氨基甲酸酯类农药速灭威人工抗原的合成与鉴定
氨基甲酸酯类农药速灭威人工抗原的合成
与鉴定
现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vo1.25,No.10
氨基甲酸酯类农药速灭威人工抗原的合成与鉴定
孙晶玮,王硕,张燕
(天津科技大学食品工程与生物技术学院教育部食品营养与安全重点实验室,天津
300457)
摘要:通过化学
合成了两种完全突出氨基甲酸酯类农药速灭威特征结构的半
抗原,并采用活化酯法与载体蛋白偶联制备成
完全抗原.经动物试验鉴定合成的人工抗原可制备出高效价的抗速灭威抗体,结果
明速灭成人工抗原已成功合成,为建立速灭威残
留免疫分析方法奠定了基础.
关键词:速灭威;半抗原;表征;完全抗原;鉴定
中图分类号:TQ453.2;文献标识码:A;文章篇号:1673—9078(2009)10.1183—04
SynthesisandIdentificationofArtificialAntigensforN-methylcarbamate InsecticideMetolcarb
SUNJing-wei,WANGShuo,ZHANGYan
(KeyLaboratoryofFoodNutritionandSafety,MinistryofEducationofChina,TianjinUniversityofScienceand
Technology,Tianjin300457,China)
Abstract:TwohaptensforN-methylcarbamateinsecticidemetolcarbweredesignedandsynthesized.Bothhaptenswereconjugatedtothe
carrierproteinsrKLHorOVA)bytheactiveestermethod.HaptenswereconjugatedwithKLHforuseasimmunogensandcoupledtoOVAfor
useascoatingantigens.Theconjugateswereidentifiedcouldproducehightiterantiseraformetolcarb.Theresultsshowedthesuccessful
synthesisofartificialantigensformetolcarbwasusefulforthedevelopmemofimmunosorbe
ntassayofmetolcarb. Keywords:metolcarb;hapten;characterization,antigens;identification
速灭威(Metolcarb,3一甲苯基_N一甲基氨基甲酸酯) 是一种氨基甲酸酯类杀虫剂,广泛应用于稻田,蔬菜, 水果及经济作物等的害虫防治【1].虽然速灭威的危害 性很小,对哺乳动物的半致死量(以小鼠计)为268 mg/kg[2J,但农产品上残留的速灭威农药仍会对人体健 康造成潜在的危害.因此开发速灭威农药残留的痕量 分析方法具有重要的现实意义.
速灭威的传统检测方法主要是色谱法【3-6l,这些方 法虽然灵敏,准确,但也存在着样品前处理过程复杂, 不适合大批量样品筛选的缺陷.目前,较为先进的农 药残留检测法是酶联免疫吸附分析(ELISA),因为它 的简便,快速,灵敏度高,特异性强等优点,近年已 在国内外被广泛应用.在农药小分子免疫方法的建立 中关键的一步是半抗原的设计.张奇【7J用化学方法首 次合成了一种速灭威半抗原,但采用的合成路线复杂, 原料有较强的毒害性.
收稿日期:2o09_o6—14
基金项目:国家"863"
项目(2~6M10Z448) 作者简介:孙晶玮(1979一),女,博士研究生,从事食品安全检测研究 通讯作者:王硕,男,教授
本试验设计合成了二种速灭威半抗原,该合成方 法具有操作简便安全等优点.合成的速灭威半抗原连 接匙孔血蓝蛋白制备出具有免疫原性的人工抗原,经 鉴定合成的两种人工抗原能促使免疫动物产生针对速 灭威的抗体,为建立一种简便,快速,特异性的速灭 威残留免疫分析方法奠定了基础.
1材料与方法
1.1材料与仪器
匙孔血蓝蛋白(KLH),牛血清白蛋白(BSA), 卵清蛋白(0A),弗氏完全佐剂,弗氏不完全佐剂, N一羟基琥珀酰亚胺(NHS),N,N'一二环己基碳二亚胺 (DCC),13-氨基丙酸,间甲基苯异氰酸酯,问甲基苯 甲酰氯等其他试剂均购于sigma公司.1,4一环氧己烷和 四氢呋喃均为分析纯,用前需除水纯化.AV一300核 磁共振仪购自德国Bruker公司;热电LCQAdvantage 液相色谱一质谱联用仪购白美国Thermofin—negan公 司;96孔酶标板购自丹麦Nunc公司;双波长酶标仪 购白美国Thermo公司.
