氧化亚铁硫杆菌

摘要 的一组蛋白质,改变了它们的合成水平嗜酸生长期间亚铁硫杆菌ATCC 19859于金属硫化物,硫代硫酸盐,元素硫,和二价铁的特点是使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳。N-端氨基酸测序和这些蛋白的质谱分析允许他们的身份和在A的现有基因组序列中的相应基因的定位ATCC亚铁硫杆菌23270 。各地的一些这些基因的基因组上下文暗示他们在能量代谢参与 A.氧化亚铁硫杆菌的。两组蛋白质可以区分开来。第一种由蛋白质高度上调了增长的硫化合物(以及对亚铁增长下调)的:一个44 kDa的外膜蛋白,远销21 - kDa的假定硫代硫转移酶蛋白,一个33 kDa的假定硫代硫酸盐/硫酸结合蛋白质,45 kDa的推定的荚膜多糖输出蛋白,和功能未知的推测的16 -kDa蛋白。蛋白质的第二组包括那些在硫下调了增长(以及对亚铁增长上调):rusticyanin ,细胞色素C552 ,一个假定的磷酸盐结合蛋白(PST文件),核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基与大亚基和30 - kDa的推定CbbQ蛋白,等等。结果明,一般的铁和硫利用率途径的分离。Rusticyanin ,除了被高度表达于二价铁,也被新合成的,如通过代谢标记来确定,尽管在较低的水平,对硫的化合物和不含铁的金属硫化物生长过程。在含有铁,如黄铁矿和黄铜矿金属硫化物生长,合成上调上亚铁和那些上调对硫化合物两种蛋白,这表明两种能量产生途径被同时感应取决于可氧化的底物中可用的种类和浓度。 氧化亚铁硫杆菌(原氧化亚铁硫杆菌)是一种化能自养细菌,从二价铁,元素硫,或部分氧化的硫化合物(6 ,16,26 ,30,41)的氧化得到它的能量。这和目前在其栖息地溶解金属硫化物等微生物的能力在biomining操作成功应用(30 ,41 )。 参与二价铁的氧化反应进行了研究,详细( 5 ,8 ,21 ,26 ,30 ,41 )。然而,从二价铁的电子通路,以氧气尚未完全建立的(44)。末端电子受体被认为是细胞色素氧化酶锚定到细胞膜。会发生通过几个周质的载体,其中至少包括蓝色铜蛋白rusticyanin和细胞色素C552电子的转移。最近,一种高分子量c 型细胞色素,CYC2 ,已被建议是在二价铁和氧之间的呼吸途径的初始电子受体的主要候选者。这个途径是CYC2 →rusticyanin →Cyc1或被(C552 )→细胞色素氧化酶评为Aa3级(44 )。 元素硫的由A.杆菌等微生物的需氧氧化反应是通过一个硫双加氧酶(31 , 36-38 )。硫代硫酸钠已被假定为在黄铁矿(34)的硫部分的氧化的关键化合物。含有该氧化反应的所有已显示发生化学(32,33)。然而,硫化合物氧化酶,如A.氧化亚铁硫杆菌,氧化硫硫杆菌A. ,或Acidiphilium acidiphilum的连四硫酸盐水解酶也可参与该过程(9 ,11,12 ,22,39)。此外,酶A.杆菌或A.硫杆菌的硫代硫酸盐或亚硫酸盐的氧化可成功地与铁(III)离子作为氧化剂(34)的化学反应进行竞争。一硫氰酸酶的活性已为A.氧化亚铁硫杆菌(40 )如前所述。这种酶是一种硫代硫转移酶(TST)打破了二硫键存在于硫代硫酸盐,生成硫和亚硫酸盐。其它酶也参与硫代机制,如A.氧化亚铁硫杆菌(36)的硫代硫酸盐氧化酶。Ramirez等人。最近描述的导出TST-样蛋白A中氧化亚铁硫杆菌,是高度表达的,当细菌生长在黄铁矿和硫,但是不能以二价铁(29),并且其可能参与硫代谢。 进一步研究了一些涉及的硫和金属硫化物的氧化的成分,我们分析了通过表达蛋白质组学由细菌合成的蛋白质的子集上生长时的Fe (II)离子,S0,硫代硫酸盐,黄铁矿,黄铜矿,或铁免费金属硫化物。