自体骨髓间充质干细胞不同移植途径对脑冷冻伤大鼠神经功能改善的影响

中国临床神经外科杂志2010年3月第15卷第3期 Chin J Clin Neurosurg，March 2010，Vol. 15，No.3 【摘要】目的探索自体骨髓间充质干细胞（BMMSCs）不同移植途径对脑冷冻伤大鼠神经功能改善的影响。方法将Wistar大 鼠自体骨髓间充质干细胞在体外扩增并经Brdu标记后，通过颈内动脉和脑室系统注射移植入冷冻伤脑水肿动物体内，以免疫组 化和神经功能评分评价BMMSCs自体移植的疗效。结果经颈内动脉和脑室系统注射的Brdu标记的大鼠BMMSCs细胞可向脑损 伤区域迁移。经颈动脉注射BMMSCs治疗组和经脑室注射BMMSCs治疗组Brdu阳性细胞的数量和神经功能恢复的程度均高于 常规治疗组，且有明显统计学差异（P<0.05）。两移植组BMMSCs Brdu阳性细胞的数量和神经功能恢复的程度相比无明显差异 （P>0.05）。结论本实验研究提示，BMMSCs通过循环系统和脑室系统移植后可向脑损伤区迁移而发挥治疗作用，但二者无统计 学差异。 【关键词】 脑冷冻损伤；间充质干细胞；自体移植；疗效 【文章编号】 1009-153X（2010）02-0152-04 【文献标识码】A 【中国图书分类号】R 651.1+5; Q 813 Effect of the autogenous bone marrow mesenchymal stem cells transplanted with different ways on the nervous function in the rate with freeze-induced brain edema LIU Yang, XUE Hong-li, LÜ Zhan-ju. Department of Neurosurgery, General Hospital of Shenyang Command, PLA, Shenyang 110016, China 【Abstract】Objective To explore the effect of autogenous bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) transplanted with different ways on improvement of nervous function in the rats with freeze-induced brain edema. Methods After BMMSCs derived from the Wistar rats were proliferated by culture, BMMCS were marked with Brdu in vitro. The Brdu-marked autogenous BMMSCs were injected into the internal carotid artery or the ventricular system in the rats with freeze-induced brain edema. The nervous function was assessed by neurological score and the brain tissues were observed by immnohistochemical staining in all the rats. Results The Brdu-marked BMMSCs derived from the rats immigrated into the injured brain areas after the injection into the internal carotid artery or the ventricular system. The number of Brdu-positive cells in the injured brain areas and the neurological scores in both the BMMSCs transplatation groups were significantly more than that in the control group (P<0.05). There was insignificant difference in the number of Brdu-positive cells and the neurological scores