110例儿童急性呼吸道感染病毒病原学调查

110例儿童急性呼吸道感染病毒病原学调查 赵勤英 � 徐德顺 � 金文君 中图分类号: R725�6; R373�1� � 文献标识码: B� � 文章编号: 1007- 0931 ( 2011 ) 06- 0076- 03 作者单位: 湖州市中心医院, 浙江 � 湖州 � 313000 � � 急性呼吸道感染 ( AR I) 是导致发展中国家儿 童患病及死亡的常见疾病, 在发展中国家其致死率 占儿童死亡率的 30% , 近年来随着各种抗生素的 广泛应用, 呼吸道细菌感染已有所降低, 而呼吸道 病毒感染仍呈上升趋势 [ 1]。研究认为有 80%急性 呼吸道感染的致病原为流感病毒、副流感病毒和呼 吸道合胞病毒等。为了解湖州市儿童急性呼吸道感 染中病毒病原感染情况 , 我们在 2009年 12月 � 2010年 3月呼吸道疾病高发季节期间采集了 110 份 AR I患儿的咽拭子样本 , 并进行 12种常见呼吸 道病毒, 现将结果报告如下。 对象与 1 对象 依据急性呼吸道感染病例定义 [ 2] , 选取 湖州市中心医院呼吸内科、神经内科、心血管内 科、内分泌科、儿科、肿瘤科和感染性疾病科病房 以及重症监护室 ( ICU ) 作为病例来源研究科室, 采集患者咽拭子、气管吸取物、咽漱液和鼻洗液之 一。未使用机械通气的患者最好采集咽拭子或鼻拭 子, 使用机械通气的患者可采集气管吸取物。其中 咽拭子、鼻拭子采集后, 放入含 4 m l采样液的采 样管中; 气管吸取物采集 5m ;l 咽漱液和鼻洗液采 集 10m ,l 4 � 保存, 在 48 h之内送到湖州市疾病 预防控制中心实验室。 2 方法 病毒 RNA /DNA提取采用 V ira lNucle ic A cid K it ( Roche ) 核酸提取试剂盒, 按试剂盒说 明书提取病原体 RNA /DNA。逆转录反应: 按美国 Fermant公司试剂盒说明书操作, 37 � 90 m in, 94 � 2 m in, - 20 � 保存待用。 PCR检测: 使用 Seegene公司产呼吸道病毒检 测试剂盒, 每样本分别配制两管反应体系, 标记 A 管、B管, A管可检测人腺病毒 ( ADV )、偏肺病毒 (MPV )、人冠状病毒 229E /NL63、副流感病毒 1 ( PIV1)、副流感病毒 2 ( PIV2) 和副流感病毒 3 ( PIV3); B管可检测甲型流感病毒 ( FLUA )、乙型 流感病毒 ( FLUB )、呼吸道合胞病毒 A ( RSVA )、 呼吸道合胞病毒 B ( RSVB)、人鼻病毒 (HRVA /B) 和人冠状病毒 (OC43 /HKU1) ; 共计 12种常见呼吸 道病毒。PCR反应液中含 cDNA 3 � ,l 8MOP 3 �,l M asterM ix 10 �,l P rimerA、B各 4 � ,l 至终体积为 20 � l。置 Eppendorf PCR仪 94 � 15 m in; 94 � 30 s, 60 � 90 s, 72 � 90 s, 40个循环; 72 � 10m in。取 5 �l PCR产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳, 分析目的条带。 结 果 1 病毒检出情况 110份样本中共检出阳性样本 57份, 阳性率为 51�82% ( 57 /110)。因其中部分 样本为两种病毒混合感染, 故共有 73个阳性检出 结果, 在检出的阳性样本中 RSVB阳性率最高, 占 45�21% ( 33 /73) ; PIV次之, 阳性率为 31�51% ( 23 /73 ) ; FLUA 阳 性 率 为 9�59% ( 7 /73 ); HRVA /B阳性率为 4�11% ( 3 /73 ); 人冠状病毒 229E /NL63阳性率为 2�74% ( 2 /73) ; ADV阳性率 为 1�37% ( 1 /73) , 见表 1。 