猪瘟病毒猪细小病毒猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的建立

猪瘟病毒 猪细小病毒 猪伪狂犬病病毒 PCR 检测的建立 刘建柱, 崔玉东, 于立权, 王志强, 侯喜林, 潘兴广, 朴范泽 (黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院, 黑龙江 大庆 163318) 中图分类号: S851. 34　　文献标识码: B　　文章编号: 052926005 (2005) 1020017203 　　猪瘟、猪细小病毒感染和猪伪狂犬病是3 种最为 常见的、引起猪繁殖障碍的传染性疾病, 在世界范围 内广泛流行, 给养猪业带来严重的经济损失[1～ 3 ]。在 兽医临床上这3 种疾病有时呈混合感染, 且临床表现 相似, 给临床诊断造成很大困难。目前对这3 种疾病 的确诊方法都存在着繁琐、耗时、特异性差等缺点, 因 而有必要建立一种特异、快速、灵敏的诊断方法用于 这些疾病的临床诊断和检测。L iu [4 ]、李文刚[5 ]及吴 斌[6 ]等分别研究了这3 种病的R T 2PCR 或PCR 诊断 方法, 但PCR 扩增条件均缺乏系统性研究。本实验设 计了检测猪瘟病毒 (CSFV )、猪细小病毒 (PPV ) 和猪 伪狂犬病病毒 (PRV ) 的 PCR 引物, 建立了这 3 种疾 病病原的PCR 检测方法, 并对临床送检样本进行了 检测, 为进一步应用该方法诊断这些疾病提供一定的 参考。 1　材料与方法 1. 1　病毒株及其病毒培养　实验毒株: 猪瘟病毒 HL 971025 株、JN 9852 株、M S989 株、M S01524 株、 H T 株和猪伪狂犬病病毒M S97 株、M D 02 株为本校 家畜传染病教研室分离鉴定的毒株; 猪细小病毒B 1 株、B 2 株、B 3 株、PPV 四株、PPV 天株由中国农业大 学甘孟侯教授惠赠。伪狂犬病病毒和猪细小病毒用猪 肾原代细胞按常规方法培养。 对照毒株: 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒 (PRR SV )由中国农科院哈尔滨兽医研究所童光志研 究员惠赠; 流行性乙型脑炎疫苗病毒由辽宁省卫生防 疫站卫广森研究员惠赠, 鸡传染性支气管炎病毒 ( IB ) 及新城疫病毒 (ND )为本校家畜传染病教研室保存毒 株。 1. 2　PCR 反应仪及试剂　PCR 仪购自H ybaid 公 司; TR IZOL R eagen t 购 自 G IBCO BRL (L ife T echno logies, Inc) ; 试验用酶及其他试剂均购自大 收稿日期: 2003208229 基金项目: 黑龙江省科委基金资助项目 (GB01B1056202) 作者简介: 刘建柱 (19732) , 兽医师, 在读博士研究生, 从事大动物 传染性疾病和小动物临床疾病的研究。 E2m ail: liu jiazhucrb@ sohu. com。 通讯作者: 朴范泽, 于立权现在山东省聊城大学生物系工作, 山东 聊城 252059 连宝生物工程有限公司。 1. 3　引物设计与合成　根据基因文库提供的和已发 表的 CSFV、PPV 和 PRV 序列, 应用计算机软件 DNA star 设计了CSFV 的E2 基因、PPV 的V P2 基因 和 PRV 的gÊ 基因序列保守区的三对引物。PCR 扩 增片段长度为CSFV 288 bp、PPV 575 bp、PRV 700 bp。该引物设计完成后, 通过计算机网站 (h t tp: öö www. ncb i. n lm. n ih. govöBLA ST ö) 对其进行分析, 结果具有良好的特异性。三对引物均由上海博亚生物 技术有限公司合成。引物序列如下: CSFV upc1: 5′2CA GGTA T GCGA TCTCGTCAA CCA 23′ upc2: 5′2 GGGCA CA GCCCAAA TCCGAA GT 3′ PPV upp1: 5′2CGA GCCAA CAA CA CCAA CT T TCA C23′ upp2: 5′2TCTCGGCGA TCT TCT TA CCTCT GG23′ PRV up r1: 5′2CGA CAA CGA GCTCCTCA TCT 23′ up r2: 5′2T TCT TCT T GCGCGCCT T GT G23′ 1. 4　病毒 RNA 和DNA 的提取　猪瘟病料的总 RNA 提取按TR IZOL R eagen t 说明进行; PPV 和 PRV 的DNA 提取, 按文献[ 7、8 ]方法进行。 