溃疡性结肠炎大肠湿热证患者MUC2、MUC5AC、TFF1、TFF3的表达及临床意义

福建中医学院 硕士学位论文 溃疡性结肠炎大肠湿热证患者MUC2、MUC5AC、TFF1、TFF3的 达及临床意义 姓名：郑璟慧 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合临床 指导教师：柯晓 20090501 溃疡性结肠炎大肠湿热证患者MUC2、MUC5AC、 TFFI、TFF3的表达及临床意义 作者姓名：郑瑕慧 中文摘要 目的：揭示溃疡性结肠炎大肠湿热证、脾胃气虚证患者及正常对照人群MUC2、 MUC5AC、TFFI、TFF3的表达规律。利用现代医学指标在分子水平探讨大肠湿热证的发病 生物学基础以及不同证型之间的关系，为临床诊疗提供理论基础。 ：临床上选择溃疡性结肠炎病例74例，其中48例大肠湿热证为研究组，26 例脾胃气虚证患者为对照组，另外选择10例人群为正常对照组。通过免疫组织化学显色 测定三组病例肠粘膜上皮中MUC2、MUCSAC及TFFI、TFF3等各项指标情况。 结果： 1、溃疡性结肠炎大肠湿热组及脾胃气虚组MUC2的表达均较正常对照组减少， 统计学上无差异(P>0．05)；大肠湿热组中MUC2强阳性表达率占41．67％，略高 于脾胃气虚组的38．46％，二者统计学上无差异(P>0．05)。 2、溃疡性结肠炎大肠湿热组及脾胃气虚组MUC5AC的阳性表达率均高于正常对 照组，大肠湿热组MUC5AC阳性表达率与正常组对比有显著性差异(P<0．05)， 脾胃气虚组MUCSAC阳性表达率与正常组对比无差异(P>0．05)，大肠湿热组与 脾胃气虚组MUC5AC阳性表达率对比无显著性差异(P>0．05)。 3、溃疡性结肠炎大肠湿热组TFFI阳性表达率12．5％，稍高于正常对照组10．O％， 二者统计学无差异(P>0．05)，脾胃气虚组TFFI无阳性表达，与大肠湿热组及正 常对照组对比无差异(P>0．05)。 4、溃疡性结肠炎大肠湿热组及脾胃气虚组TFF3的阳性表达均较正常对照组降 低，经统计学分析，均有显著性意义(P0．05)。 结论： l、溃疡性结肠炎大肠湿热组及脾胃气虚组MUC2的表达与正常对照组无差异，但 均较正常对照组减少，提示溃疡性结肠炎的MUC2生物合成减低。大肠湿热组、脾胃气 虚组MUC2表达无显著性差异，但大肠湿热组MUC2的强阳性表达率较脾胃气虚组略高， 这可能说明大肠湿热证和脾胃气虚证之间粘蛋白的表达呈递减的趋势，即肠粘膜的防御 保护功能下降，而这种递减可能提示了疾病发展的方向，可能对疾病的转归及临床治疗 提供有价值的预示。 2、溃疡性结肠炎大肠湿热组和脾胃气虚组MuC5Ac阳性表达率升高，大肠湿热组 MUCSAC的阳性表达率与正常组对比有显著性差异，提示了MUC5AC在大肠湿热证溃 疡性结肠炎的发生、发展中存在一定的关系，但其具体机制目前尚不清楚。 3、溃疡性结肠炎UC大肠湿热组中TFFl阳性表达率为12．5％，而脾胃气虚组TFFl 无阳性表达，提示溃疡性结肠炎脾胃气虚组正气已虚，肠粘膜防御功能减弱。 4、溃疡性结肠炎大肠湿热证及脾胃气虚证病例TFF3的阳性表达均较正常对照组下 降，有统计学差异；溃疡性结肠炎的大肠湿热证TFF3的阳性表达较脾胃气虚证稍高，可 能提示脾胃气虚组肠粘膜的防御保护功能下降，这种递减可能提示了疾病发展的方向， 同时，有报道用TFF3治疗胃肠粘膜损伤取得一定的疗效，可能为临床治疗溃疡性结肠炎 提供一个新途径。 主题词：溃疡性结肠炎大肠湿热脾胃气虚粘蛋白 三叶肽免疫组 织化学 2 StudyOnTheExpressionOfMUC2，MUC5AC，TFFl，TFF3In TheUlcerativeColitisPatientsWithLargeIntestineDamp—Heat Syndrome Postgraduate：ZhengJinghui ABSTRACT objective：TorevealtheregularityoftheexpressionofMUC2，MUC5AC，TFFl，TFF3 intheulcerativecolitispatientswithSyndromeoflargeintestineDamp-Heat，Syndromeof spleen·stomachQideficianeyandhealthypersons，toapproachthebiologicalbasisofthe pathogenesyofSyndromeoflargeintestineDamp—Heatandtherelationshipbetweenthe differentSyndromeDifferentiation—Typesusingmodemmedicinetargetsatthemolecular level，andtoprovideatheoreticalbasisforclinicaldiagnosisandtreatment． Methods：74casesofulcerativecolitiswereselected．Therewere48casesofSyndrome oflargeintestineDamp—Heat(LIDH)，26casesofSyndromeofspleen--stomachQi deficiency(SSQD)，and10commonpeoplewereselectedascontrolgroup．