本研究所检测病毒中, 可同时检测 FLU、 RSV、PIV不同亚型。检出的 7份 FLUA经荧光 PCR检测分型, 全部为甲型 H 1N 1; 33份 RSV阳性 检出样本中 RSVB 32份, RSVA 1份, 表明湖州市 RVS的流行以 RSVB为主 , 但其流行病学意义有 待进一步研究。 PIV检测阳性样本中, P IV3为 20 份, P IV1为 3份、 PIV2未有检出, 表明湖州市儿 童副流感病毒感染中, 以 PIV3为主。 �76� 浙江预防医学 2011年第 23卷第 6期 � Zhe jiang P reventiveM edicine, Jun. 2011, Vol 23, No� 6 表 1 110例 ARI病毒检测结果 病原体名称 阳性份数 阳性率 (% ) 人呼吸道合胞病毒 B 25 22. 73 人副流感病毒 3 8 7. 27 甲型流感病毒 4 3. 64 人副流感病毒 1 2 1. 82 人冠状病毒 229E /NL63 2 1. 82 人呼吸道合胞病毒 A 1 0. 91 人副流感病毒 3 +人鼻病毒 A /B 2 1. 82 甲型流感病毒 +人鼻病毒 A /B 1 0. 91 人副流感病毒 3 +人腺病毒 1 0. 91 人副流感病毒 3 +人呼吸道合胞病毒 B 6 5. 45 人副流感病毒 3 +人副流感病毒 1 2 1. 82 人副流感病毒 3 +甲型流感病毒 1 0. 91 人副流感病毒 1 +人呼吸道合胞病毒 B 1 0. 91 甲型流感病毒 +人呼吸道合胞病毒 B 1 0. 91 合计 57 52. 77 2 不同性别病毒检出情况 男性患儿样本病毒检 出率为 52�38% ( 33 /63) , 女性患儿病毒检出率为 51�06% ( 24 /47), 经 �2检验 , 两者差异无统计学 意义 ( �2= 0�019, P> 0�05)。 3 各年龄段病毒检出情况 6个月 ~ 3岁患儿检 出阳性率最高, 为 65�31% ( 32 /49 ) , 其中以 RSVB 为最多, 为 36�73% ( 18 /49 ) ; 其次是 PIV3, 占 16�33% ( 8 /49)。第 2位是 6个月以下 患儿, 检出阳性率为 45�45% ( 5 /11 ), 均为 RSVB。3~ 6岁患儿中检出阳性率为 40�91% ( 9/ 22) , 其中以 RSVB为最高, 达 27�27% ( 6 /22)。 6岁以上患儿中检出阳性率为 42�86% ( 12 /28) , 其中以 PIV3为最高, 达 32�14% ( 9 /28); 其次是 PIV1占 10�71% ( 3 /28)。 4 混合感染 在 110份标本中, 两种以上病毒混 合感染 15份, 占 13�64% ; 其中 13份检出人副流 感病毒, 占混合感染总数的 86�67% ( 13 /15) , 见 表 1。 讨 论 急性病毒性呼吸道感染的实验室传统诊断主要 有免疫法测定抗原或抗体、病毒分离等方法, 这些 方法耗时耗力, 且特异性与灵敏度上都存在一些问 : 血清学检测往往需要采集发病早期和恢复期双 份血清进行检测分析才有意义, 由于从病毒感染到 抗体出现需要一定时间, 因此血清学检测用于疾病 的早期诊断灵敏度不高, 病毒分离是经典的试验方 法虽然准确、可靠、稳定, 但对标本中的病毒含量 要求高, 必需达到细胞培养法所需要的病毒含量, 而且对标本的采集、运输、保存的条件要求高, 试 验要求苛刻、繁琐、费时。要确诊至少要 10~ 15 d, 而且阳性率偏低。况且某病毒例如人鼻病毒、人冠 状病毒、副流感病毒等进行细胞分离培养也较困 难 [ 3] , 常常会出现具有典型临床症状和流行病学 支持依据的病例标本检测结果为阴性的情况, 不利 于该类疾病的早期诊断和疫情的应急处理。另外, 病毒合并感染现象普遍存在, 但由在细胞培养中存 在干扰现象, 难以检出标本中可能存在的病毒合并 感染对那些预后差的合并感染的早期诊断尤为不 利 [ 3]。