酶学与酶工程

酶学与酶工程 第一章 酶学与酶工程 第一节 酶的基本知识 有人估计: E.coli约有3000种蛋白质，高等真核生物约有5000种以上蛋白质， 其中绝大部分是酶，但真正认识的只是极少数，刚开始酶极少，一二个不用命名，编号，都可以认识，也不会混淆。 酶一多，会产生一酶多名，或一名多酶，则会引起混淆。 1961年国际酶学委员会提出了给酶进行命名和分类。 1961年， ,712种， 1964年，,870种， 1972年， , 1770种， 1975年，,1974种， 1978年， ,2120种， 1984年，,2470种， 1990年, ,3000种， 1992年，,3200种， 1997年，,3700种， 一、酶的命名 1961年国际酶学委员会(Enzyme Committee, EC)根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类: 各大类再分亚类，亚亚类 酶的命名有两种方法:系统名、惯用名。 系统名:包括所有底物的名称和反应类型。 乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸:NAD+氧化还原酶 乳酸脱氢酶 乳酸:NAD+氧化还原酶 惯用名:只取一个较重要的底物名称和反应类型。 对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。 系统命名特点: 1. 达确切 2. 太繁，使用不便 单底物:底物 + 反应类型 + 酶 D-氨基酸 + 氧化还原 + 酶---?D-氨基酸氧化酶 双底物:底物:底物 + 反应类型 + 酶 ++ 醇+NAD+氧化还原+酶---?醇:NAD氧化还原酶 习惯命名特点: 1.非常简便 2.不精确，容易产生误会， 但人们还是喜欢用 1)以底物命名( 淀粉酶，蛋白酶) 2)以反应性质命名( 转氨酶，脱氨酶) 3)结合以上两者(乳酸脱氢酶 ) 4)或再加酶的来源或性质特点(胰蛋白酶;碱性磷酸酯酶) 提示:习惯命名使用中要注意混淆;如激酶，往往指磷酸基团转移的一类 酶，水解酶也叫激酶，但无磷酸基团转移(链激酶，尿激酶) 用四个数字(标码)标记每一种酶 EC-----Enzyme Commision EC 1.1.1.1 醇脱氢酶 + +第一大类， 作用CHOH， 以 NAD，NADP为受体 编号 酶委员会建议，发表时，论有关的主要酶在第一次提到时写出 它的标码系统名称、习惯命名和来源，然后再用系统命名和习惯命名叙述。 二、酶的分类 1(氧化还原酶 2(转移酶 3(水解酶 4(裂合酶 5(异构酶 6(连接酶(合成酶) 7(核酸酶(催化核酸) 酶用于生物催化的概况 核酸类酶(R酶)的分类 1982年以来，被发现的核酸类酶越来越多，对它的研究越来越广泛和深入。 但对于分类和命名还没有统一的原则和规定。 * 根据酶催化反应的类型，可将R酶分为剪切酶，剪接酶和多功能酶等三类。 * 根据R酶的结构特点不同，可分为锤头型R酶，发夹型R酶等。 * 根据酶催化的底物是其本身RNA分子还是其它分子，可以将R酶分为分 子内催化(in cis)和分子间催化(in trans)两类。 其他习惯归类命名: 1、单体酶 2、寡聚酶 3、多酶复合体 4、同工酶 5、诱导酶 单体酶:一条多肽链，分子量13,000—35,000，不能再解离成更小单位，不 需辅助因子，如一些水解酶，往往以无活性状态合成，需要时水解去除部 分成活性酶。 寡聚酶(多数为寡聚酶):具相同或不同亚单位组成，以多条肽链组成，一般 2-4个亚单位组成，分子量35,000以上，往往是代谢中的关键酶，如乳酸脱 氢酶。 多酶复合体:几个酶镶嵌而成的复合物，这些酶催化将底物转化为产物的 一系列顺序反应。集不同催化活性于一身。 1)调节功能，在不同条件时，催化功能不同 2)催化多个连续反应的酶活性于一身 + 丙酮酸+CoA+NAD===乙酰CoA+CO+NADH2 丙酮酸脱氢酶 具三种酶活性，有60多条肽链组成，分子量?4,600,000 丙酮酸脱氢酶系(E.coli):丙酮酸脱氢酶(E?)、硫辛酰转乙酰酶(E?)和二氢硫辛酰脱氢酶(E?)。 同工酶:存在于生物的同一种属或者同一个体的不同组织，甚至同一组织或者同一细胞催化相同反应，但结构、理化性质、催化特性有所不同的一类酶。 诱导酶:当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。 三、酶的组成和结构特点 1、酶的化学性质 1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。 接触残基:R1、R2、R6、R8、R9、R163 1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA-ribozyme，以后Altman和Pace等又辅助残基:R3、R4、R5、R164、R165 陆续发现了真正的RNA催化剂。 结构残基:R10、R162、R169 核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问非贡献残基:其它 题的进一步探讨。 2、酶的组成 单纯酶 酶 结合酶 (全酶)= 酶蛋白 + 辅因子 辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 辅因子 辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属离子作为辅助因子。 金属激活剂 酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。 3、活性部位和必需基团 必需基团:这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。 活性部位:酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位 结合基团 专一性 活性部位 催化基团 必需基团 催化性质 维持酶的空间结构 酶活性中心的特点 a. 酶的活性中心只有几个氨基酸组成，多为极性氨基酸。 b. 酶的活性中心是一个三维实体结构，活性中心的几个氨基酸残基在一级 结构上可能相距很远，甚至位于不同肽链上，通过肽链的盘绕折叠而在空 间结构上相互靠近，形成一个能与底物结合并催化底物形成产物的位于酶 蛋白分子表面的特化的空间区域。 c. 酶的活性中心与底物的结合通过次级键。 d. 酶的活性中心具有柔性，可与底物诱导契合发生相互作用。 e. 酶的活性中心位于酶分子表面的‖空穴―中，为非极性环境。 四、酶的作用原理及酶活性调节 (一)、酶的专一性及活性部位 中间产物学说的内容:酶与底物先结合成一个中间产物，然后中间产物分 解成产物和游离的酶。 E+S ES E+P 发展的中间产物学说:酶先与底物结合成酶-底物复合物(ES)，然后转变成 *过渡态(ES)，再形成酶-产物复合物(EP)，最后分解释放出酶，并生成产物。 * E+S ES ES EP E+P 中间产物学说的证据: * 电子显微镜观察到了核酸聚合酶与核酸结合而成的复合物; * 根据酶和底物反应前后的光谱变化，可证明中间产物的存在; * D-氨基酸氧化酶与D-氨基酸结合而成的复合物已被分离、结晶出来。 1890年，Emil Fischer提出―锁钥学说‖ :底物的结构和酶活性部位的结构 非常吻合，就象锁和钥匙一样，这样它们就能紧密结合形成中间产物。 1958年，Koshland提出―诱导契合学说‖:酶活性部位的结构与底物的结构 底物(S) 酶(E) 并不特别吻合，但活性部位具有一定的柔性，当底物与酶接近时，可以诱 导酶活性中心的构象发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象 。 (二)、降低反应活化能 反应活化能:酶降低活化能的方式(形成E?S，经历与一般反应不同的途径)如过氧化氢分解，无催化剂时的活化能为75.31KJ/mol，胶态铂催化为46.02KJ/mol，而过氧化氢酶催化为20.92KJ/mol。活化能的降低提高了酶的催化效率。 (三)、 影响酶高催化效率(降低活化能)的有关因素: 1. 邻近与定向:底物有聚集在活性中心的趋势，经实验证明活性中心的底物浓度是溶液中其他部位的6000倍;底物与活性中心是定向结合。 邻近与定向的结果:使酶活性部位的底物浓度大大提高。 2. 底物敏感键扭曲变形:这种效应是说底物与酶结合以后，其电子云要发生重排，产生电子张力，使敏感键更加敏感，更易反应。 3. 