我们的研究结果表明,合成与硫代谢的几种蛋白质,其中包括氧化和收购,被诱导(或去阻遏)时,微生物就减少无机硫的形式增长的。由二价铁的微生物的生长,大多数这些蛋白质的表达下调,而二价铁氧化途径的蛋白质大大诱导,配套的铁和硫氧化途径依赖于衬底被氧化单独调节的存在。 细菌菌株和生长环境.嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株ATCC 19859 生长在先前介绍的被修饰过的包含亚铁离子的9K培养基中,生长在硫元素中是通过利用硫粉来实施的,黄铁矿(40%的铁,被发现能够穿过75微米孔径的筛子)和黄铜矿的浓缩物是Paul NOrries很友好的送给我们的,Zns和Cus购买自Aldrich,并且相应 的分别包含28ppm和125ppm的微量铁,细胞在这些底物中的生长是通过在修饰过的9K培养基中进行的,其中亚铁被相应的硫化物所代替,嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长在硫代硫酸盐中是通过DSMZ来实施的,培养基71包含20微升的硫代硫酸盐和接下来的混合物(G/L:KH2PO4,3.0,MgSO4.7H2O,0.5,硫酸铵,3.0: 2水合氯化钙,0.25,通过添加1M的NaOH使PH保持在4.6,为了放射性标记全细胞蛋白,洗脱过的细胞再悬浮在10毫升的相应培养基中,然后添加0.1mCi(比活,1087Ci/mmol)的含硫35的蛋氨酸,细胞最后培育在含有或不含添加物的同样生长环境中30到40个小时。 二维的非平衡PH梯度电泳,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,和射线自显迹法。全细胞蛋白质是通过二维的非平衡PH梯度电泳来分离的,就像先前描述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌,通过使用来自于伯乐公司的两性电解质(PH为3到10),来操作实施,细胞样品(4mg[湿重]未被标记的细胞,或者是通过让细胞生长在含[35S]的蛋氨酸中来进行标记,令其含有500000cpm当量的辐射量)或者是无细胞组分是这样来分析的,把它们放在80微升的声波降解法缓冲液中[包含10毫升的Tris-HCl [pH 7.4],5毫升的 MgCl,和50微克/毫升的胰核糖核酸酶,声波处理后,用DNA酶处理[最终浓度,50微克/毫升),该混合物然后像先前介绍的那样在裂解缓冲液中冻干并溶解,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳包含12.5%的聚丙烯酰胺,或者是5%到%20浓度梯度的聚丙烯酰胺,蛋白质的序列可以通过托马斯亮蓝的染色和先前介绍的射线自显迹法来直观的展示,在过氧化氢存在,并且以3,3,5,5-四甲基联苯胺作为电子载体时,含有亚铁血红素组分的蛋白质能利用它们的过氧化物酶活性来进行染色,通过这种方法,有β-巯基乙醇存在的蛋白质要比与亚铁血红素非共价结合的蛋白质染色更深,由于在二维聚丙烯酰胺中含有硫醇,我们最有可能检测到与亚铁血红素共价结合的蛋白质,合成出来的放射性蛋白的相对水平是通过射线自显迹法,并使用Scion图像处理软件来检测的。 萃取自二维凝胶蛋白质的微测序和质谱分析.目标蛋白是通过托马斯亮蓝染色和通过切割蛋白颗粒的干热二维电泳来回收的,当再水化合并利用SDS-PAGE对蛋白颗粒进行浓缩,蛋白质被电转染到聚偏氟乙烯膜上,并且拿到de Microséquen?age des Protéines of the Institut Pasteur, Paris, France.