因此, 近来在多重 PCR技术的基础上有应 用 Lum inex xMAP技术平台检测 7种常见呼吸道病 毒的报道 [ 4] , 但需检测杂交产物的特殊仪器。本 研究中采用的方法亦在多重 PCR技术基础上应用 DPO TM ( DSO TM ) 技术进行了引物, 消除了以 往多重 PCR中容易产生的非特异性条带的问题, 引物的高效性和 PCR产物大小所带来的矛盾也得 到了很好的解决, 大大地提高了反应的特异性, 同 时 DPOTM ( DSOTM ) 技术也消除了多重 PCR引物 的相互干扰, 提高了多重 PCR的敏感性 [ 5]。本样 本于湖州市中心医院采集, 结果显示急性呼吸道感 染患儿病原体以 RSVB、PIV为主, 与相关报道的 引起小儿急性呼吸道感染的病原体以 RSV为首的 检测结果相符 [ 6]。有研究认为急性呼吸道感染患 者中病原体以流感感染为主, 而感冒与鼻病毒有 关, 本调查中流感、鼻病毒检出率较低, 可能与本 次调查时间短、检出样品数少有关。以往研究表明 急性上呼吸道感染中存在多种混合感染模式, 本研 究结果显示在 16份混合感染中, 13份有人副流感 病毒检出, 占混合感染数的 86�67% ( 13 /15)。 对于急性呼吸道感染的治疗, 病原学诊断是关 键, 开展此方面的研究、了解各地区的病原谱, 对 于在治疗中有的放失, 克服严重的滥用抗生素现 象, 提高治疗效果具有重要的实际意义。病原学研 究不仅仅是单纯的微生物学研究, 而应该与流行病 学、免疫学、药物学、分子生物学研究结合起来, 推动其达到一个更深的层次。最好将病原体分离与 快速检测结合起来, 结论更准确, 对临床指导价值 更大。 �77�浙江预防医学 2011年第 23卷第 6期 � Zhe jiang P reventiv eM ed ic ine, Jun. 2011, Vo l 23, No�6 参考文献 [ 1] 李海珠, 吕波, 林志方, 等. 小儿急性下呼吸道感染病原体 检测与临床分析 [ J] . 中华检验医学杂志, 2006, 29 ( 5 ) : 433- 434. [ 2] 卫生部办公厅. 住院严重急性呼吸道感染病例哨点监测 [ Z] . 2011. [ 3] S cheltinga SA, Tem pleton KE, B eersm aM FC, et a.l D iagnosis of hum an m etapneum ov iru s and rh inoviru s in pat ien tsw ith resp iratory tract in fections by an in terna lly controlled m u lt ip lex real- tim e RNA PCR [ J] . JC lin V iro,l 2005, 33 ( 4 ): 306- 311. [ 4] 邹淑梅, 韩健, 温乐英, 等. 常见呼吸道病毒分子鉴别诊断 技术的建立 [ J] . 中华实验和临床病毒学杂志, 2006, 20 ( 2 ) : 17- 20. [ 5] S. B ellau- Pu jo,l A. Vab ret, L. Legrand, et a.l D evelopm ent of th ree mu lt iplex RT - PCR assays for the detect ion of 12 respiratory RNA viruses [ J ] . Journ al of V iro log ica l M ethods, 2005, 126 ( 1- 2 ): 53- 63. [ 6] 李俊, 罗菁. 352例儿童急性呼吸道感染的病原学检测 [ J]. 浙江预防医学, 2007, 19 ( 4 ) : 44- 45. (收稿日期: 2011- 02- 18 ) (上接第 75页 ) 讨 论 肺炎链球菌常定植于鼻咽部黏膜, 尤其以 5岁 以内婴幼儿携带率最高, 且儿童高于成人。