TheMUC2、 MUC5AC、TFF1、TFF3ofintestinalepitheliumwereobtainedbyimmunohistochemical technique． 。一 Results： 1．neexpressionofMUC2inUlcerativecolitisinLIDHgroupandSSQDgroupwere lowerthanthatinthenormalcontrolgroup，butthedifferenceWasnotsignificant(P>0．05)． ，nleMUC2expressionofstrongmasculinerateinLIDHgroup(41．67％)wasslightlyhigher thanthatinSSQDgroup(38．46％)，withoutsignificantdifferencep0．05)． 2．TheexpressionofMUC5ACinUlcerativecolitisinLIDHgroupandSSQDgroup werehigherthanthatinthenormalcontrolgroup，thedifferencebetweenLIDHgroupandthe normalcontrolgroupWassignificant(P<0．05)，butthedifferencebetweenLIDHgroupand thenormalcontrolgroupwasnotsignificant(P>0．05)，andthedifferencebetweenLIDH groupandSSQDgroupwasnotsignificant(P>0．05)． 3．nleexpressionofTFF1 inUlcerativecolitiswithLIDHwas12．5％，higherthanthat inthenormalcontrolgroupof10．0％，buttheywerenotsignificant(P>0．05)，ThereWasno expressionofTFFlinSSQDgroup，andthedifferencebetweenSSQDgroupandthenormal controlgroupwasnotsignificant(P>O．05)，thedifferencebetweenSSQDgroupandLIDH groupwasnotsignificant(P>0．05)． 4．TheexpressionofTFF3inUlcerativecolitisinLIDHandSSQDgroupswerelower thanthatinthenormalcontrolgroup，andthedifferencewassignificant(P<0．05)．Thestrong 3 masculineexpressionofTFF3inUlcerativecolitiswithLIDHwashigherthanthatinSSQD groups，butitwasnotsignificantdifferencebetweenthistwogroups(P>0．05)． Conclusion： 1．TheexpressionofMUC2inUlcerativecolitiswithLIDHandSSQDgroupswerenot differentfrombutbothlowerthanthatinthenormalcontrolgroup，whichmeansthe expressionofMUC2inUlcerativeColitisiSlowerthaninthenormalcontrolgroup．There WasnotsignificantdifferencebetweentheLIDHgroupandSSQDgroup，buttheexpression ofstrongmasculinerateofMUC2inLIDHgroupWassli曲tlyhigherthanthatinSSQD group，whichmayindicateadiminishingtrendoftheexpressionofMUC2inthistwo SyndromeDifferentiation．Types，whichmightpromptthedirectionofthedevelopmentofthe disease，andcouldprovideavaluablesignalforthediseaseprognosisandtreatment． 2．TheexpressionofMUC5ACinUlcerativecolitisinLIDHandSSQDgroupswere higherthanthatinthenormalcontrolgroup，thedifferencebetweenLIDHgroupandthe normalcontrolgroupwassignificant，whichsuggestedthattheexpressionofMUC5AC playedapartintheoccurrenceanddevelopmentofUCwithLIDHgroup，butSOfar，the reasonWasstillunfound． 3．