SNT 2767-2011 国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒反转录聚合酶链式反应检测方法
书书书
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
犛犖/犜2767—2011
国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒
反转录聚合酶链式反应检测方法
犚犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀
犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋
20110225发布 20110701实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
书书书
前 言
本标...
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中华人民共和国出入境检验检疫行业
犛犖/犜2767—2011
国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒
反转录聚合酶链式反应检测方法
犚犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀
犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋
20110225发布 20110701实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
书书书
前 言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫
局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、上海之江生物科技有限公司。
本标准主要起草人:关淳、郑夔、孙哲平、张霞、高旗利、宋锋林、刘培、贺艳、张海滨、邵俊斌。
Ⅰ
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国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒
反转录聚合酶链式反应检测方法
1 范围
本标准规定了国境口岸蚊类携带的乙型脑炎病毒的检测对象、生物安全要求、检测方法、结果
及处置。
本标准适用于对口岸蚊类携带的乙型脑炎病毒的检测及报告。
2
性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
乙型脑炎病毒 犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊
乙型脑类的病原体,为黄病毒属,具有包膜的单正链RNA病毒。乙型脑炎病毒颗粒呈球形,壳体
为20面对称体,内为含RNA的核心,包以含脂蛋白的封套,外面还有含糖蛋白的表面突出物,其表面
突出物具有血凝活性。
4 检测对象
国境口岸蚊类中能携带乙型脑炎病毒的成蚊及其幼蚊,如:白纹伊蚊、日本伊蚊及东方伊蚊等伊蚊,
三带喙库蚊、二带喙库蚊、魏仙库蚊、伪杂鳞库蚊、困扰库蚊、致倦库蚊、淡色库蚊及白雪库蚊等库蚊,中
华按蚊等按蚊。
5 实验室生物安全要求
5.1 实验室生物安全要求见GB19489。
5.2 下列操作应在生物安全2级(BSL2)实验室中进行:
———可能产生含病毒气溶胶的样品处理;
———收集或浓缩病毒;
———病毒RNA提取和扩增;
———离心管和离心机转头的封闭和开启。
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6 反转录聚合酶链反应检测
6.1 主要器材和设备
6.1.1 PCR仪。
6.1.2 电泳仪。
6.1.3 紫外凝胶成像仪。
6.1.4 台式低温离心机:10000犵。
6.1.5 组织研磨机或电动匀浆机。
6.1.6 低温冰箱:-80℃。
6.2 试剂
6.2.1 样品制备及RNA提取试剂:青霉素、链霉素、Hank’s液、裂解液、三氯甲烷、无RNase超纯水、
75%乙醇、异丙醇(未开封新品)、DEPC。
6.2.2 RTPCR反应试剂:上游引物P1(5’CATTCCAAGCGAAGCAGGAGATCC3’),下游引
物P2(5’GACGTCCAATGTTGGTTTGTCG3’),逆转录酶AMV(10U/μL),犜犪狇DNA聚合酶
(5U/μL),dNTP(2.5mmol/L),氯化镁溶液(25mmol/L),RNase抑制剂,10×PCR缓冲液,阳性对照
(乙型脑炎病毒弱毒疫苗,病毒效价不低于106PFU,用 Hank’s液复溶成2.0mL液体,取20μL加入
180μLHank’s液混匀制成取阳性对照),阴性对照,琼脂糖(
纯),溴化乙锭或其他有效染料,分子
量标记,5×TBE电泳缓冲液,6×加样缓冲液。
6.3 操作方法
6.3.1 样品采集
将采集的蚊虫标本冷冻致死,分类、分组(标本数量较多时可以30只~50只为一组),置-80℃低
温冰箱或液氮中保存。
6.3.2 样品制备
将待检蚊虫标本每组分别用含青霉素(1000U/mL)、链霉素(1000U/mL)的无菌生理盐水清洗三
次,每组蚊样加入2.0mLHank’s液,在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆20s~30s,使样品匀
浆成糊状,1000犵离心3min,取上清液作为样品。
6.3.3 犚犖犃抽提
6.3.3.1 为防止RNA降解,所用实验用具及溶液应无RNA酶,操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡
胶或乳胶手套,并经常更换,以避免皮肤表面的RNA酶污染用具或带入溶液。
6.3.3.2 取6.3.2中样品上清液200μL加入1.5mL无RNase离心管中,加入1mLTrizol或其他等
效裂解液,剧烈振荡30s,室温放置5min。同时将阳性对照、阴性对照同步进行RNA提取。
6.3.3.3 加入0.2mL三氯甲烷,用力振荡至乳剂状,室温静置5min,使水相和有机相分开,水相无色
在上,有机相红色在下。4℃10000犵离心15min,使水相和有机相彻底分开,吸出水相至新的1.5mL
无RNase离心管中,计量大致体积,注意不要吸到有机相。
6.3.3.4 加入与吸出水相等体积的异丙醇,轻轻混匀,室温静置5min。4℃10000犵离心10min,使
