B)。这些结果说明P13K参与了由L一选择素 和PSGL—l抗体交联引起的IL一18基因的表达上调过程。 东北师范大学博士学位论文 3．5 3 2．5 ．2 2 p 盘1．5 l O．5 O 霸 2．S 2 o 1．5 ‘-■ ●J ∞ 自葺 1 O．5 O D冀 KP 图3．15 P13K参与了由L一选择素和PSG卜1抗体交联引起的IL-18的表达 A：Jurkat细胞瞬时共转染IL-18-1uc和pCMV或pCMV-PTEN，培养24小时后用抗体 处理活化，活化6小时后裂解细胞，测定并比较荧光素酶相对活性。B：L一选择素 和PSGL-1抗体交联Jurkat细胞之前用LY294002处理细胞，抗体活化细胞一定时间 后提取RNA，进行Real Time PCR分析。三次的实验结果以平均值±标准差(mean ±S．D)表示。 ’ 47 东北师范大学博士学位论文 讨 论 中性粒细胞向炎症部位募集是一个多步骤，多分子参与的过程。L一选择素和 PSGL一1是粘附分子家族的成员，组成性的表达在白细胞表面，对于白细胞粘附到血管内 皮表面起重要的作用。L一选择素和PSGL一1的定位很特殊，它们经过翻译后修饰都带有 多个N一连接或o-连接的sLex阿毛25r-2sg]。炎症过程中，内皮细胞既表达E一选择素也表达P 一选择素。虽然P一选择素和E一选择素都能够和sLex结合，但是，E一选择素对sLex的 亲和力更强，是P一选择素的10倍晗驯。因此我们主要在体外条件下研究了中性粒细胞在 E一选择素上的滚动。我们的结果表明用L一选择素或者PSGL-I的抗体分别封闭中性粒细 胞能够抑制白细胞的在E一选择素上的滚动。同时封闭上述两种粘附分子，抑制作用更 加明显，但是滚动没有完全消失。当加入EGTA螯合掉金属离子后，滚动才被彻底抑制。 这表明E一选择素除了以L一选择素矛DPSGL一1为配体外，还可以结合中性粒细胞上的其它 配体。有文献报道，小鼠的中性粒细胞上表达ESL(E一选择素配体)。但是目前为止人 的中性粒细胞上还没有被发现表达ESL。这提示我们人类中性粒细胞表面很可能表达一 些与ESL一1类似的蛋白，从而使L一选择素和PSGL-I的作用被封闭后，中性粒细胞在E一 选择素上仍保留了低水平的滚动。 白细胞在血管内皮细胞上的滚动常常伴随着白细胞形态的变化，这种变化过程集中 反映为细胞骨架的变化。有文献报道L一选择素或者PSGL-I与抗体的结合能够引起F一肌 动蛋白的聚合从而引起细胞骨架的变化瞄’12"。但是白细胞在内皮细胞上滚动过程中L一 选择素或者PSGL—l与内皮上表达的配体结合是否会产生新的细胞骨架还没有人研究过， 新生成的细胞骨架对于维持中性粒细胞在内皮细胞上的滚动也不得而知。因此，我们的 在体外条件下研究了中性粒细胞在E一选择素的作用下是否会发生肌动蛋白的变化。我 们的研究发现，E一选择素可以与L一选择素和PSGL一1结合而引起F一肌动蛋白的聚合和重 新分布。由于Latrunculin B可以结合单体一肌动蛋白，从而抑制单体一肌动蛋白向F一肌 动蛋白聚合。因此，我们用不同浓度的Latrunculin B处理中性粒细胞后在E一选择素上 滚动，结果发现中性粒细胞在E一选择素上滚动时新生成的F一肌动蛋白对于维持中性粒 细胞的滚动非常必要。 有关细胞骨架调控的方式已有大量的研究。然而多数研究都将注意力放在了细胞骨 架相关蛋白如cofilin、L-plastin和ERM蛋白等。事实上，细胞骨架的变化是细胞对外 界刺激进行应答的一个重要环节，这一过程中细胞内的激酶在胞内信号传递途中扮演了 重要角色。研究这些激酶在细胞骨架调节过程中的作用应该引起人们的关注。实验室前 期的研究表明，细胞内的c—Abl激酶在L一选择素和PSGL一1与抗体结合所引起的细胞骨架 改变过程中发挥重要作用口“22|。本文通过研究证明了除C—Abl外的另一条信号通路-P13K 信号通 和PSGL一1后，没有检测到c以bl和P13K调节亚基p85的免疫共沉淀(材料未给出)。可能 的解释是c—Abl对于P13K的活化没有贡献嘲1，也可能是C—AbI和P13K信号通路在调控细 胞骨架时是平行地的起作用，二者的作用既不依赖于同一复合体，也不存在上下游的关 系。此外，许多胞内激酶的酪氨酸磷酸化并向膜募集对于细胞信号的起始和扩大非常重 要妇6¨。我们检测了L一选择素和PSGL-1受到交联后，中性粒细胞细胞膜的酪氨酸磷酸化 情况，发现了p85的酪氨酸磷酸化和向膜募集，从而从一个侧面证明TPl3K在E一选择素 和L一选择素／PSGL-l作用后被活化。