TheexpressionofTFFlinUlcerativecolitis诚t11LIDHWas12．5％，butthereWasno expressionofTFF1 inSSQDgroup，whichcouldsuggestthatthehealthyqiofLIDHgroupis deficient，andthedefensefunctionoftheirintesfinalmucosadecline． 4．TheexpressionofTFF3inUlcerativecolitisinLIDHandSSQDgroupswerelower thanthatinthenormalcontrolgroup，andtheirdifferencewassignificant．Andtheexpression ofTFF3inUlcerativecolitisinLIDHgroupisslightlyhigherthanthatintheSSQD group，whichsuggestedthatthedefensefunctionofintestinalmucosainLIDHgroupislower thanthatinSSQDgroup．Itmightpromptthedirectionofthedevelopmentofthe disease．Meanwhile，itWasreportedthatTFF3couldcuretheimpairmentofgastrointestinal mucosa,whichcouldprovideanewwayforthetreatmentofulcerativecolitis． Keywords：UlcerativeColitis；LargeIntestineDamp·-Heat；Spleen-·Stomach QiDeficiency；trefoilpeptide；Immunohistochemistry 4 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作及所取 得的研究成果。据我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得福建中医学院或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：鞫暹为 签字日期．2。。了年1n矽日签字日期：20o1年 月≥／日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解福建中医学院有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读 学位期间论文工作的知识产权单位属福建中医学院。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权福建中医学院可以公布学位论文的全 部或部分

内容

财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容

，并编入有关数据库进行检索，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。(保密的学位论文在解密后遵守此规定) 本学位论文属于(必须在以下相应方框内打“√一，否则按一律按“非保密论文一处理)： 1、保密论文： 2、非保密论文 论文属于保密，在——年解密后适用本授权书。 位论文不属于保密范围，适用本授权书。 是否同意授权以下单位(必须在以下相应方框内打“√一，否则按一律按“同意授权打 处理)： ／ l、蜘司意授权 口不同意授权 清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”将本人学位论文进行电子和网络出 版，并编入CNⅪ系列数据库(《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和《中国知识 资源总库》)。 2、E晌意授权 口不同意授权 中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并 进行信息服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 本人签名： 导师签名： l ， ’ 彳厶儿 0 V1 月习日 ， 月、]日 f J卜年年 q，』l、、 D 8 O O 2 2期期 日 日字字签签 溃疡性结肠炎大肠湿热证患者MUC2、MUC5AC、TFFl、TFF3的表达及临床意义 —▲上．—．L 刖 百 溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)，习惯称为“非特异性溃疡性结肠炎’’， 是一种病因未明的肠道炎性病变Ⅲ，是大肠粘膜的慢性炎症和溃疡性病变，临床以腹泻、 粘液脓血便，腹痛为主要特征。其发病率在我国有逐年增高的趋势，成为一种较常见的 疾病。目前，由于该病病因和发病机制复杂，没有特异的诊断指标，鉴别诊断非常困难， 治疗缺乏特异性，导致病情迁延反复，甚至癌变死亡，严重影响患者的身心健康，被世 界卫生组织列为疑难病，引起医学界的普遍重视。 目前现代医学对本病发病原因及具体机制尚未探明，国内外研究认为一般涉及遗传 因素、免疫因素、感染因素、饮食因素、环境因素及精神因素等。