血小板活化检测方法

查看完整版本: [-- 血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析 --] 生技论坛-生命科学的交流社区！ -> 细胞实验室 -> 血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析 [打印本页] 登录 -> 注册 -> 回复主题 -> 发主题 balohot 2010-06-28 10:29 血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析 血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异、灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化 状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、血小板疾病患者的筛选、预测并发症等方面有良好的应用前景。 使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是： 检测血小板的反应性；了解血小板活化进程；血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。同时检测多种血小板表面标志；高度灵敏；直接检测 血小板的多种标志；使用全血，标本量少；操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。 BDIS血小板活化试剂组成为： PAC-1 FITC：血小板活化早期的标志物，即活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物，抗体与活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS抗体为 IgM型，建议使用PAC-1结合阻断剂RGDS做阴性对照。 CD62P PE：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内a颗粒含有CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表 达CD62P。 CD61 PerCP：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与静止的血小板结合。CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物。在本试验中，用 FL3设阈值。 试验用品 采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管；一次性12×75 mm Falcon试管；微量加样器和加样头；BD抗体：2-8℃保存。 RGDS (PAC-1阻断剂)：用PBS配制，10mg/ml。 血小板激活剂：ADP，浓度2×10－4M，2-8℃保存。也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP。 PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8℃保存。 固定液：含1%多聚甲醛的PBS缓冲液，2-8℃可保存一周。 振荡混匀器。 FACS流式细胞仪：进行数据获取。 CaliBRITE Beads/FACSComp软件：FACS仪器校正，预设获取条件。 CellQuest软件：试验数据获取和分析软件。 操作 1、标本采集： (1)采血管顺序编号。 (2)抽取静脉血，采血管中注入2ml。 (3)于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。 2.血小板激活： (1)试管内加入50μlADP，450μl全血，轻轻摇匀。 (2)室温孵育5分钟。 (3)立即染色。 3、荧光抗体染色： (1)Falcon管编号。 (2)在对照管中加入PE同型对照、CD61 PerCP、PAC-1各20μl，RGDS加10μl。 (3)在试验管中加入三种抗体各20μl。 (4)在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5μl。 (5)轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。 (6)各管中加入1ml冷的固定液 (2-8℃)，充分混匀， 2-8℃阴暗处放置30分钟。 (7)24小时内上机分析。 4、上机获取数据： (1)开机： 检查鞘液筒装满，废液筒倒空。 先打开流式细胞仪，再打开计算机。 仪器气路加压，排空气泡。 做FACSComp。 (2)打开CellQuest，顺序放置对照管和试验管，获取数据： 调出获取条件，FSC和SSC选择Log方式。 获取条件为CD61 PerCP阳性。 使用对照管调整FL1和FL2的PMT，使阴性群体位于FL1 vs FL2点图左下角。 分别使用PAC-1 FITC/IgG1 PE/CD61 PerCP和PAC-1 FITC+ RGDS/CD 62P PE/CD61 PerCP 调整FL2-FL1和FL1-FL2补偿。 获取各管的试验数据。 5、结果分析： 在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群，CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成，CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小 板的血细胞组成， CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此， 不建议使用FSC-SSC图设门。 在CD61 vs SSC点图中找出CD61 PerCP阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在WBC上的血小板)，设门。门内做PAC-1 FITC vs CD62P PE点图的双参数分析， 统计结果。 Figure5 Unstimulated frwhole blood 荧光抗体 FITC PE PerCP 对照管 PAC-1+RGDS IgG1 CD61 试验管 PAC-1 CD62P CD61 Page 1 of 2血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析|细胞实验室-生技论坛-生命科学的... 2011-4-13http://bbs.biogo.net/simple/?t156686.html 查看完整版本: [-- 血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析 --] [-- top --] Powered by phpwind v8.0 Code ©2003-2010 phpwind Time 0.037335 second(s),query:1 Gzip enabled Figure6 Unstimulated fresh whole blood(gated on R1) Figure7 Unstimulated fresh whole blood(gated on R1) Figure8 ADP-stimulated fresh whole blood(gated on R1) 注意事项 1.采血时请用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用。 2.尽量避免标本受到物理振动。 3.取血后10分钟内完成染色操作。 4.在Falcon管中加血标本5ml，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果 5.为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制 Page 2 of 2血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析|细胞实验室-生技论坛-生命科学的... 2011-4-13http://bbs.biogo.net/simple/?t156686.html