端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究

端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究 端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究 第33卷第2期Vo1.33No.2 2012年3月Mar.2012 井冈山大学(自然科学版) JournalofJinggangshanUniversity(NaturalScience) 文章编号:1674-8085(2012)02—0084—04 端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究 张愈延 (1.井冈山大学医学院,江西,吉安343009;2.井冈山大学附属医院,江西,吉安343000) 摘要:目的评价端粒酶转染对角膜内皮细胞形态和功能的影响.方法将体外培养的猫角膜内皮细胞随机分 为3组,兔端粒酶基因转染组,正常对照组和皮生长因子组.培养30代后观察传代细胞形态和细胞周期各时 相细胞比例的变化,检测端粒酶逆转录酶蛋白和?型胶原的表达.结果兔端粒酶基因转染组细胞数目较正常对 照组和表皮生长因子组增多,伸展贴壁能力增强,表型正常,G广M期和s期细胞比例显着增加,端粒酶逆转录 酶蛋白和?型胶原的表达也较正常对照组增多.结论兔端粒酶转染可以促进猫角膜内皮细胞增殖且表型正常, 可以增强其伸展粘附能力和分泌功能,有利于防治角膜内皮失代偿. 关键词:端粒酶;基因转染;角膜内皮细胞;增殖 中图分类号:R772.2文献标识码:ADOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2012.02.021 TELoMERASEGENETRANSFECTIoNoNTHEPREVENTIoNoF CoRNEALENDoTHELIALDECoMPENSATIoN ZHANGYu-yan' (1.SchoolofMedicine,JinggangshanUniversity,Ji'all,jiangxi343009,China; 2.AffiliatedHospitalofJinggangshanUniversity,Ji'an,Jiangxi343000,China) Abstract0bjective:Toevaluatetheeffectsoftelomerasetransfectiononthemorphologyandfunctionof cornealendothelialcells.Methods:Catcornealendothelialcellsculturedinvitroweredividedinto3groups randomly,asrabbittelomerasetransfectiongroup,normalcontrolgroupandepidermalgrowthfactorgroup.After culturedfor30generations,cellmorphologyandcellratiochangeseachphaseinthecyclewereobserved,the expressionoftelomerasereversetranscriptaseproteinandcollagenIVwasdetected.Results:Rabbittelomerase transfectiongrouphadmorecellsthanthatinthenormalcontrolgroupandepidermalgrowthfactorgroup, stretchingadherentabilityofthecellswithnormalphenotypewasenhanced,cellratioinMphaseandSphaseof