between both the BMMSCs transplantation groups (P>0.05). Conclusion The autogenous BMMSCs marked with Brdu can immigrate to the injured brain area and exert the therapeutic effect on the injured nervous function after the injection of them into internal carotid artery and the cerebrally ventricular system in the rats with freeze-induced brain edema. 【Key Words】 Freeze-induced brain injury; Bone marrow mesenchymal stem cells; Autogenous transplatation; Curatie effect ● 实验研究实验研究 ● 自体骨髓间充质干细胞不同移植途径对脑冷冻伤 大鼠神经功能改善的影响 刘洋 薛洪利 吕占举 干细胞自体移植治疗重型颅脑损伤后遗症，是 当前医学研究的一个重要课题 [1]。本实验将Wistar 大鼠的自体骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）通过颈动脉注射 及脑室内注射移植到冷冻伤脑水肿动物体内，观察 BMMSCs自体移植对动物神经功能改善的影响，为 BMMSCs自体移植的临床应用提供实验基础。 1 材料和方法 1.1 主要实验材料 主要实验剂包括（1∶1）DMEM/ F12（1∶1）必需培养基（Hyclone）、胎牛血清（fetal bull serum，FBS；杭州四季清公司）、胰酶（Sigma）、溴脱氧 尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，Brdu；Sigma)、Brdu 鼠抗单克隆抗体（北京中山金桥公司）、CD34鼠抗单 克隆抗体（北京中山金桥公司）、CD44兔抗多克隆抗 体（北京博士德公司）和CD45鼠抗单克隆抗体（北京 doi:10.3969/j.issn.1009-153X.2010.03.011 作者单位：110016，沈阳军区总医院神经外科（刘洋、薛洪利、吕占 举） 基金项目：2007年沈阳市重大课题，自体干细胞移植治疗重型颅脑 伤后遗症的实验研究（1063134-3-00） 通讯作者：薛洪利，E-mail：xuehongli001@sina.com --152 中国临床神经外科杂志2010年3月第15卷第3期 Chin J Clin Neurosurg，March 2010，Vol. 15，No. 3 中山金桥公司）；主要实验仪器包括二氧化碳培养箱 （英国RS Biotech公司）；超净工作台（苏州安泰空气 技术公司）和荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）。 1.2 实验动物及分组 8周龄Wistar大鼠 48只，鼠重 140~160 g左右。经检疫符合国家实验动物标准(由 沈阳军区总医院动物实验中心提供)。实验动物分 组：A组（16只）：冷冻伤脑水肿模型－常规治疗组， 给予Brdu体内掺入，用于对照。B组（16只）：冷冻伤 脑水肿模型-颈动脉注射BMMSCs治疗组。C组（16 只）：冷冻伤脑水肿模型-脑室注射BMMSCs治疗组。 1.3 实验方法 1.3.1 大鼠自体 BMMSCs 的处理 ①大鼠自体 BMMSCs分离，纯化，扩增：大鼠经 10%水合氯醛 （500 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剪开右侧后肢皮肤，暴 露股骨，用20 ml注射器针头在股骨两端钻孔。用针 头弯成L型的5 ml注射器吸取DEME/F12（1∶1）完全 培养基（含15% FBS）5 ml，冲出大鼠骨髓腔内的骨髓 细胞，收集细胞悬液，缝合大鼠皮肤。将骨髓细胞溶 液接种于底面积25 cm2培养瓶内。加入适量DMEM/ F12（1∶1）完全培养基（含 15%FBS）。用全骨髓培养 法培养BMMSCs。待贴壁细胞生长融合达 80%以上 时，以 0.25%胰蛋白酶消化，1∶1传代[2]。②BMMSCs 的鉴定：BMMSCs用SP法鉴定。一抗为CD34单抗、 CD44多克隆抗体和CD45单抗，二抗为酶标记的兔 抗鼠 IgG。