酸碱催化: 狭义酸碱:酸 —— H+ 碱 —— OH, 广义酸碱:酸 — 能释放质子的化合物 碱 — 能接受质子的化合物 在这些基团中，咪唑基是最重要的酸碱催化基团，这是因为它在pH时的酸碱强度大，因为其pKa为6.0，即在生理条件下，一半为酸，一半为碱，第二是释放质子的速度 -10快，其质子结合的半衰期只有10秒。 4. 共价催化:是指酶在催化过程中，酶与底物形成共价中间复合体的催化方式。 如酯酶催化酯的水解就是如此。 酶分子上可以形成这种复合体的基团有两类，即亲核基团和亲电基团。 亲核基团有组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的硫氢基、丝氨酸的羟基，另外还有一些辅助因子， 如TPP、CoA等。 亲电基团有金属离子、—NH3+等 底物中的亲电基团包括磷酰基、酰基和糖基。 5. 疏水微环境:酶在催化过程中，其活性中心为疏水环境，在这种环境中，电荷之间的作用力远远大于高电介环境，大大加强了酶的催化基团与底物分子间的作用力，因而有利于降低反应活化能。有机物的电介常数为7-10，而水的电介常数为80。 影响酶的催化作用: a. 广义的酸碱催化 b. 共价催化 c. 邻近效应及定向效应 d. 变形或张力 e. 酶的活性中心为疏水区域 酶催化反应机理举例 溶菌酶(E .C. 3. 2. 1. 17. Lysozyme) 结构特性:129个氨基酸， Mr 14.6 kD, 四对-S-S-键 活性中心: Glu35 和 Asp52 水解功能: 催化某些细菌细胞壁多糖的水解。 N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和N – 乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)组成的共聚物-----是细菌细胞壁的主要成分。 生物体内的存在:鸡蛋清和动物的眼泪中 专一性专门水解NAMc1和NAG c4之间的 β -1,4 糖苷键(A-B-C-D-E-F) 最适底物: NAG 和NAM交替的6糖。 催化机理:广义酸碱催化，糖从稳定的椅式结构变成不稳定的半椅式结构 2. 胰凝乳蛋白酶(E.C. 3. 4 .4. 5 , chymotrypsin) 结构特性:241个氨基酸，三条多肽链， Mr 25 kD， 分子间二对-S-S-键，分子内二对二硫键。 活性中心: Ser 195, His57, Asp102 水解功能: 水解肽键断裂。 专一性: 对芳香性和较大疏水基团氨基酸有专一性水解。 催化机理:靠三个氨基酸Ser 195，His57， Asp102之间构成的电荷传递体系(催化三联体)，起到酸碱催化和亲和催化，使肽键断裂。 第二节 酶作为催化剂的显著特点 催化剂(catalyst):是一类能改变反应速度，但不能改变反应的性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后不发生变化的外在因素。 酶与一般的化学催化剂的区别 820* 更高的催化效率 酶催化的反应速率是相应的无催化反应速率的10,10倍，并且至少高出非酶催化反应速率几个数量级。 * 更高的反应专一性 酶分子特定的空间结构决定了其特定的底物专一性。 * 温和的反应条件 一般的化学催化往往需要高温、高压和极端的pH条件。 * 具有调节能力 许多酶的催化活性可受到多种调节机制的灵活调节，如别构调节、酶的共价修饰调节、酶合成与降解的调节。 * 酶的本质是蛋白质 易变性和降解。 酶作为催化剂的显著特点 * (1)专一性强 (2)效率高、条件温和 (3)调节性 绝对专一性:一种酶只催化特定的底物发生反应，如:脲酶只催化尿素分解: 相对专一性:基团专一性即酶对反应键一端的基团有绝对要求，而对另一端的基团则无特殊要求， 如葡萄糖苷酶，可以催化水解糖苷键，并且要求键的一端为葡萄 H2N—CO—NH2 + H2O = 2NH3 + 糖，而另一端可以是任意糖。 CO2 键专一性:酶对反应键两端的基团都没有特殊要求，如酯酶只要是酯键就可水解。 立体专一性:顺反异构专一性，如琥珀酸脱氢酶只催化产生反式结构的丁烯二酸即延胡索酸。 旋光异构专一性:L-氨基酸氧化酶只催化L-氨基酸氧化，而对D-氨基酸无作用。 催化效率 催化转换数:每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。 3-17-1 一般为10min，碳酸酐酶最高为3.6* 10min 713有酶加入比无酶参加反应速度一般要高10-10 酶为何有如此惊人的催化能力呢, 酶可极大地降低反应所需的活化能 条件温和 :常温、常压、pH近乎中性 调节性 正常情况下生物体并不要求每个酶处于最有效的催化状态，而是要求有快有慢。 在长期的进化、选择过程中，生物体为适应外界环境变化，满足生理功能的需要， 形成了一整套调节机制。(酶合成水平上的调节和酶结构活性水平上的调节) 多种调节方式: 浓度调节(合成降解调节); 生理调节(激素调节); 反馈调节(别构调节); 共价修饰调节(可逆，不可逆); 寡聚酶的聚合、解聚调节; 存在方式调节(多酶体系); 抑制剂调节; 1、别构调节和别构酶: 别构效应:调节因子与别构酶调节中心结合后，使酶分子的构象得到稳定或发生变化，从而使酶的活性得到稳定或发生变化，这种效应叫别构效应。 已知别构酶的结构特点: ? 有多个亚基、有四级结构; ? 除了有可以结合底物的酶的活性中心之外，还有可以结合调节物的别构 中心，而且，这两个中心位于酶蛋白的不同部位上，或处在不同的亚基上 (如ATCase)，或处在同一个亚基的不同部位上。 调节物:底物—同促效应 其它分子—异促效应 多数别构酶具同异促效应 协同效应:底物与一个亚基结合后，会影响后续亚基对底物亲和力的现象。 正协同效应:底物与一个亚基结合后，会增加后续亚基对底物的亲和力， 即酶对底物的亲和力是迅速增加的。 负协同效应:底物与一个亚基结合后，会减小后续亚基对底物的亲和力， 即酶对底物的亲和力是迅速减小的。 别构调节动力学 大部分变构酶的初速度-底物浓度的关系不符合典型的米氏方程，即不是 简单的双曲线，而是呈S型的v-[S]曲线。 S S S S S S S S S S S 变构酶作用特点: S S S 1、正协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线呈S形，如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶(ATCase)对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应。 亚基全部亚基全部2、负协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线为类似双曲线。如3-磷酸甘油醛脱氢依次序变化 处于T型 处于R型 酶对NAD+的结合为负协同效应。 别构酶性质(动力学性质) 生理意义:这种S型的反应体现为当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度的控制着反应速度，这就是别构酶可以灵敏地调节酶反应速度的原因所在，即正协同效应使得酶的反应速度对底物浓度的变化极为敏感。 另有一类具有负协同效应的酶，在这种曲线中，在底物浓度较低的范围内酶活力上升很快，但继续下去，底物浓度虽有较大提高，但反应速度升高却较小，也就是说负协同效应可以使酶的反应速度对外界环境中底物浓度的变化不敏感。 变构调节的机制: * 变构酶一般是多亚基构成的聚合体，一些亚基为催化亚基，另一些亚基为调节亚基。 * 当调节亚基或调节部位与变构剂结合后，就可导致酶的空间构象发生改变，从而导致酶的催化活性中心的构象发生改变而致酶活性的改变。 别构酶调节的两种模型: 齐变模型(MWC): 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。 序变模型(KNW):1966年由Koshland、Nemethy和Filmer 提出。 T状态(对称亚基) S S S S S S S S S S S S S S R状态(对称亚基) 对称亚基 对称亚基 齐步变化 ATCase的三维结构 典型的别构酶---天冬氨酸转氨甲酰酶 ATCase，同时具有同促和异促效应 12条亚基组成: 6条催化亚基，6条调节亚基 酶结合构象:每3个催化亚基形成2个二聚体;每2个调节亚基形成3个而聚体。 产物:CTP 激活剂:ATP 抑制剂:CTP 2、酶原激活 概念:在酶的催化下，无活性的酶的前体(酶原)转变为有活性酶的过程。如:胰蛋白酶原的激活过程。 