1. 5　CSFV cDNA 的合成　采用20 Λl 反转录体系合 成CSFV cDNA , 其中含1 Λl (25 pmo löm l) 下游引物, 1 Λl 10. 00 mmo löL dN T P, 4 Λl 5×R T 2PCR 缓冲液, 0. 5 Λl (40 U öΛl)AM V 酶, 2 Λl CSFV 核酸, 1 Λl RN ase 抑制剂, 用D EPC 处理的水补足体积至 20 Λl, 42℃温育1 h 进行反转录合成CSFV cDNA。 1. 6　单重PCR 扩增条件的优化　将CSFV cDNA 和 PPV、PRV 的DNA 用Gene Q uan tÊ 核酸定量仪测定 浓度 后, 对 单 重 PCR 的 引 物 浓 度 (终 浓 度 为 0. 50 pmo löm l、0. 75 pmo löm l、1. 00 pmo löm l、 1. 25 pmo löm l、1. 50 pmo löm l、1. 75 pmo löm l 6 个稀 释度)、dN T P 浓度 (2. 50 mmo löL、5. 00 mmo löL、7. 25 mmo löL、10. 00 mmo löL、12. 50 mmo löL、 1. 50 mmo löL 6 个稀释度) 及 PCR 扩增的温度、时 间、循环参数等参数进行优化, 筛选出单重PCR 扩增 的最佳反应模式。 1. 7　单重PCR 的特异性试验　利用优化后的扩增 条件对5 株CSFV、5 株PPV 和2 株PRV 及对照毒株 分别进行单重PCR 扩增, 扩增体系为20 Λl, 其中 2× GC Buffer (M g2+ P lu s) 10 Λl, T aKaR a LA T aqase 1 U , 25 pmo löm l 的上下游引物各 1 Λl, 核酸模板 71　　Ch inese Journal of V eterinary M edicine　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 中国兽医杂志 2005 年 (第41 卷)第10 期 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 1 Λl, 10. 00 mmo löL dN T P 1 Λl, 用水补至20 Λl, 混匀 后置于PCR 仪中扩增, 以确定单重PCR 的特异性。 1. 8　单重PCR 的敏感性试验　以猪瘟病料总RNA、 PPV 和 PRV 的DNA 作为模板, 用Gene Q uan tÊ 核 酸定量仪测其含量, 然后进行10 倍系列稀释。采用优 化后的单重PCR 扩增条件进行扩增, 检测其敏感性。 1. 9　单重 PCR 的应用及符合性试验　利用所建立 的PCR 方法, 对2002 年9 月至2003 年4 月牡丹江、鸡 西、密山和虎林地区送检的 27 头份流产母猪所产的 死胎、木乃伊胎及弱小仔猪为病料进行检测。另外, 选 取1. 5～ 2 kg 的健康家兔56 只, 分成28 组, 其中27 组 为试验组, 1 组为对照组。将27 份病料分别加生理盐 水研磨做成1∶10 的悬液, 加双抗4℃过夜后, 各试验 组家兔皮下接种 5 m l, 对照组只注射生理盐水, 每天 观察家兔变化并测体温。接种后48 h 出现发热、奇痒 者为伪狂犬病; 病料接种 7 天后, 对试验组未死家兔 静脉接种猪瘟兔化弱毒疫苗, 对照组也同样注射, 并 每隔8h 测体温一次, 连测 3 天, 体温升高者为猪瘟阴 性, 体温正常者为阳性。另将病料悬液经6 000 röm in 和 40 000 röm in 差速离心浓缩病毒后, 以 1% 豚鼠红 细胞进行PPV 血凝抑制试验[9 ]。 1. 10　PCR 产物的电泳分析　取 3 Λl PCR 产物与 2 Λl DNA 上样缓冲液混合, 以TA E 为缓冲液在 1% 琼脂糖凝胶上电泳 30 m in (5 V öcm ) , 用溴化乙淀染 色后, 用凝胶成像仪 (B io2R ad, Gel Doc 2000) 观察记 录结果。 2　结果 2. 1　PCR 扩增各参数的优化结果 2. 1. 1　CSFV PCR 扩增各参数的优化结果　试验 以CSFV 的cDNA 为模板对PCR 扩增温度、时间和循 环次数进行了优化。结果在退火温度为50. 1～ 61. 1℃ 40 s 时CSFV cDNA 的扩增效果为佳, 电泳条带清 晰, 杂带较弱; 其他步骤的反应条件为预变性 94℃ 3 m in、变性94℃ 30 s、延伸72℃ 1 m in、共30 个循环、再 经延伸72℃ 5 m in 后、于4℃ 10 m in 对PCR 产物进行 保护。