12种小分子肽对大鼠离体黄体细胞孕酮生成的影响
12种小分子肽对大鼠离体黄体细胞孕酮生
成的影响
生矗与矗~(1992)12卷1期19~23责
Reprodu,ctlon&Contraception(1992)12(1):19,船
一
z,
12种小分子肽对大鼠离体黄体
细胞孕酮生成的影响?
赵玉莲倪江王晓宁程治平.??.
(啥尔演医科大学生殖_内分泌研究室)
王德心鲁桂琛王遣功刘文关慕贞艮7?/
(中国医学科学院药物研究所?
用放射免疫分析法测定大鼠离体黄俸细胞孕酮含量,观察了人工合成的l2升小分子
肤对大最黄体细胞的影响.结果
明,Gly-Tyr-NI-I和Gly—Scr-Lys有抑制黄体细胞基
础孕酮分泌作用,迁抑+,FI~CG诱导的孕酮分泌;Lys-Tyr-NHz,Thr-S~r-Lys,Gly—Tyr
“Lys抑制hCG诱导的孕酮分泌;(OITyf)?:Lys则增强基础器hCG诱导的亲用分泌I
其余6种小分子肤(Gly—Gly,Gly-D-Tyr.Tyr-D-Tyr,Thr-Ser-Tyr,Thr-Asn-Tyr-
Thr~NH=,Tyr—Tyr-His-Lys-Ser),对大鼠黄体细胞孕矾分泌没有影响同盱讨论了其
构鼓关系及可能的作用机辛4..-?
关键词苎幽,塑,尘缀锰
酪氨酸具有抗hCG诱导孕酮分泌的作用
已经为很多实验所证实】.进一步的实验证
明在体内21种氨基酸中,除酪氧酸以外,墼
氨酸和苏氪酸也具有酪氯酸样的作用【5】.说明
氨基酸影响hCG致孕酮生成作用有一定选择
性.有趣的是,近年很多报道,在激素跨膜信
息传递过程中,蛋白质的磷酸化就发生在这三
种氪基酸残基上}另外,在筛选十几种酪氨酸
类似物时发现,甘氨酰一酪氯酸(Gly—Tyr)二肽
和酪胺酰胼的抗hCG致孕酮生成作用强于酪
氨酸l,这些都为探讨酪,丝,苏三种氨基酸
的作用机制以及考虑合成和筛选作用更强而又
无毒性的类似物开阏了思路本实验观察了以
酪氨酸,丝氧酸,苏氨酸为主体的人工合成,j,
分子肽对大鼠离体黄体细胞孕酮生成的影响.
材料与方法
一一
,实骚动物一?
取未成年(25~28日龄)健康雌性Wistat大
鼠5O只,皮下注射孕马血清促性腺激素
(pI~sG)65:u/只,促使卵泡成熟发育.65h以.
后再皮下注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)
35lu/只诱发超排卵.注hCG后7天断头处死
大鼠,取出双侧卵巢,此时卵巢内充满黄俸.
=,细胞培养
.
黄体细胞悬浮液的制备参照以前的方
法”】.培养液为O.1牛血清白蛋白-Krebs—
Eingex碳酸缓冲液~ICJEBGAL).培养的细胞数
?本研究为国家科委七五重点科技攻关项目,
并受嗣家计生委基金资助
为L.5×10/rnl.在37?恒温水浴振荡器内
温育1h,使细胞功能达到稳定以后,向培
养管内分别加入实验试剂:1.对照组加等量
KRBGAL.2.酪氨酸Vyr(英国BDH公司产
品)0.2mM.3.hCG(Calbiochcm—Behring公
司产品)0.LIu.4.小分子肽(中国医学科学
院药物研究所合成)0.2mM.5.hCG0.rIU十
Tyr0.2mM或小分子肽0.2mM.6.hCG
0.1Iu,再分剐加不弱剂量的三种小分子肽,
终体积为lml.在上述培养条件下温育90.
rain,取出后置A一25?冰箱终止反应留作测
定孕酮含量.
三,孕酮洲定l
用放射免疫测定法(RIA)坝i定样品中孕酮
含量.H一孕酮测定试剂盒哥卫生部上海告物,
制研壳所产品H一季酮放射活硅测走用
Beckman9800液体闪烁计数仪.
结果的统计学处理用t捡验.