激活机理:在酶的催化下，切去酶原多余的肽段，使之成为有活性的酶 原因:形成酶的活性中心 生物学意义:保护产生酶原的组织，是生物自我保护的一种方法;也是酶活性的一种调节方式。 消化系统其它蛋白水解酶原的激活 * 胃蛋白酶原 + 由胃壁细胞分泌出来，在胃酸H作用下，低于pH5时，酶原自动激活，失去44个氨基酸残基，转变为高度酸性的，有活性的胃蛋白酶 。 * 胰蛋白酶原 2+ 进入小肠后，在有Ca的环境中受到肠激酶的激活，赖氨酸-异亮氨酸之 间的肽键被打断，水解失去一个6肽，使构象发生一定变化后，成为有活性 的胰蛋白酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用。 胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用 3、共价修饰调节 酶分子在别的酶的催化下共价结合或脱去一个基团，使酶分子的活性产生或者丧 失，这种调节方式叫共价修饰调节，这种酶叫共价修饰调节酶。 第一种类型是磷酸化酶及其他的一些酶，它们通过接受ATP转来的磷酸基的共价修饰，或脱下磷酸基，来调节酶活性: 酶的无活性形式 酶的有活性形式 如:糖原磷酸化酶催化的反应为: 糖原 + Pi G—1—P 第二种类型是大肠杆菌谷氨酰胺合成酶及其他一些酶，它们受ATP转来的酰苷酰基 谷氨酸 + ATP + NH3 谷氨酰胺 + ADP + Pi 的共价修饰，或酶促脱酰苷酰基，而调节酶活性: 酶的活性较高形式 酶的活性较低形式 如:大肠杆菌谷氨酰胺合成酶，它催化的反应为: 真核生物的共价修饰方式主要是磷酸化/脱磷酸化，修饰以后有的酶为活性状态，而有的酶为无活性状态。糖原磷酸化酶是磷酸化后有活性，丙酮酸脱羧酶是脱磷酸化有活性。 原核生物的共价修饰方式主要为腺苷化/脱腺苷化。 4、同工酶 概念:催化反应相同，结构性质不同的一类酶 如:过氧化物酶催化的反应，该酶是一组数目较多的同工酶 AH2 + H2O2 ——? A + 2H2O 产生原因:不同的基因产生不同的肽，如酶是单体酶，则每个肽就是一个同工酶，或者酶是多亚基的，不同亚基相互组合，就形成了不同的同工酶，如:乳酸脱氢酶，由两个基因(H、M)指导合成，则有H、M两种亚基，他们之间相互组合，就会出现五种同工酶。 5、通过聚合(结合)解离进行的调节 寡聚酶聚合(结合)解离对酶活性的调节作用 例如:(乙酰CoA羧化酶) 第三节 酶活力的测定 定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，提取物无淀粉酶活力;反之，提取物有淀粉酶 的活力。 酶活力的测定:实际上是酶定量测定的方法，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。 (一)酶活力的概念: 指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。 速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。 (二)酶的活力单位: 酶的国际单位(IU)规定为:在最适反应条件(温度25?)下，每分钟内催化1微摩尔(μmol)底物转化为产物所需的酶量(或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量)称为1单位。 测定条件:最佳的反应条件，如最适的T(或25?)、最适pH、[S] >> [E]、初速度下。 Katal(Kat):在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化的酶量定义为 1 Kat。 61 Kat=60×10 IU (三)酶的比活力: 每单位酶蛋白所含的活力单位数。 对固体酶:用活力单位/mg酶蛋白或活力单位/mg酶蛋白氮来表示; 对液体酶:用活力单位/ml酶液来表示。 很明显，比活力越大，酶越纯。 (四)、回收率和纯化倍数 每次总活力 每次比活力 回收率, 第一次总活力 ×100, 纯化倍数, 第一次比活力 酶的回收率和纯化倍数的测定常在酶分离过程中的每个环节中进行。一个正常、合理的纯化程序，随着纯化的进行，总蛋白量逐渐减少，比活力不断增加，纯化倍数提高了，但回收率降低。 (五)酶活力的测定方法 1、分光光度法:产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采 用此法。 2、测压法:产物中有气体，测气压增加量。 3、滴定法:产物中有酸生成，用碱滴定。 4、荧光法:产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂，反应生成荧光产物可用此法。 5、旋光法:产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。 酶活力测定的注意事项: 测定的酶反应速度必须是初速度。 底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度。 反应必须在酶的最适条件下进行。 第四节 酶促反应动力学 酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶反应速度的各种因 素的科学。 意义:1)研究酶的结构与功能的关系及作用机制。 2)发挥酶催化反应的高效率，寻找最有利的反应条件。 3)了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制。 酶的动力学研究包括哪些内容 ? 酶促反应动力学以化学动力学为基础，通过对酶促反应速度的测定来 讨论诸如底物浓度、抑制剂、温度、pH和激活剂等因素对酶促反应速度的 影响。 温度、pH及激活剂都会对酶促反应速度产生十分重要的影响，酶促反应不但需 要最适温度和最适pH，还要选择合适的激活剂。而且在研究酶促反应速度以及测定 酶的活力时，都应选择相关酶的最适反应条件。 酶催化反应速度 如果我们以产物生成量(或底物 减少量)来对反应时间作图，便 可得到如图所示的曲线图。 影响酶催化的各种因素: 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。 引起酶促反应速度随反应时间延长而降低的原因很多，因此在测定酶活力时， 应测定酶促反应的初速度，从而避免各种复杂因素对反应速度的影响。 一、底物浓度对反应速度的影响 中间络合物学说(E+S=ES=E+P) 在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖实验研究化学反应中底物浓度与反应速度的关系时发现，当酶浓度不变时，可以测出一系列不同底物浓度下的化学反应速度，以该反应速度对底物浓度作图，可得到如图所示的曲线。 酶促反应动力学方程式---米氏方程 米式方程的导出: Vmax[S] 首先假设:1. 反应在最适条件下进行;2. pH、温度和酶的浓度是固定的，V, ( Km，[S]) 变化的是底物浓度;3. 反应在起始阶段，逆反应可忽略 ;4. 反应体系处 在稳态。 米氏常数的意义 1)物理意义: Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 2)Km 值愈大，酶与底物的亲和力愈小;Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。如己 -4糖激酶的两个底物Km分别是葡萄糖1.5×10， -3果糖: 1.5×10，这样葡萄糖为该酶的最适底物。 (3)Km 值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km 值也不同。各种酶的 Km 值范围很广，大致在 -1-610,10 M 之间。 Km在实际应用中的重要意义 (1)鉴定酶:通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。 (2)判断酶的最佳底物:如果一种酶可作用于多个底物，就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L)，也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L)，两者相比，蔗糖为该酶的天然底物。 (3)计算一定速度下的底物浓度:如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则[S]=99Km (4)了解酶的底物在体内具有的浓度水平:一般地，体内酶的天然底物的[S]体内?Km，如果[S]体内<< Km，那么V<< Vmax，细胞中的酶处于―浪费‖状态;反之，[S]体内 >> Km，那么V?Vmax，底物浓度失去生理意义，也不符合实际状态。 