见图1。 图 1　CSFV 退火温度梯度PCR M : DL 2000; 1. 62. 2℃; 2. 61. 6℃; 3. 61. 1℃; 4. 59. 5℃; 5. 58. 0℃; 6. 56. 2℃; 7. 54. 5℃; 8. 52. 8℃; 9. 51. 4℃; 10. 50. 1℃; 11. 49. 4℃; 12. 49. 1℃ 2. 1. 2　PPV PCR 扩增各参数的优化结果　对PPV PCR 扩增温度、时间和循环次数进行优化, 结果退火 温度为52. 8～ 61. 1℃ 40 s 时PPV 扩增效果为佳。其 他步骤的反应条件为预变性 94℃ 3 m in、变性 94℃ 30 s、延伸 72℃ 1 m in、共 30 个循环、再经延伸 72℃ 5 m in后、于4℃ 10 m in 对PCR 产物进行保护。见图2。 图 2　PPV 退火温度梯度PCR M : DL 12 000; 1. 62. 2℃; 2. 61. 6℃; 3. 61. 1℃; 4. 59. 5℃; 5. 58. 0℃; 6. 56. 2℃; 7. 54. 5℃; 8. 52. 8℃; 9. 51. 4℃; 10. 50. 1℃; 11. 49. 4℃; 12. 49. 1℃ 2. 1. 3　PRV PCR 扩增各参数的优化结果　对PRV PCR 扩增温度、时间和循环次数进行优化, 结果退火 温度为 56. 2～ 62. 2℃ 40 s 扩增效果为佳, 但以 59. 5 ～ 61. 1℃ 40 s 最为理想。其他步骤的反应条件为预 变性94℃ 3 m in、变性94℃ 30 s、延伸72℃ 1 m in、共 30 个循环、再经延伸72℃ 5 m in 后、于4℃ 10 m in 对 PCR 产物进行保护。见图3。 图 3　PRV 退火温度梯度PCR M : DL 2 000; 1. 62. 2℃; 2. 61. 6℃; 3. 61. 1℃; 4. 59. 5℃; 5. 58. 0℃; 6. 56. 2℃; 7. 54. 5℃; 8. 52. 8℃; 9. 51. 4℃; 10. 50. 1℃; 11. 49. 4℃; 12. 49. 1℃ 2. 1. 4　引物浓度对PCR 扩增的影响　将CSFV 引 物、PPV 引物、PRV 引物稀释成不同浓度, 利用优化 后的条件进行 PCR 扩增, 结果各引物浓度以CSFV 1. 0～ 1. 75 pmo löm l, PPV 1. 0～ 1. 75 pmo löm l, PRV 0. 75～ 1. 75 pmo löm l 为宜。 2. 1. 5　dN T P 浓度对PCR 反应的影响　将dN T P 稀 释成不同浓度, 利用优化后的条件进行PCR 扩增, 结果 扩增CSFV 时dN T P 浓度以7. 50～ 12. 50 mmo löL 为 宜、扩增PPV 时 dN T P 浓度以5. 00～ 12. 50 mmo löL 为宜, 但以10. 00 mmo löL 最佳、扩增PRV 时dN T P 浓 度以 5. 00～ 12. 50 mmo löL 为宜, 但以7. 50～ 12. 50 mmo löL 更佳。结果见图4。 81 中国兽医杂志 2005 年 (第41 卷)第10 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Ch inese Journal of V eterinary M edicine　　 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 图 4　dNTP 浓度对各PCR 反应影响 M : DL 2 000; 1. PRV 2. 50 mmo löL ; 2. PPV 2. 50 mmo löL ; 3. CSFV 2. 50 mmo löL ; 4. PRV 5. 00 mmo löL ; 5. PPV 5. 00 mmo löL ; 6. CSFV 5. 00 mmo löL ; 7. PRV 7. 50 mmo löL ; 8. PPV 7. 50 mmo löL ; 9. CSFV 7. 50 mmo löL ; 10. PRV 10. 00 mmo löL ; 11. PPV 10. 00 mmo löL ; 12. CSFV 10. 00 mmo löL ; 13. PRV 12. 50 mmo löL ; 14. PPV 12. 50 mmo löL ; 15. CSFV 12. 50 mmo löL 2. 