,实验结果
一
,12种人工合成小分子肤的简化结构
实验用12种人工合成小分子肽,其中有5
种二肽,4种三肽,1种四肽,2种五肽,它
们的简化结构如图L所示(只列出基本氨基酸
顺序厦功能基团).这些小肽的化学合成方面的
工作另有报道
:,l2种小分于肤对太鼠离体黄体细胞基
础孕萌分泌的影响
…..……一?.f…?
.rht_t—t……ThrSLysMTvr-
Se.巾vtThrSet:Tyr
,
一……”??I1I…”„„幽…?粥鳓j
l一,t……,GlyTyrLys…Tyr,l|j卜TyrHisLysSet
,u,一一.,”„翳?搠
„r~r-NHj…rAshTyr劝n—踟哪
2
N——1一=一L;=.()0伽啦
.
一曲,一
图1Tyr及小分子肽的结构
F_堰1Thestructureoftyro血lc
d锄直?p印ti阳
初筛小分子肽对基础孕酮分泌的影响.结果见
表l.在合成的12种小分子肽中,二肽Gly—
Ty.r-NH2和三肽G1y—Ser-Lys能够抑制黄体细
胞的基础孕酮生成.抑制率分别是33.4%和
19.8.而五肽(Gly—Tyr)Lys则提高基础
孕酮产生(22.3).其余小分子肽对基础孕酮
生成投有影响.
三,不同荆量的3种小分子肽对hCG致
孕酮生成作甩的影响
已知有3种小分子肽影响黄体细胞基础孕
酮分泌(表1),实验欲进一步了解小分子肽对
hCG致孕酮分泌的影响.首先选择了0.2mM
左右的4种剂量,随意在3种小肽中初试其对
hCG致孕酮生成作用的影响(图2).Thr—&r_
寰1Tyr爰12种小分子肽对太?寓
体黄体细膪基磷孕一生成的彩?
Table1EliotofTytand12newly
synthesizedsmallpeptidesonbustl
proKesteroneproductionbyrat
Corpuslutealcells
NotelP<0.5,?P<o.01vscontrol
(三次实验结果)
(Res~fltsfromthreeexperlments)
?21?
Tyr和Tyr-Tyr-His—Lys-Ser2种小肤的剂量
反应曲线显示出剂量依赖趋势,至大剂量(1
raM)时才表现有统计学意义(P<O.O5)的影响.
三肽Thr—Ser—Lys在0.2mM时即表现出踞显
抑制hCG致孕酮生成的作用,且比0.5和lmM
对作用更强.综合孝虑酪氨酸的有效剂量及小
肽影响基础孕酮分泌的剂量,以后筛选小分子
肽生物活性实验中,均采用0.2m_M浓度t
control0.02
,
ThStTyrxTh~Ser-Lys口Tyr-
Tyx-Hit-Lvs-.~t
图2三种小分子酞影响hOG致
孕酮生成作用的剂量反应曲线
Fig2Dose—re印?seeucof3smallp?d
013.hCG-induccdprogestm~neproductionbyCL
cellsofrat.
(三次实验结果)
(Resul~fromthreeexperiments)
;
珥,l2种小分子肽对走鼠离体黄体?咆
hCG致乎酮生成作用的影响
如表2所示,在l2种小分子肽中,有5种
具有拇制hCG致孕酮生成作用的生物学活性.
其中Gly~er-Lys和Gty-Tyr-NH}2种小肽
的作用比酪氨酸还分别强25.和11.2.而
五肚(o】y一yr)=Lys增强hCG致孕酮生成
作用(t8.3).
讨论
近年陆续发现体内一些肽类物质参与多种
生理机能的调节.由2,3个氨基酸组成的小
分子肽直接调节生理功能也有报道.例如,
Or嘧从牛松果腺提取出三肽scI,
?苫.8:.誊暮蛋:亘}
毯
?22-
囊2Tyr麓12种小分子胩对太鼠离体黄体
细胞hCG致孕甯生成作用的影响
Table2EfleetofTyTand12new]y
syntheslz酣sma]lpeptidesOI1hCG—
inducedprogesteroneproduction
byratCorpusluteelceils
(2×10.?tool/L)M~SE(%ofhCG)changes()
n0tc:1.hCG=0.1IU2.<0.05,”P~-.01,
…P<0.O01vs.hCGgroup.
