液相色谱仪检定规程

酶组织化学掌握内容酶组织化学的基本原理光镜酶组织化学的基本几种重要的酶组织化学方法概述酶的组织化学利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法特点：①在原位②检测酶的活性而不是酶分子本身酶组织化学发展历史1940-1950年：酶组织化学发展的黄金时期创立了金属盐法、偶联偶氮色素法50年代后：电镜酶组织化学将超薄切片法和电镜技术应用到酶组织化学上，获得了酶的更精确的定位60年代后期：免疫组织化学利用抗原抗体特异性反应来定位酶蛋白电镜免疫组化酶的种类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶（裂解酶）5.异构酶6.合成酶（连接酶）目前，能用酶组织化学方法显示出来，并可进行定性、定位和定量的酶较少，仅200余种，因此潜力巨大。（一）酶的特性水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强酶组织化学反应的基本知识（二）酶的定位酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位如：5’-核苷酸酶——浆膜ATPase——肌球蛋白细胞膜线粒体（三）酶组化的基本条件同时保存结构和酶的活性保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度PH值抑制剂激活剂基本原理细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物），然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物，该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在（四）原理及一般原则第一反应：酶促反应底物初级反应产物（PRP）不可见第二反应：捕捉反应PRP+捕捉剂终反应产物（FRP）酶*PRP弥散：1.底物在酶催化下反应的速度2.PRP在缓冲液中的弥散系数3.PRP与辅助物反应的速度应选择合适的底物和辅助物,减少弥散一般原则对组织处理,制片过程不能影响酶活性及分布所选底物和辅助物必须迅速、同步穿透入组织和细胞中所选底物最好只能被一种酶催化分解(一个底物可能同时发生几种酶反应，为获得特异酶反应，必须使用酶抑制剂或酶激活剂进行鉴别。)一般原则4.所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性5.PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物6.所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合(五)酶组织化学的主要步骤1、固定或不固定的标本2、切片(冷冻或不冷冻)3、孵育4、显色5、显微镜下观察（六）各步骤注意问题检测方法的选择酶的保存与固定一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片(-70℃长期保存；可用［丙酮∶氯仿=1∶1］4℃，5～10分钟稍固定)固定剂:抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂；慎用醛类固定方法:浸泡固定灌流固定固定温度:0—4℃3.切片制作:切片厚度<40um，一般8～12um4.缓冲液选择缓冲液用于A.配置固定液B.漂洗液C.配置酶反应孵育液选择缓冲液应注意A.不能减弱目标酶的活性B.不能含有与捕捉机制相同的物质C.注意漂洗用缓冲液的渗透压D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同5.孵育反应A.孵育液配置:底物浓度量要足够1∶20(V/V);孵育液只能用一次，配制时要适量配制孵育液的要求⑴清洗器具，过酸冲洗。⑵现用现配，保持新鲜。⑶严格配比，保持平衡。⑷防止污染，过滤为佳。⑸优选试剂，注意纯度。 5.孵育反应B.孵育的温度和时间:37℃15-30minC.切片孵育法-切片孵育-漂浮孵育6.酶特异性对照实验用酶活性抑制剂采用无底物的孵育液过固定或加热用针对目标酶的激活剂改变孵育液底物选择PH酶细胞内的定位差异对结果的分析应考虑的问题1、经过冻结和固定后，酶究竟能保存多少？2、酶是否在原位？3、反应中酶起了多少作用？4、酶的活性是否代了细胞生活时的状态？5、沉淀的产物是否能代表酶本身，时间延长，会不会改变？有没有扩散移位？显示酶的组织化学方法一、金属离子沉淀法（金属－金属盐法）金、银、铜、铁、铝、钴等金属利用某些金属本身具有颜色或其化合物具有颜色（硫化钴，黑色；硫化铅，棕黑色等）原理：以酶作用于底物时，分解产物与底物混合液中的某种物质结合，沉着在作用的局部，接着用金属置换结合物质，通过金属显色来证明酶的反应。优点：反应迅速，沉着颗粒微细，色调美丽，且由于金属离子的高电子密度而可用于电镜组织化学研究。缺点：金属盐的移动、扩散和吸附现象一般用于显示磷酸酶。如：AKP，ACP，G-6-Pase、ATPase、TPPase、ACase碱性磷酸酶（AKP）碱性条件下（pH9.0-9.6）催化各种醇和酚的磷酸酯水解激活剂：Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+抑制剂：半胱氨酸、氰化物、砷酸盐定位：转运功能活跃的细胞膜，广泛存在于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、肝、脾、乳腺及卵巢。碱性磷酸酶（AKP）——钙钴法〔原理〕以天然存在的β—甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。