2　单重 PCR 的特异性试验　将 5 株CSFV、5 株 PPV 和2 株PRV 分别进行单重PCR 扩增, 结果分别 依次在288 bp、575 bp 和700 bp 处均出现与实验设计 相符的扩增片段, 具有很好的特异性。结果详见图5。 选取CSFV HL 971025、PPVB 2、PRV M S97 及猪呼吸 繁殖障碍综合征病毒 (PRR SV )、流行性乙型脑炎病 毒、鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV ) 和鸡新城疫病毒 (NDV ) 的核酸以三对不同引物进行单重PCR 扩增, 结果只有含CSFV、PPV、PRV 核酸样品扩增出与试 验设计相符的扩增片段, 而以PRR SV、IBV、NDV 和 流行性乙型脑炎病毒核酸为模板均未扩增出任何 DNA 片段。 图5　5 株CSFV、5 株PPV 和2 株PRV PCR 特异性扩增结果 M : DL 2 000; 1. HL 971025; 2. JN 9852; 3. M S989; 4. M S01524; 5. H T; 6. PPV 四川株; 7. PPV 天津株; 8. B 1; 9. B 2; 10. B 3; 11. M S97; 12. M D 02 2. 3　PCR 敏感性试验结果　分别将CSFV、PPV 和 PRV 模板进行 10 倍系列稀释, 然后在引物终浓度分 别为CSFV 1. 5 pmo löm l、PPV 1. 25 pmo löm l、PRV 1. 25 pmo löm l, dN T P 浓度均为 10. 00 mmo löL 的条 件下, 以94℃预变性 3 m in、然后进入 94℃变性 30 s、 56℃退火40 s、72℃延伸1 m in 循环、共30 个循环, 再 72℃延伸5 m in 进行PCR 扩增, 结果PCR 检测病毒的 敏感性分别为CSFV 14. 5 pg。 2. 4　单重 PCR 的应用及符合性试验结果　利用优 化后的单重PCR 扩增, 对2002 年9 月至2003 年4 月 牡丹江、鸡西、密山和虎林地区送检的27 头份流产母 猪所产的死胎、木乃伊胎及弱小仔猪进行检测, 同时 进行兔体接种试验、兔体交叉试验和PPV H I, 其试验 检测结果见表1。在27 份送检病料中PCR 检测有17 份CSFV 阳性, 经兔体交叉试验检测发现对应的这17 份病料也为阳性; 4 份PPV 阳性, PPV H I 检测 27 份 病料中血凝抑制价高于1∶40 的有4 份, 其对应的病 料号与PCR 检测阳性病料编号相同; 6 份PRV 阳性, 兔体接种后48 h 有6 组家兔出现奇痒, 表 1　PCR 反应与其对比试验的检测结果 序号 CSFV 2PCR PPV 2PCR PRV 2PCR 兔体接种试验 兔体交叉试验 PPV 2H I 1 + - - - + - 2 + - - - + - 3 + - - - + - 4 + - - - + - 5 + - - - + - 6 + - - - + - 7 + - - - + - 8 + - - - + - 9 + - - - + - 10 + - - - + - 11 - - + + - - 12 - + - - - + 13 - + - - - + 14 + - - - + - 15 + - - - + - 16 - - + + - - 17 + - - - + - 18 - + - - - + 19 + - - - + - 20 + - - - + - 21 - - + + - - 22 - - + + - - 23 - - + + - - 24 - - + + - - 25 + - - - + - 26 - + - - - + 27 + - - - + - 　　注: PPV H I 效价大于1: 40 为阳性[9 ]。 并迅速死亡, 其对应的病料号与PCR 检测阳性病料 编号相同。由此可见, PCR 扩增结果和对照试验结果 的符合率为100%。 3　讨论 PCR 技术是近年来发展起来的一种具有敏感、 特异、快速等特点的分子生物学技术。由于它克服了 传统的病原分离及常规血清学诊断等方法费时、费 力、敏感性和特异性较差的缺点, 因此已被应用于多 种病原微生物的鉴定和检测。本试验研究了检测 CSFV、PPV 或PRV 的单重PCR 方法, 并证实该方法 快速、敏感、特异, 在这些疾病的临床诊断方面具有重 要的应用价值。 在本试验中由于PRV 的G+ C% 含量高达73% , 普通的酶和Buffer 不能对此序列进行很好地扩增, 故 选择了 GC Buffer 和 LA T aqase 对 CSFV、PPV 和PRV 模板进行 PCR 扩增。