实验室进 行微测序,染成银色的蛋白质,经过二维凝胶电泳,蛋白染色液胰凝乳蛋白酶消化和萃取,最后得到分离,肽溶液是通过电喷雾串联电离-质谱仪来分析的,获得的结果通过微软的MS/MS搜索来分析,这整个MS分析是在英国剑桥,剑桥大学,剑桥蛋白质组中心完成的. 免疫印迹法,嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长在不同的可氧化的底物上合成的蛋白质是通过SDS-PAGE来分离的,并且电子转移到先前描述过的聚偏氟乙烯膜上,对于抗原抗体反应,膜上的转移蛋白是用抗血清处理过的,用来作为对抗铜蓝蛋白的一级抗体(稀释比,1:5000),并且单克隆抗鼠抗体与过氧化物酶结合来作为二级抗体(稀释比,1:2500),Promega公司提出用比色法来发展Western免疫印迹,与集合在Western免疫印迹上的Rus蛋白有关的强度变量可以通过扫描仪和Scion图像分析软件来监测。 来自于嗜酸氧化亚铁硫杆菌的无细胞的准备.嗜酸氧化亚铁硫杆菌被分解为外膜,可溶物,和先前描述的内膜组分,可溶性组分通过第一次100,000 ×g两小时的离心,使全膜组分颗粒化,然后取自上层清液,内膜组分是在全膜组分用2%的十二烷基肌氨酸钠处理,来分离准备的外膜组分,最后取自上清液得到。寡核苷酸.以下的合成的寡核苷酸是需要的,用于逆转录实验中 5′-CCTGCGGGTTGTCATACT-3′; for PCRs, a (5′-CGTCTGGTTGGATAGCTG-3′), b (5′-GTCGTCGGCGGAGGCCACCGA-3′), c (5′-CATCGCTCAAAGGCAAAG-3′), d (5′-ATGGCAACGACCATGTCA-3′), e (5′-CAACGTCCCGATCCCCGCGAA-3′), and f (5′-GTAAAACGCTGCAAGTCG-3′). RT-PCR.嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ATCC 23270的全RNA是通过先前介绍过的用于产硫培养的改良热酚法来制备,经过苯酚萃取后,包含RNA的组分再用氯仿萃取两次,在?20°C下用乙醇处理一晚沉淀析出,用70%的乙醇洗脱,再用60微升的无核酸酶再悬浮,接着在4微克的全RNA中加入30 U的不含RNA酶的DNA酶 I 和5毫升的MgCl2,直到最后体积为10微升,保持温度在37°C一小时,最后,提高温度到65°C保持10分钟,使DNA酶灭活。 RT-RNA通过用DNA酶处理过的2ug嗜酸氧化亚铁硫杆菌全RNA来实现,在有400纳克RT前体存在下,温度保持在70°C 5分钟,最终RNA变形,然后用冰块冷却,根据制造商的说明,RT反应是在42°C保持1小时,并使最终体积保持在 25ul来实现的,通过在65°C下加热10分钟酶会灭活,PCR是通过利用取自50微升RT反应产物的其中3微升来执行的,该产物含有TAQ DNA聚合酶反应缓冲液,2.5毫升的MgCl。100uM脱氧核糖核苷三磷酸,5%的二甲亚砜,250ng的前体,1U的TAQ DNA酶,对于PCR,按接下来的步骤进行:首先在95°C 退火3分钟,继续把温度保持在95°C 30s,然后调到50°C 保持30s,72°C 保持45秒,这样循环40次,对于每一个RT-PCR实验,必须包含一个不含有逆转录吗的RT反应操作,用于检测被准备使用的RNA中没有被遗传物质DNA污染),RT-PCR 产物最后由添加了0.5× TAE 缓冲液的琼脂糖凝胶电泳来检测 序列分析.碱基的识别和相似性查询是通过国家生物技术信息中心的Blastp程序来完成的,我们利用可行的嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ATCC 23270 的基因序列,该序列已被测定但未标注,开发阅读框产物的分子质量和等电点是通过利用ProtParam工具来完成的,在开发阅读框中分析过的可能存在的跨膜区已经被TMpred预测过了。 