v 5)判断反应方向或趋势:催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。 (6)通过测定某些物质对Km的影响判断这些物质可能的生理效应: [E] Km升高，竞争性抑制;Km不变，非竞争性抑制;Km降低，反竞争性抑制; 米氏常数的求法:双倒数作图法 二、酶浓度对酶促反应速度的影响: [ E ]与 v 成正比 在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大于100 Km时，速度与酶的浓度呈正比。 三、温度对酶促反应速度的影响 最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。 温度对酶促反应速度的影响机理: 1. 温度影响反应体系中的活化分子数:温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。2. 温度影响酶的活性:过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。 四、pH对酶促反应速度的影响 pH对酶促反应速度的影响机理: 1、pH影响酶和底物的解离: 酶的活性基团的解离受pH影响，底物有的也能解离，其解离状态也受pH的影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力，此pH称为酶的最适pH;当反应pH偏离最适pH时，酶促反应速度显著下降。 2、pH影响酶分子的构象:过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象，或引起酶的变性失活。 五、激活剂对酶促反应速度的影响 1. 概念:凡能提高酶活性的物质为激活剂 2.种类 (1)无机离子 作用机理: a. 稳定构象，如Ca是 —淀粉酶的激活剂，它紧密地与酶分子结合，从而稳定了酶的高活力构象。b. 结合底物，如Mg是ATP酶的激活剂，它可以将ATP的磷酸链结合于酶分子。c. 调节作用 (2) 有机分子 作用机理: a.保护作用，如谷胱甘肽可以-SH的还原状态， EDTA可以络合重金属离子。2GSH + —S—S— ——?GS—SG + 2—SH b. 调节作用，如ADP是多种需能、放能反应中酶的调节剂 (3) 蛋白分子 调节分子 六、抑制剂对酶促反应速度的影响 可以降低酶活性的物质称为抑制剂 第五节 酶的抑制作用 一 、降低酶催化反应速度的因素 1、失活作用 失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维 结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。 2、抑制作用 抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性 质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。 3、去激活作用 去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也 会引起这些酶活性的降低或丧失。 4、阻遏作用 阻遏作用指某些因素(如激素或药物等)使细胞内酶蛋白的合成减少， 反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化。 二、抑制程度的表示 一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制剂时的反应速度为 Vo， 加入抑制剂后的反应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表示方法: 1( 相对活力分数(残余活力分数) a=Vi/Vo 2( 相对活力百分数(残余活力百分数) a%==Vi/Vo*100% 3( 抑制分数 指被抑制而失去活力的分数 i=1-a=1-Vi/Vo 4( 抑制百分数 i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100% 通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。 三、 抑制作用的分类 * 不可逆抑制作用;可逆抑制作用 Vmax v = ———————————— 1 + Km + Km[I] + [I] [S] Ki [S] Ki’ 可逆抑制:这类抑制剂与酶分子以弱的作用力(弱离子键、氢键等)结合，使酶失活，但抑制剂容易被清除而使酶恢复活性，故称为可逆抑制。 (一) 竞争性抑制作用 1、竞争性抑制作用的含义 竞争性抑制:I与S相似，竞争活性中心，增加[S]去除抑制 。 Vmax [S] v = ———————————— Km ( 1 + [I] / Ki ) + [S] 特点: ? 抑制剂I与底物S在化学结构 上相似，能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团。 ?抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、〔ES〕和〔EI〕的相对稳定性; ?加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。 2、竞争性抑制作用的机理 抑制剂与底物在结构上有类似之处;可能结合在底物所结合的位点(如结合基团)上，从而阻断了底物和酶的结合;降低酶和底物的亲和力 3、竞争性抑制作用举例 举例某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用 磺胺类药物的抑菌机理 4、过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂 所谓过渡态底物是指底物和酶结合成中间复合体后被活化的过渡形 式，一般用S*表示，由于其能障小，和酶结合就紧密得多。 (二)、 非竞争性抑制 非竞争性抑制:I和S与E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，I可以和E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。S和E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。 特点:? I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制。 ? 非竞争性抑制剂的双倒数曲线:不影响酶促反应的Km值，而使Vmax值变小。 非竞争性抑制作用的动力学特点是Vmax变小，而Km不变。 2、非竞争性抑制作用的机理 竞争性抑制的机理 抑制剂与底物在结构上可能毫不相关;不是结合在底物所结合的位点上，而是结合到其它的必需基团(如催化基团)上，阻止酶的催化作用;不降低酶和底物的亲和力。 3、非竞争性抑制举例 (三)、反竞争性抑制 反竞争抑制:只有形成ES后I才能作用，该抑制剂与单独的酶不结合。 2、反竞争性抑制作用的机理 反竞争性抑制的机理 抑制剂不能与未结合底物酶分子结合;不能通过增加底物来减轻抑制程度 3、反竞争性抑制举例 单底物酶:如芳香基硫酸基的肼解 ;氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用 多底物:如双底物乒乓机制中，任何一个底物的竞争性抑制剂也是另一底 物的反竞争性抑制剂。 S S + S I 酶 酶 酶 I (四)、其他可逆抑制 1、部分抑制 部分抑制:假如混合型抑制中ESI复合物也能释放产物即为部分抑制。 2、底物抑制 3、产物抑制 产物对酶反应的抑制作用在生物体中较为常见，在细胞内，酶反应的 产物虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时存在的，因此，考虑产物 对反应速度的影响，可能具有一定的意义。 不可逆抑制:这类抑制剂与酶分子以很强的作用力(共价键、强离子键等)结合，使酶失活，且抑制剂不易被清除而使酶恢复活性。 (一)、非专一性的不可逆抑制作用 概念:抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应，如氨基、羧基、巯基等。 如碘代乙酸 : 酶—SH + I—CH2—COOH ——? 