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RNA沉淀。
6.3.3.5 弃去上清液,加入1mL4℃预冷75%乙醇洗涤沉淀,4℃10000犵离心5min,去尽乙醇。
6.3.3.6 室温干燥5min~10min,将RNA溶解于10μL无RNase超纯水中,立即用于RTPCR检
测,或置于-80℃低温冰箱保存。
6.3.3.7 可使用商品化RNA提取试剂盒按照操作说明书操作。
6.3.4 犚犜犘犆犚检测
6.3.4.1 RTPCR反应液组成(总体积25μL):无RNase超纯水13.8μL,2.5mmol/LdNTP2.5μL,
10μmol/L上下游引物混合液1.5μL,25mmol/L氯化镁溶液1.2μL,10×PCR缓冲液2.5μL,AMV
反转录酶0.2μL,RNase抑制剂0.3μL,犜犪狇DNA聚合酶1.0μL提取的RNA2.0μL。
6.3.4.2 RTPCR反应程序:42℃45min,95℃3min;扩增条件为95℃30s,50℃40s,72℃40s,
35个循环后,72℃延伸10min。
6.3.5 电泳
用0.5×TBE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖电泳凝胶并趁凝胶未凝固时加入溴化乙锭或其他有效
染料使其最终浓度达到1μg/mL,制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面没过胶面。将7.5μL扩
增产物和1.5μL6×加样缓冲液混合,点样,其中一孔加入分子量标记。5V/cm恒压,电泳30min~
40min。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果,拍照并
结果。
6.3.6 结果判定
当阳性对照出现375bp目的条带,阴性对照未出现目的条带时,实验结果成立。被检样品未出现
预期大小的扩增条带时,可判定检测结果阴性;被检样品出现预期大小的扩增条带时,应对扩增产物作
测序分析,证实待测样品中病毒核酸序列与乙型脑炎病毒序列一致,则可判定检测结果阳性。
7 实时荧光犚犜犘犆犚检测
7.1 主要器材和设备
7.1.1 荧光PCR仪。
7.1.2 台式低温离心机:10000犵。
7.1.3 组织研磨机或电动匀浆机。
7.1.4 低温冰箱:-80℃。
7.2 试剂
7.2.1 样品制备及RNA提取试剂:见6.2.1。
7.2.2 实时荧光RTPCR反应试剂:一步法探针荧光RTPCR试剂,阳性对照(乙型脑炎病毒弱毒疫
苗,病毒效价不低于106PFU,用Hank’s液复溶成2.0mL液体,取20μL加入180μLHank’s液混匀
制成取阳性对照),阴性对照,上游引物P1(5’GCATCAAACAGCATATTGACACC3’),下游引物P2
(5’GGCGCTCTGTGCCTAGTAGC3’),探针(5’FAMCTG犆犜C犜A犜C犜C犃A犆ATCBHQ1下划线
斜体字母表示LNA修饰碱基3’)。
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7.3 操作方法
7.3.1 样品采集
同6.3.1。
7.3.2 样品制备
同6.3.2。
7.3.3 犚犖犃抽提
同6.3.3。
7.3.4 实时荧光犚犜犘犆犚检测
7.3.4.1 实时荧光RTPCR反应液组成(总体积25μL):一步法探针荧光RTPCR试剂(根据浓度不
同,体积有所差异),每条引物终浓度为1000nmol/L,探针终浓度250nmol/L,模板RNA量为5μL,无
RNase超纯水补足至25μL。
7.3.4.2 实时荧光RTPCR反应程序:45℃10min;95℃15min;再按95℃15s、60℃60s,循环
40次;单点荧光检测在60℃,反应体系为25μL。荧光通道检测选择:选用FAM通道。
7.3.5 结果判定
7.3.5.1 基线的设置
实时荧光PCR反应结束后进行结果分析时,应设置基线范围。基线范围选择一般在6个~15个
循环,如果有强阳性样本,应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以阈值线刚好超过正常阴性对
照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值不出现任何数值为准。
7.3.5.2 质控标准
阴性对照检测结果应为无荧光增幅现象,阳性对照品检测结果FAM通道Ct≤35,且曲线具有明显
的荧光增幅现象。以上指标有一项不符合均视为此次实验无效。若阴性对照出现荧光增幅现象,说明
在样品提取或反应体系中存在污染,可能出现检测结果假阳性;阳性对照结果无荧光增幅现象,说明反
应体系存在问题,检测可能出现假阴性结果。根据对照结果分析问题,重新检测样品。
7.3.5.3 结果判定
待检样品无荧光增幅现象,并且阳性对照、阴性对照结果正常者,可判定检测样品为阴性;待检样品
FAM通道Ct≤35,曲线有明显的荧光增幅现象,并且阳性对照、阴性对照结果正常者,检测结果报告为
阳性;待检样品FAM通道Ct值在35~40之间,重复检测一次,如果重复检测Ct值仍在35~40之间,
则判为阳性。
8 结果报告
根据检测结果,报告乙型脑炎病毒核酸检测阳性或阴性。
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9 阳性结果处置
出现阳性结果的相应标本应送有资质的实验室做复检或鉴定。确定阳性结果后应立即向上级主管
部门报告。
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1102—
7672
犜/
犖犛
中华人民共和国出入境检验检疫
行 业 标 准
国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒
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SN/T2767—2011
中 国 标 准 出 版 社 出 版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码:100045
网址 www.spc.net.cn
电话:68523946 68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷
开本 880×1230 1/16 印张 0.75 字数 11 千字
2011年6月第一版 2011年6月第一次印刷
印数1—1600
书号:155066·222050 定价 16.00 元
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