进一步的实验表明，E一选择素交联L一选择素和 PSGL一1后能够使P13K的下游激酶Vavl发生酪氨酸磷酸化进而活化Vavl，并且Vavl的活化 依赖于P13K的活化。由于大量的研究表明Vavl是细胞骨架的关键调控因子，它可以通过 Racl$1Cdc42将胞外信号转换为细胞骨架的变化。因此我们在中性粒细胞中找到了一条 由P13K和Vavl参与的调控细胞骨架的信号通路。 基于P13K参与骨架改变和细胞骨架对于中性粒细胞滚动很必要这两个结论，我们推 澳IPl3K可能对于中性粒细胞在E一选择素上的滚动有重要作用。同时，我们的实验结果 也表明P13K的活性对于中性粒细胞在E一选择素．h的滚动是非常必要的，从而证明我们 的推测是正确的。因此，在炎症过程中，表达在活化的内皮细胞表面的E一选择素能够 与中性粒细胞微绒毛上的L一选择素年IPSGL-1结合而导致中性粒细胞内F一肌动蛋白的聚 合和重新分布，从而进一步维持已经建立的中性粒细胞在内皮细胞上的滚动。 我们也试图找到活化P13K的上游激酶。我们的结果表明调控P13K激酶活性的经典的 上游激酶Syk家族激酶，既不参与中性粒细胞在E一选择素上的滚动也不能够与p85以E 一选择素刺激依赖的方式发生免疫共沉淀。表明其它蛋白激酶参与了P13K的活化。正如 在图3．4C中看到的那样，一种25kDa的蛋白在p85的磷酸化之前发生了磷酸化，很有可能 这种蛋白激酶在活化后参与了P13K的活化。图3．4A中的其它蛋白(如p60)在E一选择素交 联一定时间后也发生了酪氨酸磷酸化。但是这种蛋白的磷酸化发生在p85的磷酸化之后。 因此它可能不是P13K的上游激酶，但是这些假没还有待于进一步证实。 在我们的研究中，L一选择素$1PSGL-1这两种在细胞中位置相同但结构不同的分子 都能够通过调控细胞骨架来调节中性粒细胞在E一选择素上的滚动，说明这两种粘附分 子在发挥生理功能时存在某些共同的调节机制。同时，我们的研究表明P13K在中性粒细 胞受到E一选择素交联时被活化，而且P13K的活化伴随着F一肌动蛋白的聚合和重新分 布。因此，我们猜澳tPl3K是位于L一选择素平IPSGL-1下游的调控因子，通过P13K的作用 整合L一选择素和PSGL-1接收的来自E一选择素的信号，从而引起形似的生理现象：F一肌 动蛋白的变化，进一步保证中性粒细胞在E一选择素上的滚动。 L一选择素和PSGL-1除了可以作为粘附分子，参与炎症过程中自细胞在内皮细胞上 的滚动外，还可以引起一些炎症相关基因的表达。有文献表明，L一选择素和PSGL一1 在受到抗体交联后，都可以引起CSF-1基因的表达n32’2421。在本文的研究中我们选择了 IL—18为靶基因，进一步应证了L一选择素和PSGL-1在基因表达过程中的重要作用。 IL-18最初也称为干扰素一Y一诱导因子，是一种新的前炎症因子。由于它能够诱导 49 东北师范大学博士学位论文 T细胞和NK细胞产生干扰素一Y，因此在Thl反应中起重要作用心621。IL—18和IL—l B在 结构和功能方面及其相似。在合成后是一种没有生物活性的前体，经过caspases—I／ICE 加工后成为成熟的IL一18。在许多炎症条件下抑制caspase—l可以起到保护IL—18的作 用啪3七6别。亦有大量实验证明，IL-18可以和其相应的受体结合而引发TNF、IL一1以及 某些趋化因子的基因表达和合成乜6引。此外，在T细胞受到GM—CSF的刺激后会和IL-18 一起参与T细胞的有丝分裂，增强Fas引起的NK细胞和CTL细胞的细胞毒性，增强肿 瘤细胞的免疫原性，抑制B细胞的功能。因此，IL-18在炎症的相关研究中受到了人们 的广泛关注。尽管有关IL—18功能的研究越来越多，但有关IL一18表达的研究却很少。 本文的研究表明Jurkat细胞内IL—1．8基因的表达受到L一选择素和PSGL—l抗体交联的 影响，并进一步证明P13K参与了这一过程。这为L一选择素和PSGL—l以P13K为信号 整合点调控基因表达提供了证据，但具体的分子机制还有待于进一步探讨。 总之，我们的实验结果可以用下图示来概括：当L一选择素和PsGL_1受到E一选择 素或者抗体刺激时能够活化P13K。活化的P13K可以作为L一选择素和PSGL一1信号通路 的关键整合点发挥作用。一方面，P13K可以通过Vavl的作用调控F一肌动蛋白的标化， 并进一步维持中性粒细胞在E一选择素上的滚动；另一方面，P13K可以在其它激酶的参 与下调控IL-18基因的转录。 。未知激酶 卜一 移 钞 ●r ◆ 中性粒细胞滚动 IL-18转录 图4．1 P13K的在L一选择素和PSGL-I信号通路中的信号整合作用 本论文通过体外层流实 验方法，研究了P13K在L一选择素和PSGL一1信号通路中的作用。