G2increasedsignificantly,theexpressionoftelomerasereversetranscriptaseproteinandcollagenIValso increasedthanthatofthenormalcontrolgroup.Conclusion:Rabbittelomerasetransfectioncanpromotethe proliferationofcatcornealendothelialcellwithnormalphenotype,canstrengthenthestretchingadhesionability andsecretionfunction,itisinfavorofthetreatmentofcornealendothelialdecompensation. Keywords:telomerase;genetransfection;cornea1endothelialcell;proliferation 角膜内皮细胞结构和功能的正常是维持角膜 透明性的重要前提.在婴幼儿,角膜内皮细胞可以 进行有丝分裂,但在成年后不再进行有丝分裂.当 内皮细胞损伤后,其缺损区由邻近的内皮细胞增 大,扩展和移行滑动来填补覆盖.所以,随着年龄 的增长,角膜内皮细胞的密度逐渐下降.当角膜内 皮细胞的密度由于各种病损的作用低于某一临界 值时,发生角膜水肿和大泡性角膜病变,称为角膜 内皮失代偿.如何恢复成年人角膜内皮细胞的有丝 分裂能力以及防治角膜内皮失代偿一直是眼科界 收稿日期:2011—12—18:修改日期:2012—02—17 作者简介:~(1958一),男,江西万安人,教授,主任医师,主要从事角膜病,青光眼,眼表 疾病等研究(E?mail:zyy8830669@sohu.com) 井冈山大学(自然科学版)85 的研究热点.本研究依据细胞衰老的端粒假说,用兔端粒酶逆转录酶(rTERT)转染猫角膜内皮细胞 为实验模型,探讨其对猫角膜内皮细胞形态和功能 的影响,以期恢复猫角膜内皮细胞的有丝分裂能 力,为进一步防治角膜内皮失代偿奠定基础. 1与方法 1.1plRES2一增强性绿色荧光蛋白(EGFP).rTERT 正义荧光真核表达载体的构建及鉴定 仿照文献[1]所采用plRES2一EGFP一人类端粒酶 逆转录酶(hTERT)正义荧光真核表达载体的构建 方法和步骤操作,采用NotI酶切法进行连接方向 性的鉴定. 1.2猫角膜内皮细胞实验室培养 取健康家猫新鲜眼球数只,用无菌PBS溶液 冲洗干净后,抗生素D—Hanks液(含青霉素100U/mL, 链霉素100mL)浸泡30min,按照参考文献[2]所 采用的方法进行实验室培养,制成细胞悬液,调整 细胞密度约100~106-L一1,每孔200止接种于24孔 培养板中.培养板每6孔为1组,分为3组,分别 命名为端粒酶基因转染组(A组),正常对照组(B 组)和表皮生长因子组(C组);A组拟进一步转 染rTERT,B组不作任何处理,C组基础培养液中 加入表皮生长因子,放在37?,5%CO2培养箱中 进行饱和湿度培养.原代猫角膜内皮细胞培养36h 后换液1次.以后每2d换液1次,备用. 1.3rTERT导入原代猫角膜内皮细胞 采用Lipofectin试剂盒,通过脂质体法,按照 试剂盒操作说明和文献[3]所采用的hTERT转染原 代培养的人类胚胎成纤维细胞的操作方法,在实验 室条件下将rTERT转染导入A组原代猫角膜内皮 细胞中,原培养条件下继续体外培养. 1.4细胞周期的流式细胞仪检测 将转染rTERT猫角膜内皮细胞(A组)继续 培养36h后,按照参考文献[4]所介绍的方法处理 后,进行流式细胞仪检测并分析细胞生长周期.同 期,同条件下培养的B组和C组猫角膜内皮细胞也 按照相同操作方法进行流式细胞仪检测分析细胞 生长周期. 1.5细胞形态学观察 将培养至30代A组,B组和C组角膜内皮细 胞分别放在倒置相差显微镜下观察形态变化. 1.6猫角膜内皮细胞外源性rTERT蛋白和?