1.2溶液
现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vo1.25,No.10
磷酸盐缓冲液(PBS,0.O1mol/L,pH7.4),碳酸
盐缓冲液(CB,0.05mol/L,pH9.6),洗涤液(PBST, 0.01mol/L,pH7.4,PBS一0.5mol/L吐温20),封闭液 (1%BSA—PBS溶液),3,3,5,5.四甲基联苯胺(TMB) 底物液(TMB.过氧化氢脲溶液),终止液(2.5mol/L H2S()4溶液).
1-3半抗原的合成
0一C—NHCH.HNCNH一(CH,)COOHCNH(CH),COOH
ll一'l
CH3CH3CH
3
MetolcarbHaptenlHapten2 图1速灭威及半抗原1和2的结构
Fig.1Structuresofmetolcarbandtwohaptens
l-3.1半抗原l的合成
称取1.338g(10mmo1)13-氨基丙酸和0.890g(10
retoo1)问甲苯异氰酸酯溶于100mL无水四氢呋哺溶 液中,室温搅拌反应过夜,过滤,所得滤液用硅胶柱 层析净化洗脱(洗脱液为V醇:V氯烷=1:40的甲醇二 氯甲烷溶液),然后将洗脱液旋蒸至干,得到0.522g 白色固体,产率23.52%.TLC(V醇:V烷=1:15), Rf0.5.
l_3I2半抗原2的合成
称取0.890g(10mmo1)O一氨基丙酸溶于100mL 0.1mol/LNaOH溶液,逐滴加入溶有1.545g(10 mmo1)间甲基苯甲酰氯的6mL无水四氢呋喃溶液, 边滴边搅拌,冰浴下搅拌反应4h,反应完全后以浓 盐酸酸化,反应体系用乙酸乙酯萃取3次,无水Na2SO4 干燥,过滤,旋蒸除去乙酸乙酯,加入少许乙酸乙酯 置于一20?下结晶,过夜得到透明晶体O.53lg,产率 21.82%.TLC(V醇:V一氧烷:1:15)Rf0.53. 1.4人工抗原合成
分别将两种半抗原采用活化酯法J与载体蛋白 KLH和OVA偶联,制备人工免疫原和人工包被原. 具体方法如下:称取0.5mmol半抗原,0.625mmol NHS溶于3mL无水四氢呋哺,在保护下,逐滴加 入溶有0.625mmolDCC的4mL无水四氢呋哺溶液, 边滴边搅拌,室温下搅拌反应4h,将反应体系置于一20 ?冰箱内18h,过滤除去白色沉淀,旋蒸至干,得到 白色半抗原酯化物.称取载体蛋白溶于2mLpH9_3 的KH2PO4溶液中,另取4mg上述半抗原酯化物, 溶解于O.2mLN,N一二甲基甲酰胺(DMF)中,冰浴 下逐滴加入蛋白溶液中,边滴边摇匀,4?旋转放置 过夜,将反应液装入透析袋,4?条件下PBS透析3d, ll84
透析液冷冻干燥得到白色粉末,贮于一20?下备用. 1.5动物试验对速灭威人工抗原免疫原性鉴定 1.5.1抗体的制备
四只体重约2kg的雌性大耳白兔(每种免疫原免 疫两只)采用相应的免疫程序免疫6次.按0.5mg/kg (以蛋白量计)将免疫原与等量的弗氏完全佐剂充分 混合乳化,采取背部皮内多点注射进行初次免疫.加 强免疫用不完全佐剂,免疫原量减半,前3次每隔2 周免疫1次,第3次后每隔1个月免疫1次.从第3 次免疫开始,于每次加强免疫后7d进行耳缘静脉取 血,并进行血清效价测定,六次免疫结束后7d进行 腹部动脉采全血.离心分离获得抗血清加入0.1%叠氮 钠于.20?储存备用.