环境、饮食、感染等 因素作用于遗传易感者，在肠道菌丛(或目前尚未明确的特异性微生物)参与下，启动了 肠道免疫及非免疫系统，最终导致免疫反应和炎症过程，可能由于抗原的持续刺激或(和) 免疫调节紊乱，这种免疫炎症反应表现为过度亢进或难于自限位圳，进而造成肠黏膜的损 伤。UC为反复发作的炎性病变，癌变的高危险性是无可争辩的事实，最近Meta分析中， Eaden等综合116个研究，显示UC的结直肠癌的发病率为3．7％左右，随着病情的迁 延，肿瘤的发病率也明显增加，20年后为9％，30年后为19％，总的结直肠癌的危险 性是正常人群20倍。 粘蛋白是一类由上皮细胞分泌的高分子量的糖蛋白，它是粘液凝胶的主要组成成 分，是一组高度糖化的不同糖蛋白的总称。主要起细胞保护、粘性维持、细胞识别作用，． 并且在肿瘤发生过程中，粘蛋白可影响肿瘤细胞的黏附力、免疫识别、转移和预后。人 的结肠粘蛋白是被一至少含9个基因的家族所编码的，其成员有MUCI'---MUC8，其中包括 MUC5B和删C5AC。正常结肠中最主要的是删C2，又成为肠型粘蛋白，研究发现在炎症性 肠病、大肠腺瘤及结直肠癌中删C2表达均有不同程度的减低；MUC5AC正常时主要表达于 胃粘膜的表面，又被称作胃型粘蛋白，在正常的大肠粘膜中几乎不表达，而在溃疡边缘 组织中可以表达，在大肠腺瘤和腺癌中常见不同程度的阳性表达。 三叶肽(trefoilpeptide，TFF)又名粘液结合肽，是近年来发现的一簇新型生长因 子，主要由乳癌相关肽(PS2或TFFl)、解痉多肽(SP或TFF2)和肠三叶因子(ITF或TFF3) 组成。三叶肽因其抗蛋白酶的特性和对粘液糖蛋白的高亲和力，而被认为在上皮细胞的 重组、修复过程中发挥重要的作用。根据目前的研究，三叶肽对胃肠黏膜可能的保护机 制为：形成并稳定黏膜屏障、调控黏膜上皮分化、调节免疫反应和促进胃肠黏膜重建。 三叶肽通过和粘蛋白相互结合，可增加粘液胶原的粘滞度，并增强上皮防御酸和食物诱 发损伤的能力，但是在病理条件下，上述表达有所改变，例女lBarrett食管和炎症性肠 病时，三叶肽和粘蛋白的这种协调作用下降。 UC在祖国医籍中，虽没有此病名，但其临床表现与泄泻、痢疾等病证相似。因所下 之物如涕如脓、粘滑垢腻，排出辟辟有声，故《黄帝内经》中称之为“肠辟"。因其病 程长久而缠绵，时愈时发，《诸病源候论》称为“久痢"、“休息痢”。现称“大瘕泄”。 本病病因，有感受外邪、饮食所伤、七情不和及脏腑虚弱等，病机为本虚标实，本虚为 福建中医学院硕士学位论文 脾肾虚弱，标实为湿、热、痰、瘀，病变部位主要在肠，涉及脾、胃、肾。UC的中医辨 证分型，临床上各个医家不尽相同，总的可以分为大肠湿热、脾胃气虚、肝郁脾虚、气 滞血瘀、脾肾两虚等五型，其中大肠湿热、脾胃气虚两型为临床最常见证型，现代医家 认为UC活动期以大肠湿热证为主，因外感湿邪，或因饮食不节、情志不畅，以致湿热蕴 结大肠，肠道气机不畅，传化失司，或湿邪聚而为痰，痰邪阻予肠络，故腹痛、腹泻、 肛门下坠；或湿热熏灼肠道，热盛肉腐，肠络受损，络破血溢，与气血相互搏结，气血 凝滞，血败肉腐，内溃成疡，故见黏液脓血便；舌苔(薄)黄腻仍湿热熏蒸之象。统计 我院近年来就诊的UC中，大肠湿热证占2／3以上。中医在对uC辨证分型的基础上，以中 医理论指导，积累了丰富的经验，填补了国内外治疗UC的空白，更好地体现了中医药治 疗常见病疑难病的优势。 杨春波等嵋3在福建省18所中医医院内科和西医医院中医科的400例流行病学调查中 发现，脾胃湿热证涉及中医7个系统的43种内科病，以脾胃占首位，西医11个系统72种 内科病，消化系统占第一位，炎症病种占58．7％，提示湿热证与炎症的关系密切，尤与 炎症以微循环障碍、渗出为主的急性期和亚急性期更为密切。目前的研究提示致炎细胞 因子与抗炎细胞因子之间的平衡失调可能是湿热证炎症的重要发病机制之一，湿热证粘 膜局部致炎因子增加，而粘膜保护因子减弱是其发病的主要机制，这与中医的“正气存 内、邪不可干"不谋而合。湿热证常处于疾病早期，正邪交争，邪实正不虚，湿热侵及 肠道，扰乱气血运行，而表现为一系列邪气盛的实证，如腹痛、里急后重明显，便下脓 血等，病情日久迁延，正气亏虚，便出现虚弱之象，如腹泻便溏，食少纳差，食后腹胀 等，此时的正气已虚，病机已发生改变。柯晓等晦1研究发现久泄脾胃湿热证组P16蛋白表 达显著低于脾胃气虚及正常对照组，认为久泄脾胃湿热证可能引起P16表达缺失，结肠 粘膜细胞增殖周期发生紊乱，向恶交方向发展；而且脾胃湿热由于特殊的病理状态，影 响了细胞的正常分裂周期，促使正常细胞发生不正常的转化，细胞过度分裂修复肠上皮 以对抗病变的发展，导致转化生长因子Q(TGFo)表达在脾胃湿热证阳性率明显增高。 综上所述，我们发现粘蛋白及肠三叶因子与UC及肿瘤关系密切，本课题的目的是 利用现代医学指标在分子水平探讨湿热证的发病生物学基础以及不同证型之间的关系， 为临床诊疗提供理论基础。因此，我们在前期慢性胃炎脾胃湿热证研究的基础上，再行 研究UC大肠湿热证的微观变化。我们拟运用免疫组化法分析MUC2、MUC5AC及TFFl、TFF3 的分布与表达，探讨MUG基因相关蛋白及三叶肽在UC湿热证患者中的作用，揭示其临 床病理意义，在中医辨证分型基础上为UC的临床诊断提供可能的客观指标，并可能为 UC提供一种新的治疗途径。 目前该研究在国内外尚未见报道。 