由于 GC Buffer 中 91　　Ch inese Journal of V eterinary M edicine　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 中国兽医杂志 2005 年 (第41 卷)第10 期 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 不同剂量柔嫩艾美耳球虫感染对雏鸡脾重 与血清NO 含量的影响 包永占1, 史万玉1, 秦建华1, 赵炳芳2, 李祥利1, 李呈敏1, 包永玉3 (1. 河北农业大学动物科技学院, 河北 保定 071001; 2. 廊坊职业技术学院, 河北 廊坊 065000; 3. 河北省玉田县畜牧局, 河北 玉田 064100) 中图分类号: S858. 315. 9　　文献标识码: B　　文章编号: 052926005 (2005) 1020020202 　　近年来, 球虫免疫的研究成为一个热点, 诸多实 验结果表明, 脾脏和体内的NO 在寄生虫感染和免疫 过程中发挥重要的作用。早在1990 年Green 就提出, 巨噬细胞和肝细胞内受细胞因子诱导生成的NO 属 于由细胞内感染引发的非特异免疫机制。本研究以人 工感染发病的方法, 研究了不同剂量的柔嫩艾美耳球 虫在感染雏鸡后的第 5、7、10、14 天脾脏相对重量和 血清中的一氧化氮的变化情况, 以揭示脾脏和一氧化 氮在抗球虫感染中所发挥的作用, 为鸡球虫的非特异 性免疫防治提供依据。 1　材料与方法 1. 1　试剂　E. tenella孢子化卵囊 (河北农大动物 收稿日期: 2004203211 项目基金: 河北农业大学青年基金 (200225) 作者简介: 包永占 (19712) , 女, 讲师, 硕士, 主要从事畜禽寄生虫 疾病的防治研究 科技学院寄生虫室) ; 一氧化氮 (NO ) 试剂盒 (南京建 成生物试剂公司, 批号: 20020909) ; 3. 8% 枸橼酸钠 抗凝剂 (自配)。 1. 2　实验动物　实验雏鸡为购自保定市鹿圆种鸡场 的1 日龄京白939。购进后于无球虫的消毒铁丝笼内 隔离饲养至15 日龄, 经粪便检查, 确认无球虫感染后 作为实验用鸡。 1. 3　主要仪器设备　SP2115 (721) 型可见分光光度 计 (上海光谱仪器有限公司) ; 微量进样器 (麒麟医用 仪器厂) ; SHA 2B 恒温振荡器; M P22000A 电子分析 天平 (北京精密仪表厂)。 1. 4　试验分组　从经预备期饲养至 14 日龄的雏鸡 中选取体重差别不超过±5 g 的健康雏鸡160 只。随 机分为4 组, 每组40 只。其中É 组为不感染对照组; Ê 组、Ë 组、Ì 组为感染组, 并于分组后的次日每组分别 感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊 1. 0×103 个ö只、1. 0×104 个ö只、5. 0×104 个ö只。 含有M g2+ , 所以在试验中未对M g2+ 进行优化。在 PCR 扩增过程中, 退火温度、循环次数、引物浓度、 dN T P 浓度等均对PCR 反应有不同程度地影响。提 高退火温度可以增强PCR 扩增的特异性, 而降低退 火温度可以减弱PCR 扩增的特异性; 循环次数越多, 特异性越差, 循环次数越少, 特异性越强; 提高引物浓 度和 dN T P 浓度可以减弱 PCR 反应的特异性, 降低 引物浓度和 dN T P 浓度可以增强 PCR 反应的特异 性[10 ]。所以, 在确定PCR 反应条件时, 要充分考虑到 这些因素, 以确保PCR 扩增的效果。 利用所建立的3 种病原体的单重PCR 诊断方法, 对2002 年9 月至2003 年4 月牡丹江、鸡西、密山和虎 林地区送检的 27 头份流产母猪所产仔猪的死胎、木 乃伊胎及弱小仔猪进行检测, 并利用兔体接种试验、 兔体交叉试验和PPV H I试验进行对比, 结果发现27 份病料中有17 份为CSFV 阳性、4 份为PPV 阳性、6 份为PRV 阳性, 没有发现2 种或3 种病原体混合感染 病例, 与对照试验阳性符合率为100%。 参考文献: [ 1 ]　殷震, 刘景华主编 . 病毒学 (第二版) [M ]. 北京: 科学出版社, 1997. 6522657, 99821009, 115021155. 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