1.5.2抗体效价的测定
采用同源间接ELISA法测定抗体效价.包被原用 CB稀释后包被在酶标板上,包被量为l~tg/well,室温 孵育过夜;PBST洗涤3次,每孔加入200gL封闭液, 室温下封闭lh;PBST洗板3次后,每孔加入100gL PBS梯度稀释的抗血清,室温孵育Jh;洗板4次后, 每~L,JJH入100酶标二抗(用PBS稀释10000倍), 室温孵育30min;洗板5次后,每孔加入150新鲜 配制的底物液进行显色反应,20min后每孔加入50 终止液;采用双波长方式测定每孔吸光度值(450nin 为测定波长,650nlTl为参考波长),选择吸光度值在 0.7,1-2范围内的抗血清稀释倍数,即为抗血清效价. 2结果与讨论
2.1半抗原的设计合成
小分子物质本身不具有免疫原性,必须与载体蛋 白偶联合成人工抗原,因而制备针对小分子物质的抗
体的关键是半抗原的设计合成.适合的半抗原应尽可 能的保留待测物的结构特征J.速灭威的分子结构可 以分为两个结构单元:一部分是问甲苯基,另一部分 是氨基甲酸酯.从免疫学的角度分析,问甲苯基的空 间结构复杂,分子量较大,可以作为抗原决定簇,而 氨基甲酸酯可以在总体结构上视为一个线形长链分 子,可以作为与载体蛋白偶联的臂.因此在设计合成 速灭威半抗原时,必须保留间甲苯基,而可以对氨基 甲酸酯链进行适当的修饰,形成可以与载体蛋白连接 的臂.本试验在设计合成速灭威半抗原时,采用具有 甲酰基等活性基团的含问甲苯基化合物与氨基丙酸反 应,这样既保持了速灭威半抗原与速灭威在结构上的 相似性,又使半抗原分子具有了与载体蛋白连接的合 适结构.合成路线如图2所示:
现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vo1.25,No.10
一
NHS/......//COOH
NH//\\/cO0H
HN
.
一
C-NH一(CH2)sCOOH
HaptenSN
.
-
NH一(CH2)2COOH
HaptenSS
图2速灭威半抗原合成路线
Fig.2Syntheticroutesforhaptensofmetolcarb
与文献相比较【7J,本试验合成方法避免使用了光
气和甲苯这些有毒害作用的原料,而是直接以含有甲
酰基等活性基团的甲苯基化合物与氨基丙酸反应,一
步反应即可得到目标化合物,方法更加简便,安全.
2.2半抗原的表征
2.2.1半抗原l的表征
HNMR(300MHz,DMSO—d6)6:2.23(3H,S,
phCH3),2.41(2H,t,CH2COO),3.28r2H,q,NCH2), 6.20(1H,t,NH),6.70~7.21(4H,In,phH),8.47(1H, s,phNH),12.29(1H,S,COOH).MS(ESI)[found: m/z467.20[2M+Na],calcdforC11H14N203,Mr 222.24].
2.2.2半抗原2的表征
HNMR(300MHz,CDCI3)6:2.34(3H,S,
phCH3),2.52(2H,t,CH2COO),3.45(2H,q,NCH2). 7.32,7.63(4H,m,phil),8.48(1H,br,NH),12.26 (1H,S,COOH).MS(ESI)【found:m/z437.05[2M+
Na],calcdforCIIH13NO3,Mr207.231. 2-3人工抗原的合成
在合成人工抗原时小分子半抗原通常不是直接与
载体连接,而是通过交联剂将二者结合在一起.交联
剂可防止大分子载体蛋白对半抗原的屏蔽效应,即防
止半抗原与载体结合时被包埋在卷曲凹陷的大分子结
构中,抗原决定簇的外露使得所产生抗体的专一性相
应增加,交叉反应减少.本试验用N一羟基琥珀酰亚胺
活性酯法合成人工抗原,先是半抗原上的羧基被交联
剂NHS在DCC的作用下酯化生成中间产物,中间产物
再与载体蛋白KLH或OVA的氨基缩合生成人工抗原.
2.3.1半抗原1的活化酯表征
TLCRf:0.5(甲醇:二氯甲烷=1:40).HNMR
(300MHz,DMSO—d6,)6:2.24(3H,S,phCH3),2.82(4H, s,COCH2CH2co),2.89(2H,t,CH2COO),3.41(2H, t,NCH2),6.28(1H,t,NHCH2),6.71(1H,d,phil), 7.13-7.23f4H,In,phil),8.56(1H,S,phNH).MS(ESI) [found:m/z342.48[M+Na],calcdforC15H17N305, Mr319.34].