6 溃疡性结肠炎大肠湿热证患者}IUC2、EAC5AC、TFFI、TFF3的表达及临床意义 材料与方法 一、病例选择： l、诊断标准"3： 1．1西医诊断标准(中华医学会消化病学分会炎症性肠病诊断标准2000年成都) 1．1．1临床表现：有持续或反复发作的腹泻、粘液脓血便伴腹痛、里急后重和不同 程度的全身症状。可有关节、皮肤、眼、口及肝胆等肠外表现。 1．1．2结肠镜检查：病变多从直肠开始，呈连续性、弥漫性分布，表现为：①粘膜 血管纹理模糊、紊乱、充血、水肿、易脆、出血及脓性分泌物附着。亦常见粘膜粗糙， 呈细颗粒状。②病变明显处可见弥漫性多发糜烂或溃疡。③慢性病变者可见结肠袋囊变 浅、变钝或消失，假息肉及桥形粘膜等。 1．1．3钡剂灌肠检查主要改变：①粘膜粗乱及(或)颗粒样改变。②肠管边缘呈锯 齿状或毛刺样，肠壁有多发性小充盈缺损。③肠管短缩，袋囊消失呈铭管样。 1．1．4粘膜病理学检查有活动期与缓解期的不同表现 I活动期：①固有膜内弥漫性、慢性炎细胞及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润。② 隐窝急性炎细胞浸润，尤其上皮细胞及中性粒细胞浸润、隐窝炎，甚至形成隐窝脓肿，_ 可有脓肿溃入固有膜。③隐窝上皮增生，杯状细胞减少。④可见粘膜表层糜烂，溃疡形 成，肉芽组织增生。 II缓解期：①中性粒细胞消失，慢性炎细胞减少。②隐窝大小形态不规则，排列紊． 乱。⑨腺上皮与粘膜肌层间隙增大。④潘氏细胞化生。 1．1．5手术切除标本病理检查可发现肉眼及组织学上UC的上述特点：在排除细菌性 痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸虫病、肠结核等感染性结肠炎及结肠CD、缺血性结肠炎。， 放射性结肠炎等的基础上，可按下列诊断标准诊断：①根据临床表现和肠镜检查三项中 之～项及(或)粘膜活检支持，可诊断本病；②根据临床表现和钡剂灌肠检查三项中之 一项，可诊断本病；③临床表现不典型而有典型结肠镜或钡剂灌肠改变者，也可以临床 拟诊为本病，并观察发作情况；④临床上有典型症状或典型既往史而目前结肠镜或钡剂 灌肠检查并无典型改变者，应列为“疑诊"随访；⑤初发病例、临床表现和结肠镜改变 均不典型者，暂不诊断uc，可随访3-6个月，观察发作情况。⑥完整的诊断应包括其临 床类型、严重程度、病变范围、病情分期及并发症。8类型：初发型、慢性复发型、慢 性持续型、暴发型。b临床严重程度分级：轻度：患者腹泻每日4次以下，便血轻或无， 无发热、脉搏加快或贫血，血沉正常。中度：介于轻度和重度之间。重度：腹泻每日6 次以上，明显粘液血便，体温在37．5℃以上，脉搏在90次／min以上，血红蛋[刍<1009／L， 血沉>30mm／h。c病变范围：可为直肠、直乙结肠、左半结肠、全结肠、区域性结肠受累。 d病情分期：活动期、缓解期。e肠外表现及并发症：肠外可有关节、皮肤、眼部、肝 胆等系统受累：并发症可有大出血、穿孔、中毒性巨结肠、癌变等。 1．2中医诊断标准(中国中西医结合消化病学分会重庆学术会议(UC辩证标准>>2003 年重庆) 7 福建中医学院硕士学位论文 1．2．1大肠湿热型主症：①腹泻粘液脓血便；②里急后重；③舌苔黄腻；④脉滑 数或濡数。次症：①肛门灼热；②身热；③下腹坠痛或灼痛；④口苦口臭；⑤小便短赤。 证型确定：具备主症2项(第一项必备)加次症2项；或主症第1项加次症3项。 1．2．2脾胃气虚型主症：①腹泻便溏，有粘液或少量脓血；②食少纳差；③食后 腹胀；④舌质淡胖或有齿痕，苔薄白；⑤脉细弱或濡缓。次症：①腹胀肠鸣；③腹部隐 痛喜按；③肢体倦怠；④神疲懒言：⑤面色萎黄。证型确定：具备主症2项加次症2项； 或主症第1项加次症3项。 2、纳入标准 ①符合中医、西医的诊断标准。 ②年龄】8—65岁 3、排除标准 ①不符合中医、西医诊断标准 ②患有细菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸虫病、肠结核等感染性结肠炎及结肠CD、 缺血性结肠炎、放射性结肠炎等疾病 ③年龄在18岁以下或65岁以上 ④妊娠或准备妊娠妇女、哺乳期妇女 ⑤合并心、脑、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病、精神病患 ⑥受试者不愿意参加试验或不配合治疗者 ⑦研究者认为不适宜参加临床试验者 二、一般资料： 1、正常对照组：选自福建省第二人民医院健康体检者，共10例，其中男8例，女2例， 平均年龄43．80±7．315岁，结肠镜下未见异常，病理结果正常。 2、UC大肠湿热组：选自福建省第二人民医院消化病专科，共48例，其中男27例，女 21例，平均年龄44．71±11．952岁，平均病程为1．37年。 3、UC脾胃气虚组：选自福建省第二人民医院消化病专科，共26例，其中男15例，女 11例，平均年龄48．42±11．741岁，平均病程为4．04年。 4、一般资料分析：三组间性别、年龄、病程比较，见表l。 表1 各组问性别、年龄、病程的比较 $注：性别采用x2检验。年龄符合正态分布，采用t检验。P>O．05，各组间性别、年龄无统计学差异，具町比性。 病程不符合正态分布。采用秩和检验，P60％为“卅’’。根据阳性细胞染色强度分 9 福建中医学院硕士学位论文 为：无着色为阴性“一”；淡黄色为弱阳性“+"；黄色为阳性“++”；棕黄色为强阳性 “+++”。 