(三次实验结果)
(Resultsfromthreeexperiments)
现此三肽有抗促性腺激素及抗生育作用,曹泳
清等?报道着床前兔胚泡液中有几种特异的
小分子肽,在妊娠的免疫保护,稳定胚泡正常发
育,加强子宫功能分化等过程中有促进作用.更
有趣的报道是,猪卵巢中特另『J是妊娠时富含肽
链端解酶——三肽端解酶和二肽端解酶,水解
胶原蛋白N末端三肽或二肽,释放下来的三肽
或二肽还可以被进一步降解[1”.这些实验都说
明体内存在一些小分子肽物质,并且与调节机
体机能活动有关系.本实验以酪氧酸,丝氨酸,
苏氨酸的抗hCG致孕酮生成作用为线索,观察
人工合成的小分子肽对大鼠卵巢黄体细胞孕酮
分泌的影响.结果发现,在筛选的l2种小分子
肽中,有2种既抑制黄体细胞基础孕酮分泌,
又抑制hCG诱导的孕酮分l泌,3种只抑制hCG
诱导的孕酮分泌,而另外1种是增强基础及
hCG诱导的孕酮分泌,其余6种小分子肽对
大鼠黄体细胞孕酮分泌没有影响(表l表2?.
这些小分子肽作用的区别显然在于其化学组成
和空间构象的差异.初步舟析小分子肽的鲭构
与功能的关系(图1),发现z
1.除氨基末端和羧基末端以外,6种有效
小肽的共同特点是都具有一个氨基(-NH2)和
一
个羟基(---OH)基团,提示这两个功能基团是
生物活性的基本条件.在很多天然氨基酸和肽
中,其羧基末端或氨基末端被其它基团所取代,
这些取代基团都是生物活性所必需的?】.有报
道--COO?一一NH:形成的离子键对于一些肽类
激素作用于靶细胞的受l体部位起重要作用【I”.
Gly-Tyr-NI~和Lys-Tyr-NH2的末端羧基被
一
NH:所取代以及其它有敢小放的碱性基团所
起的作用可能属于这种情况..,
同样具有0H和一NH|基团帕分枝状五肽
(Gly-Tyr)2=Lys的作用与其它5种小肽的作
用相反,提示此分枝状的立体结构在空间构幕
上形成不同于其它5种小肽的有效构型,反转
了抑制性作用.
L_酪氨酸本身和Gly-Tyr具有抗
hCG致孕酮生成作用,而Gly—D_1?yr和Tyr-
D-Tyr失去L一酪氨酸样的作用,说明酪氨酸
的绝对构型与其生物学活性关系密切,D型酪
氨酸没有生物学活妊.
3.虽然一OH是发挥生物学活性所必需的
功能基团,但增加-JOH的数量如Tyr,Set,
Thr组合的三肽并无助于增加其活性,而是失
去了这几种氨基酸各自的作用.可能由于经肽
键结合作用以后,其邻近的—0H基团形成较弱
的氢键,相互缔合,破坏了话性基团的作用.
至于几种有效小肽对基础孕酮分泌~]hCG
致孕酮分泌的抑制性影响有所不同,提示其作
用机理不同.除了他们都依赖hCG发挥作
用以外,影响基础分泌的几种小肽可能还有其
自身途径.(Gly-Tyr);=Lys的作用似乎不依
赖于hCO.
小分子肽影响大鼠黄体细胞孕酮分泌的机
理还不清楚.下一步的工作准备从小分子肽对
第二信使,蛋白质合成,孕酮代谢酶等的影响
探讨其可能的作用途径.
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(Instituteo,MateriaMedicaJcJ.Aeede~yMedicalSeneca)
Theeffectsof12synthetic.smalltoeptidesonprogesterone(P)productionincorpuslu?
tealeelIswP-J~investigatedbyRIA.TlresultsshowedthatOly-Tyr-NH2and
Oly-Ser-LysinhibitedbothbasalandhCO—induced(P)production,Ly吕_Ty卜N.Thr-Ser
LysandGly—Ty卜Ly目decreasedonlyhCO-induced(P)productiont(Oly_1r)t=Lysenhan-
cedbasa1aswellashCG—induced(P)production,andtheOtheI*S(Oly--Gly,,Gly-I~Tyr,
Thr-Ser-Tyr,Thr-Asn-Tyr-Thr—NH2,Tyr=Tyr~His--Lys~-Ser)exhibitedlidsignificant
influenceoH(P)productionbyratlutealcell=.Thestructure-bioactivityrelationship
wasalsodiscussed.
Keyword.,CorpmL咖ICeil=.PrqIeltM..Smtil~idc=