型胶 原的表达 采用蛋白印迹法,对培养至30代A组,B组 和C组角膜内皮细胞,按照文献[5】所述的详细步骤 操作,进行猫角膜内皮细胞外源性rTERT蛋白和? 型胶原的表达量的检测.当正常猫角膜内皮细胞, 猫角膜内皮细胞.rTERT及猫角膜内皮细胞一EGFP 达90%融合时,再参照文献[3]进行操作,扩增后 分别命名为猫角膜内皮细胞一rTERT和猫角膜内皮 细胞.EGFP. 1.7统计学分析 细胞周期各时相细胞计数结果均以(4-s)表 示,用SPSS11.5统计学软件进行计量样本的单因 素方差分析. 2结果 2.1细胞形态变化 倒置相差显微镜下发现,A组猫角膜内皮细胞 数量明显增多,易于聚集成群,贴壁范围较广,细 胞较大呈不规则形状,部分呈六边形,周边细胞可 见伸出伪足;B组猫角膜内皮细胞较小,贴壁细胞 较少,多呈圆形或椭圆形团状;C组猫角膜内皮细 胞也见增多,但细胞多呈悬浮状态,贴壁较少,伪 足不明显.随着培养时间延长,A组,C组细胞数 量较B组增多更为明显. 2.2细胞生长周期变化 经单因素方差分析,与B组相比,A组,C组 Go,Gl期(G0:静止期;G1:DNA合成准备期)细胞 比例显着下降(尸<O.05),三组间两两比较具有统 计学意义(尸<0.05);与B组相比,A组,C组 G2,M期(G2:DNA合成后期;M期:有丝分裂期) 细胞比例显着提高(P<0.05),但A组和C组G2,M 期细胞比例的变化>0.05)在0【=0.05检验水准上 无统计学意义;与B组相比,A组,C组S期(S期: DNA合成期)细胞比例显着提高<0.05),三组间 两两比较具有统计学意义(P<0.05). 表1兔端粒酶基因转染和表皮生长因子应用对猫角膜内 皮细胞周期各时相细胞比例的影响 Table1Rabbittelomerasegenetransfectionandepidermal growthfactoroncatcornealendothelialcellcyclephasesof cellproportioneffects 尸>O05,A组,C组比较(单因素方差分析.SNK-q检验) 井冈山大学(自然科学版) 2.3TERT蛋白和?型胶原表达量的变化 蛋白印迹法检测发现,猫角膜内皮细胞,猫角 膜内皮细胞一rTERT,猫角膜内皮细胞一EGFP中均有 TERT蛋白表达,但猫角膜内皮.rTERT细胞中 TERT蛋白表达量明显高于猫角膜内皮细胞和猫角 ,说明 膜内皮细胞一EGFP,而且部分为rTERT蛋白兔端粒酶逆转录酶已经成功转入猫角膜内皮细胞, 并且开始有兔端粒酶逆转录酶蛋白的表达.另外, 猫角膜内皮一rTERT细胞?型胶原表达量较正常猫 角膜内皮细胞及猫角膜内皮细胞一EGFP也显着增 加. 3讨论 3.1端粒酶结构与猫角膜内皮细胞的研究 端粒酶是一种特殊的核糖核酸蛋白质聚合物, 是依赖RNA的DNA聚合酶.C~ryfeR等于1997年 提出了细胞衰老的端粒假说,即细胞衰老和永生假 说,这种假说认为细胞衰老是端粒复制问题得不到 补偿的结果,端粒的缩短是正常体细胞老化的有丝 分裂钟,当端粒长度缩短到一定程度,即所谓的末 端限制片段(1rI)的长度为5,7kb时,就有信号 指令细胞退出细胞周期,有丝分裂便不可逆地被阻 断在细胞周期的Gl期和G2PM期之间的某个时期, 这时的细胞便进入了老化期,随后死亡【6J.近年来, 细胞衰老的端粒假说得到越来越多的研究结果所 支持,也获得越来越多的科学家的认可和肯定.许多研究表明体外培养细胞的老化加速与细胞染色 体末端的端粒随细胞分裂次数的增多而逐步缩短 有关.例如有证据表明全世界第一只克隆羊多莉的 过早衰老和它的细胞中染色体端粒比正常的同龄 山羊的端粒短20%有关,所以有人称多莉是"披着 小羊皮的老羊"[71.ShielsPG等研究【8J表明,生殖 细胞之所以具有较强的有丝分裂能力,在于其端粒 酶活性处于高活性状态,其端粒长度长期维持在一 个恒定的高水平;各种干细胞和婴幼儿的角膜内皮 细胞,和某些动物细胞(例如兔角膜内皮细胞)之 所以保持潜在的有丝分裂能力,在于其端粒酶处于 弱活性状态;而绝大多数人类体细胞的端粒酶处于 失活状态,无法进行有丝分裂,损伤后无法增殖再 生,例如成年人角膜内皮细胞就是如此.