改变细胞膜脂肪酸组成防治大肠癌的基因治疗研究

改变细胞膜脂肪酸组成防治大肠癌的基因治疗研究 2010年第37卷第4期 改变细胞膜脂肪酸组成防治大肠癌的基因治疗研究* 李茂刚夏立建?葛银林?李馨? 摘要利用脂肪酸去饱和酶基因fat-1改变细胞膜脂肪酸组成，进行大肠癌的基因治疗研 究。方法:将fat-1基因插入目的: 腺病毒载体中，与骨架载体同源重组，构建腺病毒重组载体(Ad-GFP-fat1)，通过包装 细胞系(293)产生的腺病毒，感染人大肠癌株HT-29细胞。提取细胞的总RNA，以fat-1基 因的反义mRNA作探针，用NorthernBlot检测fat-1基因在HT-29细胞内的表达。以流式细 胞仪对HT-29细胞G0/G1期、S期、G2/M期所占比例进行检测，分析fat-1基因对HT-29细 胞增殖和凋亡的影响。以气相色谱分析仪分析fat-1基因对HT-29细胞细胞膜n-6PUFAs和 n-3PUFAs含量及n-6/n-3PUFAs比例的影响。将HT-29细胞皮下接种于裸鼠右前肢腋下，建 立裸鼠HT-29大肠癌细胞皮下移植瘤模型。成瘤后进行治疗实验，经连续5次治疗，于最后 一次治疗后第3天处死小鼠，取肿瘤称重。分析fat-1基因裸鼠体内抗肿瘤效果。结果:通 过基因重组技术，得到高滴度的含fat-1基因的重组病毒;腺病毒介导的fat-1基因能够在 HT-29细胞中有效表达;fat-1基因的表达可降低HT-29细胞膜n-6/n-3PUFAs的比例，有效 抑制HT-29细胞增殖，促进细胞凋亡并能抑制裸鼠移植瘤的发展。结论:fat-1基因的表达， 可抑制HT-29细胞的体内外增殖并诱导细胞凋亡，在大肠癌基因治疗中可能具有良好利用价 值。 关键词腺病毒载体细胞膜多不饱和脂肪酸大肠癌基因治疗 doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2010.04.006 GeneTherapyforColorectalCancerbyChangingFattyAcidsCompositionofCellMembraneLIMaogang1,XIALijian2,GEYinlin3,LIXin3 Correspondingauthor:XIALijian,E-mail:xiaalbert2758@163.com 1 2 3WeifangMedicalCollege,Weifang261042,ChinaDepartmentofGastrointestinalSurgery,QianfoshanHospitalofShandongProvince,Ji’ nan250014,ChinaDepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266021,ChinaAbstractObective:Toexploretheeffectofthefat-1geneencodingn-3fattyaciddesaturaseontheproliferationandGrantsupport:FundedbyPublicHealthBureauofShandongProvince(2005HZ076) apoptosisofhumancoloncancercelllineHT-29andtoexploreitsvalueinthegenetherapyforcolorectalcancer.Methods:Thefat-1genewasclonedintoadenovirusshuttlevectorpAd-CMVandthenrecombinatedwithbackbonevectortocon-structarecombinantadenoviralvectorpAd.GFP.fat1.Thevectorwastransfectedinto293cellstogettherecombinantvirusinfectedhumancoloncancercelllineHT-29.TotalRNAofthecellswasanalyzedbyNorthernblot.Theeffectoffat-1geneontheproliferationandapoptosisoftheinfectedcellswasanalyzedbyflowcytometry.Thecontentofn-6PUFAs/n-3PUFAswasanalyzedbyGasChromatography.Theanti-cancereffectoffat-1genewasstudiedonHT-29xenograftsinnudemiceinvivo.Results:Thehightiterrecombinantviruswasobtained.Fat-1genecanbehighlyexpressedinhumancoloncancercelllineHT-29.Comparedwiththatofthecontrolcells(Ad.GFP),proliferationofHT-29cellswasi