琼脂糖凝胶电泳相关技巧
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琼脂糖凝胶电泳实验技巧
核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因
而带负电荷,电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子,
使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,从而...
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琼脂糖凝胶电泳实验技巧
核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因
而带负电荷,电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子,
使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,从而
达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速,通过调整其使用浓度,使得分辨率达到大多数实验的要求,因此
成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用
。
一、操作过程中要注意以下一些问题。
1、凝胶制作
1.1 凝胶浓度
凝胶的浓度据实验需要而变 ,一般在 0.8%~2.0%之间,没用完的凝胶可以再次融化,但随着融化次数的增加,
水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定。补水办法:一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶
后补充相应的水分至原刻度;二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶
条件得出一个经验补水值,以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化
的琼脂糖中,终浓度为 0.5t*g/ml;也可在电泳结束后染色。
1.2 梳板的选用
一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板,梳齿宽厚,形成的点样孔容积较大,用于 DNA 片段回收实验等;
相反,梳齿窄而薄,形成的点样孔容积就较小,用于 PCR 产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少
而定,一般来说,上样量小时尽量选择薄的梳板制胶,此时电泳条带致密清晰,便于结果
。另外,每次制胶时都
要注意梳齿与底板的距离至少要 1 mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孔底层,导致点样后样品渗漏。当然,点样孔的破
坏还与拔梳板的时间和方法有关,一般凝胶需冷却 30 min 以上方可拔梳板,应急的情况下可以将成型的凝胶块放 4℃
冰箱中冷却 15 min 左右,拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中,然后垂直向上慢慢用力,因为有
液体的润滑作用,梳板易拔出且不易损坏点样孔。
2、点样
在样品中加入上样缓冲液,上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度,使样品沉入孔底;上样缓冲液中一般还含
有两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂,DNA 染色剂是溴化乙锭,而且要在紫外光的激发
下才能看见桔红色荧光),用于指示样品的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为 6×(10×),
示其浓度为工作浓度的
六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直对准点样孔,用另一只手帮助固定移液器
下端,移液器枪头(Tip)尖端进入点样孔即可将样品注入孔内,千万不可将 Tip 尖插至孔底。同时点上适合的 DNA 分子
量标准,所谓适合是指样品 DNA 分子量大小应基本在 DNA 分子量标准范围之内。
3 电泳
将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连,负极与负极相连。核酸带负电荷,从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲
液与制胶用电泳缓冲液应相同,电泳缓冲液刚好没过凝胶 1mm 为好,电泳缓冲液太多则电流加大,凝胶发热。电泳时
所加电压一般不超过 5v/cm(指的是正负电极之间的距离,而不是凝胶的长度),电泳时间一般为 3O~60 min,根据实
验需要也可作适当调整。电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐,不够清晰;相反,电压降低,电泳
时间较长,核酸条带整齐清晰。 另外,如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动,请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。
4 结果分析
较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰,样品条带也整齐清晰。
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二、DNA 电泳常见问题分析
常见问题 原因 对策
DNA 降解 实验过程避免核酸酶污染
电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH 值上升,缓冲能
力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液
所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过 20V/cm,温度<30℃;巨大 DNA 链电泳,
温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
DNA 上样量过多 减少凝胶中 DNA 上样量
DNA 样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白
DNA 带模糊
DNA 变性 电泳前勿加热,用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA
对于λ/Hind III 片段
cos 位点复性
电泳前于 65℃加热 DNA 5 分钟,然后在冰上冷却 5分钟
电泳条件不合适 电泳电压不超过 20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液
不规则 DNA 带迁移
DNA 变性 以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA,电泳前勿加热
DNA 的上样量不够 增加 DNA 的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度
稍高,上样量可适当降低
DNA 降解 避免 DNA 的核酸酶污染
DNA 走出凝胶 缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度
带弱或无 DNA 带
对于 EB 染色的 DNA,所
用光源不合适
应用短波长(254nm)的紫外光源
小 DNA 带走出凝胶 缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度
分子大小相近的 DNA 带
不易分辨
增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度
DNA 变性 电泳前请勿高温加热 DNA 链,以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA
DNA 带缺失
DNA 链巨大,常规凝胶电
泳不合适
在脉冲凝胶电泳上分析
明日百傲衷心期望能与您合作双赢!
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