DAB显色，光学显微镜下观察，胞质着棕 黄色的细胞判定为阳性。镜下观察，在每个盖玻片 的中心和四周随机选择 5个视野，进行细胞计数并 镜下拍照记录，计算阳性细胞数 [3]。③BMMSCs的 Brdu标记及鉴定：在BMMSCs第三次传代时，培养液 内加入Brdu（终浓度为0.004 mg/ml）标记48 h。使用 SP法进行细胞免疫化学鉴定。一抗为Brdu单抗，二 抗为酶标记的兔抗鼠 IgG。DAB显色，光学显微镜 下观察，胞核着棕黄色的细胞判定为阳性。镜下观 察方法同上。 1.3.2 大鼠冷冻伤脑水肿动物模型的建立 按文献 [4]报道的方法建立大鼠冷冻伤脑水肿动物模型。冷 冻伤脑水肿动物模型建立后 1周进行神经学评分， 评定标准：①自发活动：3分，四周活动，探索环境， 至少到达三面墙；2分，活动稍迟疑，缓慢，但最终至 少探索一面墙；1分，饲养筐内缓慢活动，不探索筐 壁；0分，大鼠不活动。②四肢对称运动：3分，提尾， 四肢对称伸展；2分，左侧肢体伸展较右侧差；1分， 左侧肢体活动明显减少；0分，左前肢不活动。③前 肢运动：3分，前肢对称伸展，大鼠前肢行走对称；2 分，前肢伸展较右侧差，前肢行走受损；1分，左前肢 很少活动；0分，左前肢不活动。④攀登运动：3分， 紧握钢丝网，攀登迅速；2分，左侧握力差，攀登功能 受损；1分，不能攀登或趋向打转。⑤疼觉：3分，刺 疼时两侧对称灵敏；2分，左侧刺疼反映较右侧差；1 分，左侧刺疼无反映。⑥深感觉：3分，将大鼠前腿移 到桌子边缘时，两侧回缩反应灵敏；2分，左侧回缩反 应较右侧差；1分，左侧无回缩反映。6个项目完全 正常为18分，缺损最严重者得3分。症状越重，得分 越少。评分 9分以下（含 9分）的动物模型进入实验 组。 1.3.3 大鼠BMMSCs的移植 大鼠脑冷冻伤模型建立 后，每天分别按 2 g/kg和 0.2 mg/kg给予甘露醇和地 塞米松，连续7 d；第7天进行神经功能评定。①实验 组A：大鼠经过神经功能评定后，进行 Brdu体内掺 入，即将配制好的0.2 μmol/ml Brdu经过鼠尾静脉注 入大鼠体内，3次/d，共3 d。以了解自体内（内源性） BMMSCs的分裂增殖情况。②实验组B：按 1.3.1方 法麻醉固定大鼠后，分离大鼠右侧颈部颈外动脉，结 扎颈外动脉远端，用5号头皮针穿刺颈外动脉近段， 缓慢注入500 μl（含2×106大鼠自体BMMSCs）自体经 Brdu标记的BMMSCs悬液，留针 1 min，然后在穿刺 点近端结扎大鼠颈外动脉。拔除穿刺针，缝合大鼠 颈部皮肤。③实验组C：参照大鼠脑立体定向图谱， 使用立体定向仪（带 100 μl微量进样器），沿原建造 脑冷冻伤模型时的刀口，穿刺大鼠侧脑室，缓慢注入 100 μl（含 2×106大鼠自体 BMMSCs）自体经 Brdu标 记的BMMSCs悬液，留针 1 min。拔除微量进样器， 缝合大鼠头部皮肤。 1.3.4 实验结果处理 ①分别于移植后1周、2周、3周 和 4周，参照 1.3.2的方法对各组大鼠再进行神经学 评分。②在BMMSCs移植后1周、2周、3周、4周各处 死2只大鼠。方法：用4%多聚甲醛经大鼠左心室灌 注后，断头取脑，置4%多聚甲醛中固定24 h，冠状位 切取以损伤区域为中心的脑组织，包括侧脑室室管 膜下区、基底节区和海马在内的厚度 2 mm的脑组 织，石蜡包埋，连续切片，片厚2 μm。③用免疫组化 法进行Brdu染色，在光镜下观测大鼠脑内经Brdu标 记的 BMMSCs在移植后的存活、迁移及分化情况。 DAB显色，光学显微镜下观察，胞核着棕黄色的细 胞判定为阳性。镜下观察，在每个盖玻片的中心和 四周随机选择 5个视野，进行细胞计数并镜下拍照 记录（图1，2），计算阳性细胞数的平均值。 1.3.5 统计学处理 采用 SPSS12.0统计软件，用方差 --153 中国临床神经外科杂志2010年3月第15卷第3期 Chin J Clin Neurosurg，March 2010，Vol. 15，No.3 分析对实验数据进行统计学处理，以P<0.05为差异 有显著性。 2 结 果 2.1 大鼠 BMMSCs的鉴定 经反复鉴定，CD34为 (-)，CD44为(+)，CD45为(-)；CD44（+）BMMSCs的平 均阳性比率为 92.1%。 2.2 Brdu标记的BMMSCs的鉴定 经反复鉴定，Brdu (+) BMMSCs的平均阳性比率为 72.1%。 2.3 脑损伤区免疫组化 见1。 A组：第一、二、三、四周损伤区域均偶见 1-2个 Brdu阳性细胞。 B组、C组：在各周损伤区域可见散在的Brdu阳 性细胞，与A组相比均显著增多（P<0.05）。