本次调 查显示急性下呼吸道感染儿童肺炎链球菌检出率为 10�88%与国内报道二线城市检出率基本相似 [ 3 ] , 与国内一线城市的分离率有较大差异, 明显低于北 京, 高于广州, 与上海地区相仿 [ 4]。提示该病菌 携带率与地域及人口流动有极大关系, 因此必须进 一步完善基层乡镇卫生公共卫生保障制度, 确保儿 童得到基本卫生医疗和保健服务。 儿童感染肺炎链球菌的易感因素与年龄、季节 相关。本次调查显示肺炎链球菌感染以婴幼儿多 见, 12月龄以下患儿检出率占 12�82% , 13月龄 ~ 5周岁患儿检出率占 7�84%。疾病易在寒冷季节 高发, 春冬季感染明显高于其他季节, 一方面考虑 儿童尤其是婴幼儿抵抗力弱, 春冬季气候等原因容 易导致合并综合症发生。另一方面也提示幼儿接种 相关肺炎链球菌疫苗应在春冬两季前接种, 使在该 菌流行季节前产生免疫抗体。 从本次耐药试验结果, 近 3年来本地区患儿对 红霉素、青霉素、复方新诺明、克林霉素、四环素 耐 药 率 分 别 为 96�87%、 82�60%、 72�92%、 96�87%和 76�56%, 敏感率均已低于 20�00% , 已 接近周边地区同期耐药发生情况 [ 5]。表明诸暨地 区儿童感染的肺炎链球菌对青霉素的耐药情况亦已 很严重, 这可能与本地区频繁使用这些抗生素有 关。因为耐抗生素的基因是逐步获得的, 随着连续 的基因突变, 耐药性也逐渐增强。无疑抗生素的应 用是导致耐药性的主要原因, 当然也与抗生素在治 疗肺炎中的药物浓度有关。因此建议临床及时监测 细菌耐药性变迁, 以针对性用药, 防止滥用抗生素 造成的不良后果。 本次调查结果显示肺炎链球菌对氧氟沙星、利 福平的敏感性比较高, 未检测到耐万古霉素和氯霉 素的肺炎链球菌。提示可能儿童应用氨基糖苷类和 喹诺酮类抗生素少, 故对该类药敏感性高。因此, 在治疗肺炎链球菌感染时, 考虑儿童用药的安全性 和治疗的有效性, 据陆权、王传清等研究表明头孢 曲松是一种很好的替代抗生素 [ 6, 7]。 参考文献 [ 1] 胡亚美, 江载芳, 诸福棠. 实用儿科学 [M ] . 7版. 北京: 人民卫生出版社, 2002: 1171. [ 2 ] M atth ew A , W ik ler. Perform ance standards for an tim icrob ial suscep tib il ity test ing: 18 th in form ational supp lem en tM 100- S18 [ S ] . C lin ical and Laboratory S tandards In stitu te, 2008: 479- 480. [ 3] 杨晓华, 谭南, 林爱心. 广东省中山地区儿童肺炎链球菌的 耐药性分析 [ J] . 中国感染与化疗杂志, 2010, 10 ( 1 ): 49 - 52. [ 4] 姚开虎, 王立波, 赵根明, 等. 北京上海广州深圳 4家儿童 医院肺炎住院患儿肺炎链球菌分离株的血清型分布 [ J] . 中 国循证儿科杂志, 2008, 3 ( 6 ) : 426- 432. [ 5] 黄璐, 季伟, 丁云芳, 等. 儿童肺炎链球菌急性下呼吸道感 染耐药监测 [ J ] . 临床儿科杂志, 2010, 28 ( 6 ) : 538- 541. [ 6] 陆权. 儿童耐青霉素肺炎链球菌感染的治疗 [ J] . 临床药物 治疗杂志, 2010, 6 ( 3 ) : 20- 24. [ 7] 王传清, 王爱敏, 张泓, 等. 2009年中国 CH INET链球菌属 细菌耐药性监测 [ J ]. 中国感染与化疗杂志, 2010, 10 ( 6 ) : 426- 429. (收稿日期: 2011- 02- 10 ) �78� 浙江预防医学 2011年第 23卷第 6期 � Zhe jiang P reventiveM edicine, Jun. 2011, Vol 23, No� 6