酶—CH2—COOH +HI 有机磷杀虫剂抑制昆虫的乙酰胆碱酯酶作用方式 非专一性不可逆抑制种类: 有机磷化物(作用于羟基酶):如 敌敌畏，敌百虫， 有机汞化物(作用于巯基):如 对氯汞苯甲酸(PCMB) p375 有机砷化物(作用于巯基) :如 Lewisite毒气(CHCl = CHCAs Cl2) 重金属盐 ;烷化剂;氰化物、硫化物、一氧化氮(作用于酶中的金属离子) (二)、 专一性不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制:这类抑制剂只与一定酶活性中心的特定基团起作用，对酶有专一性的抑制作用。 1、 Ks型结合型专一性不可逆抑制剂 Ks型不可逆抑制剂具有底物类似的结构，与酶分子中的必需基团结合 抑制酶活性。通过改变酶的亲和力对酶进行亲和标记 ---称亲和标记试剂。 举例: 对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶 2、Kcat型催化型不可逆抑制剂(自杀底物) kcat型不可逆抑制剂 既是天然底物的类似结构，又是酶的底物。专一 性高的不可逆抑制剂 。 农业生产上的应用 农药杀虫的机理-抑制生物体中的靶酶。 例如:有机磷的杀虫原理主要是:胆碱对生物体神经突触后膜上的乙酰胆 碱酶(ACHE)的抑制，造成突触间隙乙酰胆碱的积蓄，持续地作用于受体， 引起一系列反应、使病虫神经过度兴奋而死亡 。 工业生产上应用 食品加工过程中由于多酚氧化酶的作用，发生酶促褐变，使果蔬类加 工食品货架寿期缩短。多酚氧化酶是含铜金属蛋白，因而许多金属螯合剂 是其抑制剂。 第六节 酶的分离纯化 分离纯化的意义 ?从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生 命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。 ?工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性 的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。 ?医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病。 ?基因工程的需要 分离纯化的要求 1、纯度:主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级 结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一;工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性:要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3、回收率:希望回收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段: ?材料的选择和预处理 ?破碎细胞及提取 ?分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。 酶分离纯化的基本原则 A 切记大部分酶是蛋白质，防止酶变性失活 a.低温 b. 一般中性，<4，>10不稳定，局部酸、碱过高 c.蛋白变性(溶液表面或界面处形成薄膜而变性，因此操作时要尽量减少泡沫的形成) d.重金属，有机溶剂，微生物及蛋白酶污染 B 选择有效的纯化方法 a.容许在不破坏待纯化的―目的酶‖限度内，手段可激烈一些。 b.首选亲和分离法。 C 跟踪酶分离每一步的总活力和比活力，判别每步方法的可行性 一、酶的提取、分离纯化技术路线 酶分离纯化不同阶段 粗蛋白质: 采样 ? 均质打破细胞 ? 抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法;可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 : 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 : 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。 酶的抽提 几个环节:预处理------? 抽提------?纯化------?酶的制品 1.预处理 目的:酶从生物样品中拿出来 动、植物组织 ? 绞肉机切碎， 高速组织捣碎机，局部高温 加沙研磨，注意吸附 破壁:均浆器，冷热破壁法 丙酮干粉:使用0?磨碎 ? 加-20?丙酮预冷 ?过滤?低温干燥?研磨过筛 优点:破壁，去脂肪和水分，结酶溶解 缺点:有机溶剂不稳定，小心酶失活，注意低温 细菌:量少 -----超声波，溶菌酶 量多-----丙酮干粉 自溶法:一定温度，离子强度下保温，或加甲苯，使菌体自溶液化 缺点:引入细胞其他成分，成分复杂，使分离酶失活破坏 霉菌: 机械剪切，磨碎，细胞壁用溶解酶 酵母: 自溶法 蜗牛酶 冷冻破壁法 细胞破碎方法及其原理 温度差破碎法 物理破碎 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结压力差破碎法 构破坏，而使细胞破碎。 超声波破碎法 化学破碎 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎 有机溶剂:甲苯、丙酮 表面活性剂:Triton、Tween 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，酶促破碎 使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎 自溶法;外加酶制剂法 2.抽提 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 机械破碎 捣碎法,研磨法,匀浆法 pH: 酸性蛋白------ 碱性溶液 碱性蛋白------ 酸性溶液 盐: 低盐溶液有利于酶蛋白溶解 0.02—0.05 M磷酸缓冲液，0.15M NaCl 用柠檬酸钠螯合金属离子，切断与其他物质结合 温度:0 ?4 ?之间，有的可以高一些(室温) 其他:防止氧化--- 加CySH， DTT，巯基乙醇; 防蛋白酶水解，加蛋 白酶抑制剂(如苯甲磺酰氟)等;防止有机溶剂的影响。 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 酶的主要提取方法: 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液 0.02,0.5mol/L的盐溶液 提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液 PH2,6的水溶液 提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 碱溶液 PH8,12的水溶液 提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 有机溶剂 可与水混溶的有机溶剂 与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 影响酶提取的主要因素: 酶所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中的扩散速度。温度、pH值、提取液体积。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 3.浓缩 大体积 小体积 A )蒸发 减压蒸发---加热把水分蒸发，产生泡沫，有增色效应，效率低 (不能用于稳定性差的酶) 超蒸发---暖空气流通过冷酶溶液表面，加速蒸发，效率低，有增色效应，用的少。 薄膜蒸发浓缩---在高度真空条件下将待浓缩的酶溶液变成极薄的液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。 优点:对热不稳定的酶十分有利 缺点:有增色效应 工业上应用 B)超过滤: 用微孔超滤膜进行，水分子和小分子可以透过膜，大分子被阻截。 优点:没有[ I ] 、pH、热、相的变化问题。起浓缩和粗分作用。 C)胶过滤: 葡聚糖Sephadex G 25， G 50，干粒状吸水膨胀。小分子及水分子进入胶内，酶和大分子在胶外，达到浓缩分离的目的。 方法:酶溶液中直接放入干胶，胶吸水膨胀，达到浓缩分离的目的。 优点:没有pH，[ I ] 变化，条件温和。 