目前眼科 界普遍认为,猫角膜内皮细胞和成年人角膜内皮细 胞具有相同的增殖特性,失去了有丝分裂能力.由 于正常成人角膜内皮细胞不容易获取,影响因素较 多,实验条件不容易掌控,而猫角膜内皮细胞容易 获取,体外培养条件成熟,实验容易掌控,所以本 次研究动物模型选用猫角膜内皮细胞作为实验对 象,间接探讨端粒酶基因转染对成人角膜内皮细胞 结构和功能的影响.端粒酶是由三个部分构成的, 即端粒酶逆转录酶(TERT),端粒酶RNA模板(TR) 和端粒酶相关蛋白【9】.由于目前对TERT研究得较 为清楚,它是端粒酶蛋白的催化亚单位,有相关研 究领域成功经验可以借鉴,实验试剂购买比较容 易,所以本次研究选用TERT作为转染基因,通过 将兔端粒酶逆转录酶(rTERT)转染至端粒酶失活 复 细胞——猫角膜内皮细胞中,以期恢复或部分恢猫角膜内皮细胞的有丝分裂能力,构建"永生化" 的猫角膜内皮细胞,为角膜组织工程提供种子细 胞,并为进一步防治角膜内皮失代偿奠定基础. 3.2端粒酶基因转染与角膜内皮细胞的生长 本研究结果显示,猫角膜内皮.TERT细胞中 TERT蛋白表达明显高于猫角膜内皮细胞和猫角膜 内皮一EGFP,而且部分为rTERT蛋白,表明rTERT 已成功转染至猫角膜内皮细胞,并且开始有rTERT 蛋白的表达.猫角膜内皮细胞经过兔端粒酶逆转录 酶转染后,TERT蛋白表达量和?型胶原表达量比 正常猫角膜内皮细胞和猫角膜内皮细胞.EGFP增 加,说明外源性端粒酶基因转入后,猫角膜内皮细 胞蛋白表达功能正常,端粒酶失活抑制状态可能得 到了某种程度上的解除,预示端粒酶活性在体外培 养条件下可以在一定程度上进行掌控,适合于基因 工程研究对目的基因的要求.?型胶原是角膜后弹 力层的主要成分,主要由角膜内皮细胞分泌,有利 于角膜内皮细胞的粘附和维持其固有的六边形结 构,说明兔端粒酶逆转录酶导入后,猫角膜内皮细 胞分泌功能增强,有利于其伸展和粘附,缩短损伤 后的修复时间,改善修复质量,为防止角膜失代偿 奠定基础.本研究细胞周期流式细胞仪检测结果表 明,转染兔端粒酶基因后,猫角膜内皮s期和G2-M 期细胞比例明显增高,而GonG1期细胞比例明显下 降,和正常对照组的差别有统计学意义.尤其是S 期细胞比例,相对于表皮生长因子组细胞也具有显 着性差异,说明转染兔端粒酶逆转录酶相对于表皮 生长因子来说,可以促使更多的细胞进入S期,具 有更强的促进细胞进行有丝分裂的能力,可以延长 猫角膜内皮细胞的生命周期,传代数增多,延长猫 井冈山大学(自然科学版)87 (上接第79页) [4】MillingtonRJ,QuirkJPPermeabilityofporous media[J].Trans.FaradaySoc.,1961,57(1o):1200—1207. [5】刘建立,徐绍辉,刘慧.估计土壤水分特征曲线的间接 方法研究进展[J]_水利,2004,2:68.78. [6]程金茹,郭择德,郭大波.非饱和土壤特性参数获取方 法[J].水文地质工程地质,1996,2:9-13. [7]弗雷德隆德DG拉哈尔佐H.非饱和土土力学【M】. 陈仲颐,张在明,陈愈炯,等译.北京:中国建筑工业 出版社.1997. [8】邵龙潭,梁爱民,孙健,等.非饱和土稳态渗流试验装 置的研制与应用[J】_岩土工程,2005,27(11): l338.1340. [9]MualemYAnewmodelforpredictingthehydraulic conductivityofunsaturatedporousmedia[J].Water Resour.Res.,1976,12:513-522 [10】MualemDaganGMethodsofpredictingthehydraulic condu~ivityofunsaturatedsoils[J].ResearchProfect, 1976,332:78.