主要取得以下的发现 和进展： 1．F一肌动蛋白的变化对于中性粒细胞在E一选择素上的滚动非常重要。L一选择素和 PSGL-1信号通路能够通过调控卜肌动蛋白的聚合和重新分布来维持中性粒细胞在E 一选择素上的滚动。 2．P13K可以作为L一选择素和PSGL-1信号通路的关键整合点之一，通过其激酶活性来调 控细胞骨架，进而参与白细胞在内皮细胞上的滚动。 3．L一选择素和PSGL-1还能够影响基因的表达，我们选择IL-18基因为靶基因，证明了L 一选择素和PSGL-1信号通路都能够增强IL一18基因的表达。 4．P13K的激酶活性也参与了IL-18基因的表达调控，进一步为P13K作为L一选择素和 PSGL-1信号通路的整合点提供了的证据。 东北师范大学博士学位论文 主要创新点 1．L一选择素和PSGL．1是参与白细胞起始粘附的两种重要的粘附分子。许多研究表明， 二者的生理作用存在补偿效应。我们的结果揭示了L一选择素和PSGL．1信号通路可以 通过P13K整合两条信号通路，进而引起相似的生理现象。 2．L一选择素和PSGL-1除了作为粘附分子起作用外，还能引起一些炎症相关基因的表 达。我们的实验表明L一选择素和PSGL-1信号通路都参与了IL．18基因的表达，为L一 选择素和PSGL-1作为信号受体参与白细胞活化提供了实验证据。 3．P13K作为一种重要的细胞骨架调控蛋白在许多依赖于细胞骨架变化的生理过程中起 作用。我们将P13K引入到L一选择素和PSGL．1的信号通路中来，证明P13K可以通过 影响细胞骨架来调控中性粒细胞的滚动；在此基础上，我们研究了P13K与IL．18基因 表达的关系，进一步证明P13K可以作为L一选择素和PSGL-1的信号整合点起作用。 52 东北师范大学博士学位论文 参考文献 [1]Butcher E 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衷心感谢赵可吉博士(NIH，Maryland)惠赠表达水母荧光素酶的质粒pREP7一Rluc。 衷心感谢Maria Georgescu博士(The Rockefeller University)惠赠PTEN表达质 粒。 衷心感谢长春市中心血站的陈琳老师和东北师范大学医务室检验科的工作人员在 样品提供方面给予的大力协作。 衷心感谢本实验室徐廷双、佟海滨、张觉超、李春风、翟雷、王瑞飞、张春梅、齐 天阳、焦阳等同学在我实验过程中给予的关心、支持和帮助! ’ 向所有关心和帮助我的老师和同学致以最诚挚的谢意! 最后，我还要特别感谢我的家人在这五年里给予我的关心、鼓励、理解和支持1 70 再 东北师范大学博士学位论文 在学期间公开发表论文及著作情况 第几 文章名称 发表刊物(出版社) 刊发时间 刊物级别 作者 P13K is involved in L．selectin． and PSGL．1 Journal of CeUular mediated neu仃opllil rolling on 2010年 SCI 1 E．．selectin via F．．actin Biochemistry redistribution and assembly． c-Abl Kinase is required for Journal of 13-2 integrin-medaited 2009年 SCI 6 Immunology neutrophil adhesion． Critical role of Lck in Joumal of L-selectin signaling induced 2008年 SCI 5 Leukocyte Biology by sulfatides engagement． L··selectin ligation--induced CSF-1 genetranscription is Human 2008年 SCI 5 regulated by AP一1 in a c-Abl Immunology kinase—dependent manner． c-Abl is required for the European Journal of signaling 仃ansducfion 2007年 SCI 5 induced by L-selectin ligation． Immunology 71 4'an--F.Aa.--，也吨lb ' t'-"R41tl--. 辑 ，、 ." 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