四、统计学分析： 应用SPSSl3．0统计软件，计量资料符合正态分布时用均数±标准差(x±S)描述， 并采用t检验；当计量资料不符合非正态分布时用中位数(M)和25％一--75％四分位数 (Quartiles)表示，采用秩和检验：计数资料用X2检验；等级资料采用秩和检验进行 统计学分析，P0．05。无差异。 脾胃气虚组与正常对照组比较：Z=-O．974，P=O．330>0．05，无差异。 大肠湿热组与脾胃气虚组比较：Z=-O．551，P=O．582>0．05，无差异． 2、大肠湿热组、脾胃气虚组与正常对照组三者MUC5AC阳性表达情况分析：见表3 表3 三组MUC5AC阳性表达情况比较 ·注：经秩和检验，结果如下： 大肠湿熟组与正常对照组比较：Z=-2．106，P=O．035<0．05，有显著性差异 脾胃气虚组与正常对照组比较：Z=-I．641，P=O．101>0．05，无差异． 大肠湿热组与脾胃气虚组比较：Z=-I．077，P=O．282>0．05，无差异。 3、大肠湿热组、脾胃气虚组与正常对照组三者TFFl阳性表达情况分析：见表4 表4 三绝TFFl阳性表达情况比较 ·注：经秩和检验。结果如下： 福建中医学院硕士学位论文 大肠湿热组与正常对照组比较：Z=-O．255．P=O．799>0．05，无差异． 脾胃气虚组与正常对照组比较：Z=-I．612，P=O．107>0．05，无差异． 大肠湿热组与脾胃气虚组比较：z：一1．866，P=O．062>0．05，无差异。 4、大肠湿热组、脾胃气虚组与正常对照组三者TFF3阳性表达情况分析：见表5 表5 三组TFF3阳性表达情况比较 ·汪：经秩和检验。结果如F： 大肠湿热组与正常对照组比较：Z=-2．171，P=O．030<0．05。有显著性差异． 脾胃气虚组与正常对照组比较：Z=-2．471，P=O．013o．05，无差异。 (二)MUC2、5AC及TFFl、TFF3免疫组织化学染色在结肠粘膜内的分布和定位：(1)以 PBS代替一抗为阴性对照，免疫组化染色均为阴性。(2)MUC2主要定位在细胞浆，阳性 表达部位主要在结肠腺体上皮和粘膜上皮。正常对照组中IVlUC2主要呈强阳性和阳性， 脾胃气虚组及大肠湿热组MUC2表达减弱，大肠湿热组强阳性表达稍强于脾胃气虚组。(3) MUC5AC粘蛋白阳性表达部位主要在结肠腺体上皮的细胞质，正常对照组中无阳性表达， 大肠湿热组lVlUC5AC的阳性表达与正常对照组对比有显著性差异，大肠湿热组较脾胃气 虚组阳性表达率稍高，但二者统计学无差异。(4)TFFl在少部分的腺体中有阳性表达， 阳性部位位于胞浆，主要见于大肠的杯状细胞中。大肠湿热组TFFl阳性率稍高于正常 对照组，二者无差异；脾胃气虚组中TFFl均未见阳性表达，与大肠湿热组及正常对照 组对比无差异。(5)TFF3阳性表达主要位于细胞浆中，正常对照组中主要在杯状细胞及 肠腺腺泡；TFF3在UC病例中呈局灶性表达，分布在杯状细胞及部分间质中，粘膜溃疡 的部分TFF3表达缺如；大肠湿热组及脾胃气虚组的TFF3的阳性表达较正常对照组降低， 有显著性差异；而大肠湿热组及脾胃气虚组间TFF3的阳性表达无差异。 12 溃疡性结肠炎大肠湿热证患者MUC2、MUC5AC、TFFl、TFF3的表达及临床意义 分析与讨论 UC(Ulcerativecolitis，UC)是一种病因未明的肠道炎性病变Ⅲ，国外学者一般 认为UC是包括感染在内的环境因素作用于具有多基因缺陷的易感倾向个体，诱发异常免 疫反应而导致疾病心1。其发病率在我国有逐年增高的趋势，成为一种较常见的疾病，并 能引起癌变，已引起医学界的普遍重视。目前，由于该病发病机制复杂，诊断和治疗中 有大量问题亟待医学工作者解决。 一、UC肠粘膜上皮粘蛋白的表达情况及意义 近年来针对粘蛋白的研究较多，迄今已发现13种哺1，结肠粘蛋白主要在柱状上皮细 胞和杯状细胞的高尔基体内合成，人的结肠粘蛋白是被一至少含9个基因的家族所编码 的，其成员有MUCI'--MUC8，其中包括MLIC5B和MUC5AC。主要起细胞保护、粘性维持、细 胞识别作用，并且在肿瘤发生过程中，黏蛋白可影响肿瘤细胞的黏附力、免疫识别、转 移和预后。从总体看，粘蛋白可被分成两组：一为分泌性粘蛋白(muc2、muc5B、muc5AC、 muc6)，它以胶体形式存在于粘膜表面、胶体形式粘蛋白的主要基因编码作为一簇位于 llpl5．5染色体上。另一种为膜结合蛋白，存在于上皮细胞的表层，原来认为只有MUCl 一种以跨膜形式存在，但现在发现MUC3，MUC4也都以跨膜形式存在阻1。粘蛋白占粘液质 量的5％(水分占95％)，主要成分是一分子量1000---4000kD的糖蛋白，多经二硫键连接 成寡聚体结构。粘液有很高的粘滞性并常形成粘液弹性凝胶，这是由它的结构所决定的。 高含量的旷聚糖中含乙酰半乳糖胺，可与相邻的氨基酸产生空间相互作用，使粘蛋白分 子伸展成刚性的棒状；聚糖中大量的神经氨酸与硫酸残基上都带有负电荷，也有助于粘 蛋白形成伸展结构，从周围环境中吸收水分而影响粘液的流变学特性。此外，邻近聚糖 链上的不同糖基之间可形成分子内的非共价连接。这些因素都促使粘蛋白成为弹性凝 胶，在上皮细胞表面形成有润滑作用并抵抗机械破坏及肠腔内有害物质侵袭的保护层。 约1％结肠正常菌群分泌多种酶降解粘蛋白作为唯一的能量来源，故粘蛋白的合成和分 解处于动态平衡状态。