2.3-2半抗原2的活化酯表征
TLCRf:0.6(甲醇:二氯甲烷:l:40).HNMR
(300MHz,CDC13)6:2.40(3H,S,phCH3),2.87(4H, S,COCH2CH2co),2.95(2H,t,CH2CO),3.88f2H, q,NCH2),6.93(1H,S,NH),7-31,7.57(4H,In,
phH.MS(ESI)[found:m/z631.20[2M+Na],calcdfor C15H16N205,Mr304.33].
2.4人工抗原的鉴定
检验人工抗原是否成功合成,其方法主要有二种:
一
种是紫外扫描,通过直接分析半抗原,蛋白质载体
及二者结合产物的紫外吸收光谱来进行判断;另一种
是将人工抗原免疫动物,用琼脂扩散试验,ELISA或其
他免疫学方法检测是否有相应抗体的产生,后一种方
法更能说明问题.本试验用免疫原免疫大耳白兔得到
的抗血清进行效价测定,判定抗血清与包被抗原的亲
和性.用包被原包被酶标板,同时用OVA包被酶标板
作对照,采用间接ELISA检测抗血清.结果表明抗血清
的效价在(1.2,1.6)xl0,证明抗血清中确实含有抗速灭
威的抗体,且本试验所用包被原与免疫原具有不同载
体,这就消除了抗血清中抗KLH抗体对试验可能造成
的假阳性结果,从而更真实地反应出抗血清中存在抗
速灭威抗体.试验结果表明速灭威人工抗原已成功合
成,从而为建立速灭威残留免疫分析方法奠定了基础.
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(下转第1143页)
l185
C一\
现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vo1.25,No.10 见5.由图可知,SO2的脱除率随叶绿体浓度增大
而升高而迅速增大.当叶绿体浓度达到100mg/kg时,
反应1h即可将初始有效浓度为300mg/kg的SO2基
本完全脱除(脱除率为95.90-m0.91). 2.6叶绿体催化去除SO2原理初探
无机沉淀方法测定的结果得出SO2转化为硫酸盐 的转化率为99.33~-0.56%这说明反应结束后反应液中 的亚硫酸盐几乎完全被去除.由于亚硫酸钡盐的溶度 积(8×10')远远小于硫酸钡(1.1×10.),磷酸钡虽 然溶度积很小(3.4x10)但只要盐酸浓度保持在 1.06x104mol/L以上就不会沉淀,因此,在1.2.5节的 实验条件下,只有硫酸钡才能发生沉淀.由此可知经 灼烧干燥恒重的重量计算所得即为硫酸钡的重量,其 中8042.就是被脱除的SO2转化而来的.以上实验结果 说明叶绿体催化脱除SO的原理就是将亚硫酸盐催化 氧化为对人体无害的硫酸盐,这个结论与Trebst}j2J等 人的结论一致.
3结论
(1)在一定条件下,从波菜叶中提取的叶绿体 可有效去除SO2;叶绿体对NaHSO3与Na2SO3中SO2的 脱除与两种盐的形式无显着关系,而与反应液的pH值 显着相关.叶绿体催化脱除802的最J~_pH=7.不同的 缓冲液在同一pH值对SO2的脱除效果不同.KH2PO4一 NaOH,Nail2PO4-Na2HPO4,柠檬酸-Na2HPO4缓冲液 对叶绿体作用于SO2脱除的效果好且无显着差别;而 Tris.HC1缓冲液对叶绿体催化脱除SO2的效果较差. (2)叶绿体脱除SO2的适宜温度应在25?左右. 时间及叶绿体浓度与叶绿体脱除SO2效率成正相关. 时间越长SO2的脱除率越高,叶绿体浓度越大SO2的 脱除率越高.故适当延长反应时间及增大叶绿体浓度 有利于SO2残留的降低.对初始有效浓度为300mg/kg 的SO2,用100mg/kg的叶绿体进行脱除时,反应在1
h左右即能基本全部脱除.
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