B组、C 组相比无明显差异（P>0.05）。 2.4 大鼠神经功能评定 见表2。 在移植后第3、4周，B、C组动物神经功能恢复显 著优于A组（P<0.05）。 上述实验结果表明，大鼠脑冷冻伤后，经颈动脉 和脑室内注射的 Brdu标记的大鼠自体 BMMSCs细 胞，可向脑损伤区域迁移，并发挥治疗作用。B组和 C组Brdu阳性细胞的数量和神经功能恢复的程度均 胞核红色为阳性，×100 胞核红色为阳性，×200 胞核红色为阳性，×100 胞核红色为阳性，×200 组别 A B C 视野数量 5 5 5 移植后不同时间Brdu阳性细胞数 一周 0.90±0.88 7.90±2.42* 8.40±1.90* 二周 0.90±0.99 9.10±2.02* 7.90±2.42* 三周 0.60±0.70 8.70±2.21* 8.80±1.93* 四周 0.70±1.06 8.10±1.85* 8.90±2.13* 表1 不同时期各处理组中脑损伤区Brdu阳性细胞数（个，x±s）的比较 注：与A组相应值比，* P<0.05 组别 A B C 动物数 8 8 8 损伤后评分 6.63±1.60 6.50±1.69 6.38±1.69 移植后不同时间神经功能评分 一周 7.38±1.60 7.50±1.51 7.25±1.04 二周 7.88±1.25 8.88±1.41 8.63±1.41 三周 8.25±1.39 10.13±0.99* 10.25±1.67* 四周 8.75±1.28 10.75±1.49* 11.25±1.75* 表2 不同时期各处理组中大鼠神经功能评分（分，x±s）的比较 注：与A组相应值比，* P<0.05 图1 B组大鼠组织Brdu标记的BMMSCs免疫组化鉴定（SP法） 图2 C组大鼠组织Brdu标记的BMMSCs免疫组化鉴定（SP法） --154 中国临床神经外科杂志2010年3月第15卷第3期 Chin J Clin Neurosurg，March 2010，Vol. 15，No. 3 无显著性差异（P>0.05）。 3 讨 论 BMMSCs是来源于骨髓的非造血干细胞，是中 胚层发育的早期间质干细胞，具有很强的自我更新 和多向分化潜能，其细胞分化类型受到其所处组织 微环境的诱导，在适宜的条件下可以跨胚层分化成 神经细胞。在体外实验中，BMMSCs在一定条件下 可以诱导分化为神经元和胶质细胞[5]。在体内实验 中将BMSCs注入新生大鼠脑内，发现这些干细胞最 终可以分化出神经元、神经胶质细胞、髓磷脂形成细 胞等脑组织的几乎所有主要细胞。BMMSCs还具有 迁移能力[6]，在损伤部位的“信号”作用下，能向损伤 部位迁移并聚集，细胞信号、细胞因子以及生存的微 环境都会影响到BMMSCs的迁移[7]。 在正常情况下，血-脑屏障能使脑和脊髓免受 内、外环境中各种物理和化学因素的影响，从而维持 相对稳定的状态[8]。脑脊液－脑屏障有类似作用。 脑损伤可以使血－脑屏障和脑脊液－脑屏障完 整性受到破坏[9]。脑外伤在光镜下可见伤侧脑组织 毛细血管破裂、出血、血管及神经元周围间隙增宽、 脑细胞间隙疏松化；脑皮质细胞间隙增宽，脑实质有 散在点、片状出血，神经元胞浆空泡化、尼氏小体消 失、胞核浓染，部分神经细胞固缩成三角形。脑外伤 后，电镜下能见到明显的脑组织细胞损伤；脑皮质内 可见毛细血管内皮细胞的连续性中断，红细胞渗漏 到血管外间隙；多数毛细血管的基底膜增宽，密度变 淡；毛细血管的周围胶质细胞足突肿胀，胶质膜增 厚，质地透亮，内质网扩张，有的胶质膜破溃，形成假 性细胞外间隙；相邻胶质细胞突起间隙亦见扩大[9]。 脑损伤对血－脑屏障和脑脊液－脑屏障结构的完整 性的破坏，为BMMSCs经过循环系统和脑室系统进 入中枢神经系统发挥治疗作用提供了结构基础。 本实验将Brdu标记的BMMSCs通过循环系统和 脑室系统植入冷冻伤脑水肿动物模型体内，免疫组 化发现BMMSCs对脑损伤灶有趋化作用，与损伤脑 组织相互作用，发挥其对神经损伤的修复、治疗作 用。这与文献[10，11]报道的相类似。本实验还证 实，BMMSCs通过循环系统和脑室系统进行自体移 植均能发挥明显治疗作用，这两种移植途径的疗效 无明显差异。 本实验从形态学和神经功能两个角度观察了 BMMSCs不同移植途径对脑冷冻伤后遗症治疗的影 响，为临床工作中骨髓干细胞移植途径的研究提供 了初步的实验基础。 【参考文献】 [1] Kan I, Melamed E, Offen D. 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