当结肠出现病变时，粘蛋白的数量及结构发生相关改变，通过检 钡,Juc各组证型之间的粘蛋白表达，为临床诊疗提供理论基础。 1、MUC2在UC肠粘膜上皮细胞的表达意义及表达情况 MUC2基因是1989年由美国学者Gum等人自人小肠cDNA表达文库中克隆到的一种粘 蛋白核心肽基因，定位于11p15．3～15．5上，此基因的表达产物MUC2粘蛋白是一种分 泌性粘蛋白。由于其广泛表达于肠黏膜中，是结肠中最主要的粘蛋白，因此被称为肠粘 蛋白n剖，对肠道具有保护和润滑作用。Hoeblerul3的动物急性大肠炎实验表明：MUCl，4 的mRNA表达水平提高了3倍，MUC3mPoNA在结肠末端的表达提高了～倍，^fflC2则没有 改变；MUC2是UC中表达量最高的粘蛋白，其mRNA水平与正常对照类似，但其蛋白的水 平与炎症活性相关n2M133。Weissn钔发现在炎症性肠病中，MUC2，3的mRNA对于保持正常 上皮细胞的功能是不可缺少的。Tytgat等u司用带同位素标记的氨基酸对粘蛋白进行代谢 性标记，定量测定MUC2后发现：在正常结肠和UC结肠中，MUC2均是主要的粘蛋白，与 静止期UC和正常结肠相比，活动期UC结肠的MUC2生物合成显著减低至40％以下，但 13 福建中医学院硕士学位论文 MUC2mRNA水平不变，且与疾病状态无关。Hanski等n∞用SMUCAl探针原位杂交测定MUC2 mR—NA、抗体CCP58检测UC标本中的MUC2蛋白，得到同样结果。Weiss等n刀用RNA探 针进行原位杂交时发现MUC2是杯状细胞特异性的且与疾病的状态无关。VanKlinken 等n町对静止期UC和活动期UC及正常对照组MUC2进行了定量分析，结果显示：0一糖基 化的成熟MUC2在SDS—PAGE中位于550kD条带处；活动期UC的MUC2合成明显减少3 倍左右，导致粘蛋白总量也明显减少，用免疫反应评分法评价时却发现MUC2蛋白却显 著增加，而MUC2百分比保持不变；同时发现活动期UC的MUC2是低硫酸化的，且硫酸 化的MUC2是选择性分泌的。因此，已分泌的硫酸化MUC2含量可能通过特殊的补偿机制 而保持不变。Hanski等n们认为MCU2蛋白增加是由于缺陷性转录后修饰导致蛋白可探测 性增加的结果。上述研究可能较好地解释UC中结肠粘膜粘蛋白减少，导致结肠粘膜保 护作用减弱是UC发病的主要原因。于晓丽等啪3应用免疫组织化学染色发现30例正常结 肠直肠黏膜MUC2阳性表达，42例UC阳性表达明显下降，有显著性差异(P<0．01)。在 水肿区和邻近溃疡区的表面上皮、隐窝脓肿、隐窝上皮及上皮增生处表达明显减低。这 些炎症细胞与部位均与炎症反应、细胞因子密切相关，说明uC存在上皮细胞、巨噬细 胞、单核细胞的异常激活，细胞因子的表达失调，这一过程可能与MUC2含量减少，对 黏膜上皮的保护作用减弱有关。同时还发现MUC2的表达与病情活动性(病情轻重、内镜 分级、组织学分级)之间有一定关系。提示UC肠组织MUC2表达量可反映肠组织的损害 程度，对于UC病情的评估及治疗效果的判断，可能具有潜在的指导意义，这提示MUC2 的检测可能有助予病情活动性的观察及判断，可以作为病情活动性的一个指标。 此外，研究还发现在正常情况下，MUC2表达于肠道的黏膜上皮，而在大肠腺瘤、腺 癌中表达降低但¨。AjiokaY等∞1研究结果显示，MUC2粘蛋白在正常大肠粘膜的表达率为 100％，在大肠腺瘤表达率降低，且重度不典型增生比轻度不典型增生的腺瘤表达低， 但MUC2的表达与腺瘤的肉眼类型无关，MUC2在原发性大肠癌中的阳性表达率为45．2％ 汹1，呈下调趋势。UC为反复发作的炎性病变，UC是结直肠癌(CRC)的一种癌前疾病，其 并发CRC的风险较正常人群高20倍。Hara等口钔报道大肠腺癌组织中MUC2表达降低，MUC2 的表达下调，可能使肠道失去保护屏障，参与uc癌变的发生。张永萍等啪1研究UC和CRC 中MUC2、p53的表达，发现UC、CRC组织中MUC2阳性表达率分别为97．19％、81．03％，呈 下调趋势；p53阳性表达率分别为6．67％、45．76％，呈上调趋势，并且在CRC组织中， MUC2和p53的表达有一定关系，},ftJC2阳性表达的组织，p53多呈阴性表达，MUC2阴性表达 的组织，p53多呈阳性表达，指出UC的癌变可能由于反复的炎症刺激，肠道MUC2的粘液 保护屏障丧失，使野生型p53突变，突变型p53失去抑癌功能，细胞分裂增殖活性增高， 从而导致了癌症的发生。于秀文等陋叫研究发现在大肠正常粘膜、腺瘤、腺癌中， MUC2阳性率分别为100％、93．3％、58．3％，CDX2为90．0％、76．7％、31．7％，呈下调 趋势，并发现MUC2+CDX2+、MUC2+CDX2一、MUC2一CDX2+、MUC2一CDX2一，MUC2+CDX2+ 型与分化程度、浸润深度、Dukes分期以及生存期相关：MUC2+CDX2一型与淋巴结 转移相关；MUC2一CDX2+与临床病理因素不相关：MUC2-CDX2-型与分化程度、浸润 深度、淋巴结转移、Dukes分期以及生存期具有明显的相关性，提示MUC2、CDX2 14 溃疡性结肠炎大肠湿热证患者MUC2、MUC5AC、TFFl、TFF3的表达及临床意义 的下调表达可能参与了大肠腺癌的发生，MUC2+CDX2+、MUC2一CDX2一型大肠腺癌与 肿瘤的发生、发展、浸润及转移相关，对临床上判断预后具有较大的意义。 