碱性磷酸酶（硫化钴法或钙钴法）若将磷酸钙浸渍于硝酸银溶液，则置换成磷酸银然后用其还原剂使其产生银反应，称为硝酸银法或银反应法1、上述方法有两个阶段：酶作用产物沉着阶段，金属置换的第二阶段，称为二步显示法（孵育后偶联法）优点：是可以充分满足这两种反应的最适PH；有时酶促底物的水解反应要求较长的孵育时间，而有些各自要求的辅助物在这段时间中已开始分解，用二步显示法可避免此不足。局限性：是要求PRP停留原位不发生弥散。〔方法〕标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片，厚8微米。固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃2－5′①切片标本入下列孵育液中，37℃，时间摸索孵育液：3％β—甘油磷酸钠底物2％巴比妥钠调PH2％氯化钙（无水，或硝酸钙）沉淀剂2％硫酸镁激活剂蒸馏水将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4②流水流水洗2分钟后→入蒸馏水③入2％硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟）④流水洗5分钟，入蒸馏水。⑤入0.5硫化胺，2分钟。⑥流水洗10分钟，入蒸馏水。⑦入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟⑧流水洗5分钟→蒸馏水。⑨甘油明胶或Apathy糖胶封固结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛纹状缘和血管内皮出现棕黑色或黑色的硫化钴沉淀，显示AKP活性强。评价：此法反应产物可发生扩散，定位欠准确；肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法X100肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法X200大鼠小肠绒毛吸收细胞呈深棕色对照①无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3％β—甘油磷酸钠，其余各步进行同上。②加热灭活酶活性。③加抑制剂，左旋咪唑0.1～1.0mmol/L注意事项①〔Ca2+〕要足量②用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性③有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色素）出现，可影响结果。④也可用石蜡切片，（石蜡切片可显示大多数水解酶）★本法可用显示：5—核苷酸酶、肌蛋白ATPase、AKP金属离子沉淀法2、同步法细胞中的酶催化底物水解生成的分解产物立即与金属离子反应成为有色不溶的沉积在原位以显示酶的存在。如：酸性磷酸酶——铅法铅法——显示酸性磷酸酶(ACP)〔原理〕以β—甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被ACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅沉淀。在被S2-置换，最终生成硫化铅棕色沉淀。酸性磷酸酶——硝酸铅法要求：在底物溶液中的H＋浓度为弱酸性的条件常用硝酸铅或醋酸铅应用：酸性磷酸酶和在中性附近其作用的磷酸酯酶类。最早把本法应用于酸性磷酸酶的是Gomori（1941），也称为硫化铅法该方法金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应色调美丽，反差比较鲜明。※ACP的特性①PH4.5～5.5适宜②激活剂：Mn2+③抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。〔ACP定位〕①溶酶体（颗粒状）内；②溶酶体外ACP存在于ER和胞液。③该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。方法：标本：大白鼠肾、肝恒冷箱切片，6-8微米固定：本实验不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）2～5min或10％福尔马林钙10min步骤：①入孵育液中37℃孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH4.7—5.00.24％硝酸铅3％β—甘油磷酸钠要求完全透明后，过滤备用（可用Tris－顺丁烯二酸缓冲液或乙酸巴比妥缓冲液）②于37℃蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温蒸馏水洗）③入5％硫化胺，1～2分钟。④流水冲洗3～5分钟后，换蒸馏水。（可用苏木精复染核）⑤用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。结果酶活性部位→棕黑色硫化铅沉淀。分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒对照：1、孵育液内加0.01MNaF2、去底物实验肾小管上皮细胞注意事项①铅离子的浓度是关键问题，没有底物，有些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF抑制酶活性→排除假阳性反应。②孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。［应用范围］“铅法”适用于：ACP，5’-核苷酸酶、G—6—P酶;膜ATPase、Mito—ATPase、TTPase（硫胺素焦磷酸酶）显示酶的组织化学方法二、偶联偶氮色素法（偶氮色素法）指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的定位。