结果与讨论 种植不同的可氧化物质氧化亚铁硫杆菌A.全球蛋白质合成的图案。 来表征一些差异,由A.氧化亚铁硫杆菌的元素硫或二价铁生长时所合成的蛋白质,我们使用标记有放射性甲硫氨酸接着通过放射自显影的总细胞蛋白的2 -D NEPHGE分析。蛋白质合成的亚铁生长A.氧化亚铁硫杆菌的一般模式显示,从观察到的硫细菌生长的几个不同(图(图1 )。1 )。分歧涉及两个上调和众多多肽合成的下调。我们决定详细的组在图3的凝胶表明蛋白质的研究。图1中, 1中,由于所有这些多肽被考马斯蓝或银染色良好,因此可以进行高效率的N-末端测序或质谱分析。一些低丰度蛋白(如点6和3 )被他们点从几个相当于2 - D胶分离后集中。其它蛋白不是直接从总细胞蛋白质N-末端测序的2 -D凝胶,但是从subproteomes组成的外膜或可溶级分从所分析的细胞(见下文)中分离。 蛋白质的氨基酸序列和其识别通过使用数据库。 所选择的蛋白质,其通常被上调或下调的两倍以上,从2 -D凝胶上分离并进行 微测序或质谱分析。使用这些序列中,我们进行了相应的TBLASTN分析和确定表表1.1中描述的那些蛋白质。所有这些序列也存在于A.氧化亚铁硫杆菌菌株ATCC 23270的基因组序列。 蛋白通过上调对增长硫(和对亚铁增长下调)。 蛋白点7的高度由硫(超过七倍以上)的增长上调。在序列数据库中检索数据表明,它的N-末端氨基酸序列为40%相同的,功能未知的存在Aquifex超嗜热菌(登录号NP_213005 )的基因组中的保守的假定蛋白。通过蛋白质斑点7针对A.氧化亚铁硫杆菌的基因组的氨基酸序列的比较,我们发现对于含有原始的N-末端序列的推定的信号肽后的推定的基本蛋白的基因。16 kDa的的出口可能含有的蛋白质约10 %的蛋氨酸残基(包括其信号肽)。 在图斑2 。图11是几乎上调了一倍硫增长。其N-末端氨基酸序列显示扩展的相似性,以一个硫酸盐/硫代硫酸盐结合蛋白(SBP)的。通过搜索其在A.氧化亚铁硫杆菌的基因组的氨基酸序列中,我们发现了一个基因编码一个推测的SBP 还含有预测的信号肽。的N末端的理论上处理蛋白质是相同的斑点2的序列,该推定的收缩压对应SBP1 ,推断存在于导出的硫氰酸酶样蛋白P21 (29)的基因组范围内的两个假定的SBP之一。硫酸盐结合蛋白诱导的异养细菌时硫酸限制(小于500微米)(20)。 A.杆菌通常遇到硫酸高浓度阴离子在其环境中相比,异养细菌的,因此它是难以评估的硫酸浓度的变化上的SBP的表达的影响。然而,如果一个SBP的合成是由硫酸浓度较高压抑,其合成可以预料会同时增加对硫和硫代硫酸根,因为我们发现,由于这些培养物的总硫酸浓度高于二价铁低得多生长的细胞(参见图11所示和and33下文)。 图Figure11和表表11显示,如先前所述(29 ),点6 ,一个假定TST,被大大地诱导(五倍多)当细胞在生长硫(图(图1B ),图1B )和是当A.氧化亚铁硫杆菌生长的二价铁(图(图1A ,1A;表table1 ) .1 )完全不存在。通过进行RT-PCR实验与合适的引物,我们发现,该基因编码的SBP1 ,Tox1 和TST可以形成一个多顺反子簇的一部分,与具有相同的取向(图(图22 )3等推定的基因。 9点(图(图11和表table1 )1 )的高度诱导硫培养的细胞。该蛋白具有同源性WCBC ,细菌荚膜多糖输出蛋白。A.氧化亚铁硫杆菌是已知的附着固体矿物的表面,如在这里所使用的成形的胞外多糖物质(13)的元素硫。因此,这将是极大的兴趣,进一步研究这些聚合物的产生这种蛋白质的可能作用 图Figure3A3A和B表明,Omp44被极大地由硫生长上调(参见表表1)0.1 )。此外膜蛋白的存在少得多的比OMP40 ,这是在A.