本研究中，UC大肠湿热组及脾胃气虚组MUC2的表达与正常对照组比较，统计 学上无差异(P>0．05)，但UC大肠湿热组及脾胃气虚组MUC2的表达强阳性率均低 于正常对照组，这与国内外研究报道的UC的MUC2生物合成减低结果一致，提示MUC2 可能参与UC的发病，但MUC2在UC中的具体作用机制尚不十分清楚，MUC2在UC中活化及 调节过程以及对炎性因子表达调控的具体过程等均有待于进一步研究。大肠湿热组和脾 胃气虚组MUC2阳性表达无差异(P>0．05)，但大肠湿热组MUC2强阳性率41．67％，略高 于脾胃气虚组的38．46％，大肠湿热证多处于疾病早期，邪正交争，邪盛正不虚，日久 正气耗损，脾胃气虚，MUC2作为一种肠粘膜的保护因子，属于中医“正气’’范畴，大肠 湿热证MUC2强阳性表达较脾胃气虚组稍高，可能提示大肠湿热组的炎症程度较脾胃气虚 组强，脾胃气虚组肠粘膜的防御保护功能下降，这种递减可能提示了疾病发展的方向， 有待于进一步研究。目前国内外研究还发现在正常粘膜、UC及CRC粘膜中MUC2呈下调趋 势，考虑MUC2可能参与了Uc癌变的发生，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。 2、MUC5AC在UC肠粘膜上皮细胞的表达意义及表达情况 粘蛋白MUC5AC定位于染色体llpl5．3～15．5_k。从人胃eDNA文库克隆到的MUC5AC长 约16．6kb，编码5525个氨基酸长度的肽链，有17个主要的区域构成，其中9个编码富含 半胱氨酸的区域，此区显示出MUCSAC与MUC2、MUC5B的相似性。该基因编码MUC5AC分泌 型粘蛋白，正常时主要表达于胃粘膜的表面，又被称作胃型粘蛋白。MUC5AC与MUC2一样 同属于胶状的粘蛋白，在正常的大肠粘膜中几乎不表达，而在溃疡边缘组织中可以表达 ∞3，在大肠腺瘤和腺癌中常见不同程度的阳性表达。Ishizu等堙81研究发现，MUC5AC在粘 液增生的结肠直肠癌中，其阳性表达率86％，在粘液增生的腺瘤中其表达为90％。肖春 卫等啪1采用免疫组织化学法的SP法，检i9llJ40例大肠黏液腺癌组织中黏蛋白l,fflCl、MUC2和 MUC5AC的表达。结果MUC5AC在大肠黏液腺癌中阳性表达率分别是77．5％。其阳性表达 与患者的肿瘤大小、分化程度无关。但MUC5AC的表达在浸润达浆膜层组、淋巴结转移组、 Dukes分期C+D期表达明显高于浸润未达浆膜层组、无转移组、A+B期组．提示MUC5AC的 表达与浸润程度、淋巴结转移及临床分期明显相关，随着浸润越深、淋巴结转移及临床 分期越高，而MUC5AC贝JJ表达明显上升，揭示了MUC5AC表达增高可预示大肠黏液腺癌细胞 的浸润转移潜能。国内外对溃疡性结肠炎MUC5AC的报道较少，且结果存在较大差异。Rob J等Ⅲ3应用免疫组织化学法检测溃疡性结肠炎MUC5AC的阳性率，结果发现正常对照组和 溃疡性结肠炎组肠粘膜MUC5AC均无阳性表达。Forgue—LafitteME等H73研究发现，憩室 炎中MUCSAC阳性率26％，结肠癌中MUC5AC阳性率为74％，溃疡性结肠炎患者10例中MUC5AC 均为阳性，提示MUC5AC可能做为癌前疾病和结肠癌的追踪指标。MUC5AC和CRC的发生有 密切的关系，UC属于CRC的癌前疾病，故UC和MUC5AC也可能有关。 本研究中，正常对照组MUC5AC未见阳性表达，UC大肠湿热组及脾胃气虚组MUC5AC 的阳性表达率均高于正常对照组，大肠湿热组MUC5AC阳性表达率与正常组对比有 福建中医学院硕士学位论文 显著性差异(P<0．05)，脾胃气虚组MUC5AC阳性表达率与正常组对比无差异(P >O．05)，大肠湿热组与脾胃气虚组MUC5AC阳性表达率对比无显著性差异(P> 0．05)。MUC5AC与UC的相关性分析，国内外学者在此方面的报道极少。本实验研究中， 正常组MUC5AC无阳性表达，与既往文献中报道的MUC5AC在正常大肠粘膜中几乎不表达相 吻合，大肠湿热组和脾胃气虚组MUC5AC阳性表达率升高，大肠湿热组MUC5AC的阳性表 达率与正常组对比有显著性差异，提示了MUC5AC在大肠湿热证溃疡性结肠炎的发 生、发展中存在一定得的关系f但其具体机制目前尚不清楚。UC属于CRC的癌前 疾病，研究发现结肠腺瘤及CRC中MUC5AC表达均升高，提示MUCSAC可能参与了肠 癌的发生、发展，其具体机制尚不清楚，大肠湿热组MUC5AC的阳性表达率为33．33％， 稍高于脾胃气虚组23．08％，是否提示大肠湿热证更易于癌变，有待于进一步研究分析。 二、UC肠粘膜上皮三叶肽的表达意义及表达情况 三叶肽(trefoilpepdde)又名粘液结合肽，是近年来发现的一簇新型生长因子，主 要由乳癌相关肽(PS2或TFFl)、解痉多肽(SP或TFF2)和肠三叶因子(ITF或TFF3)组成。 1982年Masiakowki等从乳腺癌细胞寻找雌激素诱导的信使RNAs时发现TFFl，同年 Jorgensen等在分离猪胰岛素时发现TFF2，1991年Suemori等从大鼠肠上皮细胞中发现肠 三叶因子，展DTFF3。TFFs是一组小分子可溶性蛋白，含有保守的三叶结构，这种结构由 38—39个氨基酸组成，其中6个半胱氨酸，形成3个二硫键，使整个肽链发生弯曲和折叠， 形成特有的袢状结构。TFFl和TFF3具有一个三叶结构，TFF2