（二）偶氮偶联法（偶氮色素法）1.原理底物混合液PRP与不溶性重氮盐结合偶氮色素2.方法同时偶联法后偶联法酶偶氮偶联显示酶的组织化学方法重氮盐种类不同，其偶氮颜色多样（蓝色、紫色、红色、褐色、黑色、棕色等）重氮盐还有不同程度的抑制酶活性作用，故必须选用其中抑制作用最弱的种类使用。常用底物萘酚AS-BI萘酚AS-D萘酚AS-MX萘酚AS-TR常用重氮盐坚牢兰RR坚牢兰B坚牢红RC坚牢红TR坚牢紫B六偶氮副品红六偶氮新品红应用：可显示ALPase,ACPase,酯酶,转肽酶,肽酶,β-葡糖苷酶等偶氮色素法分类（一）同时偶联法在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉积物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。（二）后偶联法为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。偶氮偶联法显示ACP［原理］以奈酚的衍生物磷酸酯为底物，在酸性PH（5.2）下，经酸性磷酸酶水解释放出萘酚AS—BI，立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。方法标本：大白鼠肾、肝恒冷箱切片，厚8-10微米。不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液内，4℃，2～5min①标本入下列孵育液，37℃，30～60分钟。孵育液：磷酸奈酚AS—BI二甲基亚砜（溶剂）六氮化对品红缓冲液充分混匀并过滤②蒸馏水洗③入Mayer苏木精内染1分钟。④流水冲5分钟后入蒸馏水。⑤用Apathy糖胶或甘油明胶封固。［结果］酶的活性部位呈红色，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶X400［对照］用抑制剂NaF浓度为10mmol/L［注意事项］①六氮盐浓度不能太高②背景会略带黄色显示酶的组织化学方法三、色素形成法在酶作用下使无色化学物质在局部形成色素沉着1、四唑盐法2、联苯胺色素法3、靛酚蓝法（吲哚酚法）显示酶的组织化学方法（一）四唑盐法含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合，形成红色或蓝色的甲臢或二甲臢色素。四唑盐法用于显示氧化酶和脱氢酶原理:四唑盐或双四唑盐氢离子与与底物混合液无色四唑盐结合红色或兰色的沉淀脱氢酶+2H被还原常用四唑盐种类三苯四唑氯化物TTC蓝四唑盐BT新四唑盐NT硝基蓝四唑NBT四硝基蓝四唑TNBT噻唑蓝MTT以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（NBT）为受H体，其接受H后被还原成紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性。四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶※琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富△抑制物：丙二酸盐（竞争抑制）——对照【孵育液】0.1M琥珀酸钠,0.1M磷酸盐缓冲液NBT(硝基蓝四唑)【步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片2.孵育液15-35分钟3.生理盐水洗4.Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟5.入80%乙醇5分钟6.甘油明胶封固【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶X400思考题：在细胞培养中，常用的MTT法测定细胞活性，用的是什么原理？检测的是什么酶？显示酶的组织化学方法（二）联苯胺色素法检测过氧化物酶酶作用释放的氧使无色的联苯胺脱氢而形成有色的联苯胺蓝，再形成联苯胺褐。【结果】酶活性处呈棕色过氧化物酶催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺，DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀【作用液】DAB，Tris-Hcl缓冲液，H2O2【结果】酶活性处呈棕色小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶*400白血病涂片-过氧化物酶X400显示酶的组织化学方法（三）靛酚蓝法（吲哚酚法）用于检测氧化酶，也可用于细胞色素氧化酶和过氧化物酶等。把二甲基－对－苯二胺和α－萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放的氧与此二者发生结合，形成靛酚蓝，而显示出酶的定位。如细胞色素氧化酶显示酶的组织化学的其他方法色素底物法——是将有的色素盐类作为酶的底物，它本身不染组织细胞，但在酶的作用下分解出来的色素却能沉着于酶所在部位。底物标记法——是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在部位，通过各种方法对此进行检测。酶组织化学的应用了解组织、细胞的代谢活动细胞类型的判断了解细胞定位用于肿瘤的研究用于免疫组化和杂交组化的显示手段要求掌握的酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶葡萄糖－6－磷酸酶三磷酸腺苷酶乳酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶过氧化物酶法