氧化亚铁硫杆菌的主要外膜蛋白(14)。序列和Omp44的推定的结构与描述42- kDa的外膜蛋白先前由Buonfiglio等人所描述的不同。(7),其也诱导对硫A.硫杆菌的生长。与数据库的比较表明Omp44的一个蛋白家族包括FADL ,涉及横跨外膜(4)长链脂肪酸转运蛋白的相似性。Omp44的硫代谢的关系并不清楚,目前。 A.氧化亚铁硫杆菌对元素硫的生长需要附着的细胞在固体基质上的,并且这种相互作用可以诱导我们所观察到的变化与所的Buonfiglio等。(7)在该微生物的外膜蛋白。 蛋白质下调了增长硫(和对亚铁增长上调)。 表表11显示了蛋白质斑点13,其被确定为小亚基核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco )的,是下调硫与它的对价铁电平合成进行了比较。同样的事情发生在Rubisco酶的这种增长的条件下确定的大亚基的情况下(P51 [表[表] )。 1 ] )。A.氧化亚铁硫杆菌具有两种形式的Rubisco与基因及其相应的套(24)。这些都是cbbLS1和cbbLS 2 。Rubisco羧化酶亚基,我们确定属于cbbLS1 。 表表11和图Fig.3C3C和D表明,蛋白质P30也被大大下调的硫。P30给出氨基酸squence相似性的相关蛋白CbbQ ,NIRQ ,和NorQ (17)。A.在一个亚铁硫杆菌cbbQ基因已初步一个cbbO基因的上游和所述第二组的Rubisco 基因,cbbLS2 (19)的下游。同时cbbQ和cbbO基因参与维持构象状态的 Rubisco (18)和活性。我们的DNA中P30基因A的基因组范围内的亚铁硫杆菌测序ATCC 19859和A的基因组的等效范围内ATCC亚铁硫杆菌23270显示以下基因顺序:cbbR - cbbL1 - cbbS1 (点13 )的carboxysome基因(csoS2 , csoS3 ,ORFA ,orfB ,csoS1C ,csoS1A ,csoS1B )- ORF1 -ORF2 , ORF3 ,ORF4 -P30- cbbO 。因此,P30最有可能对应于第二CbbQ蛋白质,由于其邻接cbbO样基因cotranscribed与P30 ,正如我们通过RT-PCR实验(数据未示出)来确定。 自养的氧化亚铁硫杆菌A.通过卡尔文循环驱动。卡尔文循环酶的表达在不同的化能自养微生物很大变化取决于被氧化的底物(35 )上。的卡尔文循环基因的表达受转录激活因子CbbR和由可能的阻遏蛋白,可能对媒介的代谢物的胞内浓度的响应,例如在磷酸烯醇丙酮酸的一般模型[由NAD (P)H的结合激活]调节卡尔文循环的表达调控提出夏夫利等。(35)。CbbR已被确定并显示控制CBB基因在A.氧化亚铁硫杆菌的表达(23)。 图Figure11和表表11表明,蛋白质点4和5是下调的仅1.6至2倍于上生长的硫细胞。蛋白点4显示的相似性硫氧还蛋白过氧化物酶和蛋白点5显示的相似性超氧化物歧化酶。这表明,当A.氧化亚铁硫杆菌生长在一个铁可能较高应力状态。蛋白质点在图1中。图11被发现是被诱导A.氧化亚铁硫杆菌的缺乏磷酸盐的,这是一个明显日Pho调节子的一部分,在这种微生物(43)推定的磷酸结合蛋白。PST的水平降低两倍以上通过硫或硫代硫酸盐(图3G和H )的增长,增速在二价铁培养基中的磷酸暗示了可能的限制。 蛋白质点10和11分别对硫下调了增长(1块;图(图1表table1 ) .1 )。这两种蛋白质在相当,分别从A杆菌推定的蛋白和一种保守的假定蛋白从超嗜热菌,两功能未知的。现货12被戏剧性地在硫A.氧化亚铁硫杆菌的生长下调。这种蛋白质是同源的细菌类核DNA结合蛋白。这种蛋白质在A.氧化亚铁硫杆菌的可能作用实际上是未知的。 蛋白点3的高度由细胞对硫增长下调(图(图1 )。