D) 反复冻融浓缩: 溶液相对纯水，会发生融点升高，冰点降低。温度< 0?时，水结冰， 移去冰块，酶不结冰。 冰冻方法: ?溶液冰冻后，在室温下缓慢溶化。不含蛋白和酶的冰块就浮于液面，酶则溶解于下层溶液(酶先溶解1/4体积时倾出水分)。 ?先让酶溶液缓缓冻凝，再移去形成的冰块。 E) 聚乙二醇:适合于少量样品，而且成本高。 二、酶的分离方法 分离纯化实质:在抽提(浓缩)溶液中，其成分多而杂的情况下，要去除 需要分离的酶以外的组分，从而获得高纯度的酶液。 分离纯化过程中应注意的问题 ?工作前应对所要纯化的酶的理化性质和稳定性有一个全面的了解。 ?判断选择的方法和条件是否适当，始终应以活力测定为准则。 ?严格控制操作条件，以保证重复率，防止酶的变性失效。 1、沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 盐析法: 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水 化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表 面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。 1)在盐析条件下，蛋白质的溶解度与溶液的离子强度间的关系 : 盐析常数: 由蛋白质性质、盐种类决定 log S=β- KI 蛋白质溶解度 蛋白质在纯水( [I ]= 0 )中的溶解度 盐析常数 离子强度 2)成功的关键 :pH: = 等电点 (pI ) 蛋白质浓度: < 100 ug /ml，不沉淀 200,1000ug/ml，沉淀时间长 > 1000ug/ml， 沉淀快 盐:K越大，效果越好。就阳离子而言，一价盐比二价盐好;而阴离子则相反。 温度:在 4?左右进行。 盐析操作:盐析沉淀至少1小时，盐析后沉淀的母液应尽量除去。 有机溶剂沉淀: 降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白 质产生沉淀;有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋 白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20?时水的介电常数为80，而82,乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 进行有机溶剂沉淀处理时应考虑的因素: 1)温度 0?下操作。常用丙酮，还有甲醇，乙醇等， 有机溶剂先在-15,20?下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离。 2)pH = pI 3)离子和离子强度:中性盐通常能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影 响。但盐浓度不宜超过0.05,mol/L，否则沉淀不好，甚至沉淀全无，高耗 有机溶剂。 4)有机溶剂:丙酮分离效果最好，引起失效也较少。 优点:分辩率高且易去除，与pI 同时使用，用于酶粗分 缺点:对有机溶剂不稳定的酶，容易变性。 多价阳离子效应:在向酶溶液中加入有机溶剂时，可将溶液的pH调整到略高于目的蛋白的pI，使之带负电荷，然后再添加少量(0.005,0.02mol/L)的多价阳离子，由于这些离子能和阴离子蛋白质形成络合物，降低其溶解度，从而可减少有机溶剂的用量，同时提高分离的分辨率。 等电点沉淀 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸 引，聚合成沉淀;加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。 等电点沉淀原理: 溶解度随分子间引力增大而减小，其他条件相同时，pH在等电点附近 时，分子引力最大，蛋白质就沉淀。一般不单独使用，配合其他方法使用。 共沉淀法: 利用离子聚合物(SDS)，非离子聚合物(聚乙二醇，聚乙烯亚胺，单宁酸) 等，在一定条件下与蛋白质直接或间接形成络合物，使蛋白质、 酶一起沉淀，再用适当方法把酶溶解下来。 PEI(聚乙烯亚胺) + 菌体超声上清液(酶) 0.2M KCl (DNA)---PEI --- 杂蛋白质和酶沉淀 0.6M KCl EcoRI(酶)被溶解下来 + (DNA)-PEI -杂蛋白沉淀，不溶解 选择性沉淀法: 多聚电解质，如聚丙烯酸(PAA)等杂多酸，在低浓度时，选择性地与某种(某类)酶络合沉淀。 聚乙二醇( PEG )沉淀: 为水溶性非离子型聚合物，方法同(NH4)2SO4，但与PEG分子量有关系。 2、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力 4 (RCF)在1×10g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 密度梯度(区带)离心 445 高速离心机的最大转速为(1,2.5)×10 r/min ，相对离心力达到 1×10,1×10 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中，温度升高而造成酶的变性失活，有些高速离心机装设有冷冻装置，谓之高速冷冻离心机。 45超速离心机的最大转速达 (2.5,12)×10 r/min，相对离心力可以高达 5×10 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化;样品纯度的检测;沉降系数和相对分子质量的测定等。 蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降系数 即用來描述此沉降性质; 其单位为 S 。 每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。 蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密 度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度 时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带。 密度梯度 * 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。 3* 蔗糖便宜，纯度高，浓溶液(60%，W/W)密度可达1.28 g/cm。 * 密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，向上逐渐减小 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。 非膜过滤:采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 过滤 膜过滤:采用各种高分子膜为过滤介质 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的 物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。 膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙 等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程 中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大 于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。 4、层析分离 (1)、层析的原理: 层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相 时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等) 的能力不同，在两相中的分配(含量对比)不同，而且随流动相向前移动，各组份 不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。 (2)、层析的分类 按固定相基质的形式:柱层析、纸层析和薄层层析 根据流动相的形式:液相层析、气相层析 (3)、层析前蛋白质处理 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与较大量的 杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋 白质，但分辨率低。 (4)、层析基本操作过程 装置选择 上样和洗脱 结果检测 A、柱层析的L/d比值 B、洗脱装置 * 不改变溶剂系统 * 改变溶剂系统 C、结果检测 活性检测 * 比活没有提高，目的蛋白与杂蛋白并没有分开 * 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 * 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性 D、结果保存 * 薄层层析&纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分仪变成数据 * 柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理 E、层析装置的仪器化 吸附层析 1、原理 * 根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不同，以及其在相应的 流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程，达到分离目的。 * 无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。 2、吸附剂 硅胶;氧化铝;聚酰胺;活性炭;大孔吸附树脂 分配层析 * 分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。 * 固定相 极性溶剂(例如水、稀硫酸、甲醇等) 能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，呈不流动状态 * 流动相 非极性的有机溶剂 * 分配系数(a) 指在一定温度和压力条件下物质在固定相和流动相两部分浓度达到平衡时的 浓度比值。 离子交换层析 1、原理 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以 蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 原理:利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目 的。 2、高分子聚合物基质、配基和平衡离子 平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交 换反应。 阳离子交换剂:平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作 用 阴离子交换剂:平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用 3、离子交换剂的基质 离子交换纤维素;离子交换交联葡聚糖;琼脂糖离子交换剂 4、基本操作 (1)离子交换剂的选择 * 配基的选择 取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂;如带负电，则选择阴离子交换剂。 一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。 * 基质的选择 价格 分辨率和稳定性 特点 纤维素离子交换剂 较低 较低 适于初步分离和大量制备 葡聚糖离子交换剂 适中 适中 受外界影响较大，体积可能 随离子强度和pH变化有较 大改变，影响分辨率 琼脂糖离子交换剂 较贵 较高 * 颗粒大小 分辨率 平衡时间 流速 应用 小颗粒 高 长 慢 分辨率要求不高的大规模 制备性分离 大颗粒 低 短 快 需要高分辨率的分析或分离 (2)离子交换剂的处理 * 膨化 将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。 * 水悬浮 去除杂质和细小颗粒 * 酸碱浸泡 进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最 后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。 (3)缓冲液的选择 离子强度和pH * 保证各个待分离物质的稳定; * 使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定; * 注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。 (4)层析柱的选择 * 亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大 增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，柱的 直径与高度的比以1:20左右为宜。 * 采用离子强度较大的梯度洗脱 选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸 附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长， 即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过 宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为 15,20cm。 (5)上样 * 样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度。 * 离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。 * 不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。 * 上样量要适当，不要超过柱的负荷能力，通常上样量为交换剂交换总量的1,-5,。 (6)洗脱 * 改变溶液的pH或改变离子强度 当使用阴离子交换剂时，增加盐离子浓度，则降低pH值 当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高pH值 * 亲和洗脱 目的蛋白与加入离子发生特异性相互作用而被置换 * 添加置换剂 能置换基质上所有蛋白质 * 洗脱方法 阶段洗脱和梯度洗脱 (7)洗脱速度 * 洗脱速度通常要保持恒定 * 洗脱速度慢比快的分辨率好 * 如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率;如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。 (8)洗脱液的监测收集及组分鉴定 * 监测 用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收 * 收集 用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集 * 鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等 (9)离子交换剂的清洗、再生和保存 * 可溶于碱的污染物 0.1 mol/L NaOH洗涤 Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤 结合缓冲液洗涤 可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。 * 对于疏水性污染物 乙醇溶液(如70%的乙醇)或非离子型的去污剂洗涤 可以除去脂类和其他的疏水性物质。 * 金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCL(即pH=2)处理柱子 * 沉淀物杂质 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然 后用去离子水和缓冲液洗涤。 * 再生 对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。 酸碱交替浸泡 * 保存 处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02 %的叠氮钠，4?下保存。 