1 )。这种蛋白质与3,3 ', 5'的染色,5'-四甲基联苯胺(图3E和F)建议的血红素基团的存在以及可能的细胞色素。该蛋白被鉴定为细胞色素C552通过其N-末端序列,如表表11所示。 图现货8 。图11被认定为rusticyanin (RUS),已知的主要诱发A.氧化亚铁硫杆菌对亚铁(8 ,21 ,45 )的生长蛋白质。我们发现,罗斯被显着下调(五倍多)由硫增长相比,其在亚铁生长的细胞水平。然而,该蛋白仍然合成含硫生长的细胞从头(见下文)。 作用于含硫上调的蛋白质的表达亚铁。 当小,增加了二价铁的浓度被添加到A硫杆菌生长在元素硫,蛋白质,如斑点6 (TST ),2(SBP)的合成,以及7是下调由铁在生长培养基的存在。TST 的合成强烈增加亚铁浓度抑制,而收缩压和现货7的合成表现出小幅下降(图(图4 )。4 )。这表明对于TST ,SBP,以及在硫代谢点7可能的功能性作用,并且这些蛋白质的表达的负调节由亚铁离子的浓度存在于生长培养基中。 另一方面,我们观察到在两个rusticyanin和细胞色素C552在硫中生长的细胞,当培养基中二价铁的浓度增加的合成一个标记随之增加,表明在蛋白质合成水平的协调调节。细胞色素C552是已知参与亚铁的氧化(2)。该基因编码的rusticyanin ,Cyc1或被(C552 )CYC2连同ORF1 ,coxB ,髋,coxC 和coxD ,形成操纵子;他们都在转录在那些生长在硫生长在亚铁以及A.氧化亚铁硫杆菌的细胞,这表明由该操纵子编码的蛋白在两个生长条件起到一定的作用(2 )。 rusticyanin的生长在不同的金属硫化物A.氧化亚铁硫杆菌合成。 以确定罗斯合成是否仅限于对亚铁和元素硫的增长,我们确定该蛋白在生长在不同金属硫化物细胞中的水平。总细胞蛋白通过SDS-PAGE电泳,然后用抗罗斯的抗血清免疫印迹分开,如图所示。图5.5 。显然,在上生长的二价铁或硫铁矿细胞在罗斯水平有很大的增加(图(图5A ,5A ,泳道a和e )。罗斯也存 在于生长在元素硫,硫化铜,或细胞硫化锌(图(图5A ,5A ,车道B,C 和D ,分别),在没有二价铁存在,在我们与元素硫利用放射性标记的细胞(图得到的结果一致(图11 )。 biomining如A.氧化亚铁硫杆菌微生物的铁和硫氧化活动是含铜矿石,如黄铜矿生物浸出重要。有一个在为可能这些矿物质的攻击过程中所涉及的细菌蛋白质的文献证据。要找出是否某些上调硫和那些上调铁蛋白的生长过程中合成的矿物质,我们长大了细菌在黄铁矿或黄铜矿和确定合成尖沙咀,罗斯的水平,与现货7蛋白,如图所示图。Fig.6.6 。合成这些蛋白时A.氧化亚铁硫杆菌生长的黄铁矿或黄铜矿。 TST在黄铁矿或黄铜矿和亚铁生长过程中缺乏它生长过程中存在可以通过假设二价铁是代理抑制TST的表达来解释。在黄铁矿或黄铜矿的攻击,只有三价铁会产生,这表明这种离子是在尖沙咀合成的抑制无效。结果在图图66表明,当两种类型的电子给体(硫化物基团和二价铁)同时存在,二者硫上调和二价铁被上调的基因的表达,它们的表达依赖于各可氧化组分的相对浓度,因为我们已经找到了。虽然近来已经提出的降低无机硫化合物由nonacidophilic细菌的氧化可以使用一种涉及Sox基因簇(12)共同的机制,没有与此相关的基因簇是很明显的,当我们在可用A.杆菌查找到他们基因组序列。 总之,局部蛋白质组学分析在这项工作中提出构成了第一次见识到A.氧化亚铁硫杆菌及其使用攻击矿石的适应性反应的生理全球理解。一个可重复的遗传系统,其中以A中氧化亚铁硫杆菌进行功能基因组学的缺乏不允许我们还没有明确的角色分配给这里的这种微生物的能量代谢中描述的蛋白质。然而,一旦A.氧化亚铁硫杆菌菌株23270的基因组序列注解,并提供给科学界,扩展蛋白质组学和转录分析将极大地提高本biomining细菌的能量代谢的理解。