5、应用实例 * 阴离子交换层析 从人血浆中分离得到血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG) * 阳离子交换层析 用CM纤维素分离鸡蛋清中的蛋白质组份 凝胶层析 又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子 的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离。 优点:凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广， 不需要有机溶剂，分离效果好 缺点:样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差 1、原理 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及 筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。 * 大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱 * 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱 (1) 体积参数 分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数 Ka，Ka表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。 Ka,(Ve一Vo),Vi * Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Ka,0。 * Vi,Ve-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最慢。即该成分的Ka=l。 * Ka值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Ka值的增加而降低。 * 一般物质的Ka值是0稳定温度 10 ? 时 酸碱变性: 酶和杂蛋白受到酸碱影响程度不同，如细胞色素C可用2.5%三氯醋酸处理，大部分杂蛋白就可以去除。 如麦芽中提取β-淀粉酶，pH3时α-淀粉酶失活，无活性。 缺点:操作繁，纯化效率低。 表面变性: 酶溶液和惰性液体(氯仿)混合振荡，造成选择性表面变性。 一般上 层为未变性蛋白，中间层变性蛋白，下层为氯仿。 操作要点:处理时间不要过长，防止酶蛋白的变性。 8、萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。 按照两相的组成不同，萃取可以分为: 有机溶剂萃取;双水相萃取;超临界萃取;反胶束萃取 溶剂萃取 溶剂萃取法(有机溶剂萃取)属于液-液萃取，是一种常用的化工单元操作。它是利用溶质在两个互不混溶的液相(通常为水相和有机溶剂相)中溶解度和分配性质上的差异进行的分离操作。 溶剂萃取操作方式 选择适宜的有机溶剂;混合;分离;溶剂回收 双水相萃取 利用物质在互不相溶的两相间分配系数的差异来进行萃取的方法。 影响因素:成相聚合物和浓度;盐的种类和浓度;pH和温度 超临界流体 超临界流体(SCF)是指在临界温度(Tc)和临界压力(Pv)以上的流体。高于临界温度和临界压力而接近临界点的状态称为超临界状态。 种类:二氧化碳; 一氧化亚氮;甲醇;乙烷;氨和水 超临界流体萃取的方式 超临界流体萃取的特点 萃取剂的溶解能力易于通过调节温度和压力控制; 可在低温和无氧下操作，不破坏提取物中的活性组分，较适于热敏性物 质的萃取; 可较快地达到平衡，萃取速率快，生产周期短; 溶剂可回收且简单方便，无溶剂残留; 萃取剂可重新使用，不产生三废，不污染环境。 超临界流体萃取的应用 反胶束萃取 反胶束萃取 利用反胶束将酶或蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。 反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。 9、结晶 当酶达到一定纯度和浓度后，加入晶种，在一定条件下经缓慢的过程， 使酶的溶解度降低，酶慢慢结晶出来。时间可以从几小时，几天，几个月， 甚至几年。 盐析结晶;有机溶剂结晶;透析平衡结晶;等电点结晶 结晶条件: (1) 酶的纯度 一般来说，酶越纯，越容易获得结晶。除个别情况外，一般酶纯度应达到50,以上。 (2) 酶蛋白的浓度 对大多数酶来说，蛋白质浓度在3-50mg/ml较好。 (3) 晶种 有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶。 (4) 温度 结晶温度， 一方面要有利于结晶的生成;另一方面要不超过酶的热稳定性。 (5) pH pH是酶结晶的一个重要条件。所选择pH应在酶的稳定范围内，—般选择在被结晶酶的pI值附近。 (6) 金属离子 许多金属能引起或有助于酶的结品。 (7) 其他 除上述因素外，还有一些因素会影响结晶的形成。 结晶成功关键:1(浓度要在1~5%为宜。2(纯度要高。 3(酶要有活性 三、酶的浓缩、干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂(通常是水)分离的过程。 在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。 离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60?以下进行浓缩。 常用的干燥方法有:真空干燥;冷冻干燥;喷雾干燥;气流干燥;吸附干燥 四、酶分离、纯化的评价 酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜，必须经过对有关参数 的测定及计算才能确定。酶的产量是以活力单位表示，因此在整个分离过 程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测、比较。 五、酶的纯度与鉴定 酶的纯度(酶蛋白的均一性):酶在分离纯化过程中，逐步除去杂质，逼近均一酶蛋白的过程。多种方法相互验证。 不同的用途要求的纯度不同。 1)作为静脉注射用酶就不能有热源。 2)作为工具酶，无杂酶，否则不可能有准确无误切点，供基因工程工作。 3)作氨基酸顺序分析用，构象测定，理化性质测定，要求就很高。 六、 酶的剂型与保存 酶制剂通常有四种剂型:液体酶制剂;固体粗酶制剂;纯酶制剂;固定化酶制剂 液体酶制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成， 或加以浓缩而成，一般需要加稳定剂。这种酶制剂不稳定，且成分复杂， 只用于某些工业生产。 固体粗酶制剂 发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业 生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产 品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期 保存，成本也不高。 纯酶制剂 包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单 位数。用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位质量 的酶制剂中酶活力达到一定的单位数。用作基因工程的工具酶要求不含非专一性的 核酸酶，或完全不含核酸酶， 酶的保存方法 (1) 温度 在低温条件下(0-4?)使用、处理和保存。有的需更低温度，加入甘油 或多元醇有保护作用。 (2) pH与缓冲液 pH应在酶的PH稳定范围内，采用缓冲液保存。 (3) 酶蛋白浓度。一般酶浓度高较稳定，低浓度时易于解离、吸附或表面变性失效。 (4) 氧。有些酶易于氧化而失活。 (5) 为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂: ? 底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。 ? 对巯基酶，可加入-SH保护剂。如二巯基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫苏糖醇)等。 ? 其他如Ca2+能保护α-淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶， Cl,能稳定透明质酸酶。