nhibitedbyfat-1gene.Fat-1genecanlowertheratioofn-6/n-3PUFAs.Thegrowthoftumorsinn udemiceisalsoinhibitedbyfat-1gene.Conclu?sion:Fat-1geneisofgreatvalueinthegeneth erapyforcolorectalcancer. KeywordsAdenovirusvector;Cellmembrane;Polyunsaturatedfattyacids;Colorectalcancer ;Genetherapy近年研究表明，饮食中脂肪酸的摄入量不均衡 是诱发大肠癌的一个主要危险因素,1,。维持细胞稳 态和正常生长的并不是n-6多不饱和脂肪酸(n-6 polyunsaturatedfattyacids，n-6PUFAs)和n-3多不饱 和脂肪酸(n-3polyunsaturatedfattyacids，n-3PUFAs) 的绝对水平，而是n-6/n-3PUFAs的比例。正常细胞的n-6/n-3PUFAs比例约为1:1,2,。fat-1基因来源于小秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)，由美国华盛顿大学Spychalla等,3,于1997年首次克隆，并确认了fat-1cDNA的序列，其表达产物是n-6多聚不饱和脂肪酸去饱和酶(n-6fattyacidsdesaturase)，它以16~20碳的n-6PUFAs为底物进行脱氢反应，生成n-3PU-单位:潍坊医学院临床学院(山东省潍坊市261042);?山东省千佛山医院胃肠外科;?青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室??本文课题受山东省卫生厅科技计划基金资助(编号:2005HZ076)通讯:夏立建xiaalbert2758@163.com改变细胞膜脂肪酸组成防治大肠癌的基因治疗研究 FAs，从而改变细胞膜中n-6/n-3PUFAs的比例。本研究为探讨fat-1基因的生物活性及其在肿瘤防治中的作用，构建了fat-1腺病毒重组载体，, 并在体内外研究其对肿瘤生长的抑制作用，为开展肿瘤基因治疗奠定基础。1材料与方法1.1 主要材料 质粒pCE8(内含fat-1cDNA)、腺病毒骨架质粒载体pAdEasy-1、穿梭载体PadTrack-CMV(含绿色荧光蛋白Greenfluorescentprotein，GFP基因)、菌株均为青岛大学医学院生化与分子生物学教研室保存;, 人大肠癌细胞HT-29购自中科院上海细胞库;DMEM/F12培养基、Trizol试剂、胎牛血清、Lipofectami-neTM2000、限制性内切酶、T4DNA连接酶。1.2方法 1.2.1 fat-1基因重组腺病毒(Ad)的构建 携带fat-1 基因的重组腺病毒参照Kang等,4,报道的方法构建。双酶切消化克隆载体pCE8获得fat-1基因的cDNA，插入穿梭载体，与腺病毒骨架载体进行同源重组，得到2株重组病毒:Ad-GFP(只携带绿荧光蛋白基因)和Ad-GFP-fat-1(携带fat-1和GFP基因)。通过酶切消化和DNA测序，确证载体的结构是正确的。通过293细胞的包装，制备高滴度的重组病毒储液。1.2.2 细胞培养和病毒转染 HT-29细胞培养在含 5%FBS的DMEM/F12培养液中，37?，5%CO2和98%相对湿度条件下进行培养。当细胞呈70%融合状态生长时，进行病毒转染。24h后换正常的培养液。48h后，进行紫外显微拍照。1.2.3RNA表达分析 fat-1基因的mRNA用Northern Blot测定。提取HT-29细胞总RNA，甲醛变性凝胶分离后转至尼龙杂交膜上，经反义RNA探针合成并纯化后与膜上的RNA杂交过夜，洗膜除去非特异性吸附，行X线片放射自显影， 1d后冲片。人β-actin基因作内部参照基因。 1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡‘取对数生长期细胞，以1.5×106个接种于250mL培养瓶中，37?5%CO2条件下培养24h，进行转染。设对照组(转染Ad-GFP)和实验组(转染Ad-GFP-fat-1)。转染48h后收集细胞，加入预冷的70%乙醇，4?固定12h，离心后重悬于PBS中，加入碘化丙啶染液，4?避光染色30min，用流式细胞仪以激发光波长488nm进行检测。1.2.5 细胞膜脂肪酸分析 取对数生长期细胞，以 3×106个接种于250mL培养瓶中，37?5%CO2条件下培养24h，进行转染。设对照组(转染Ad-GFP)和实验组(转染Ad-GFP-fat-1)。转染48h后，细胞用常规 方法消化并离心，PBS洗3次，将所收集的细胞置于冰冻干燥机内冻成固体干粉并对其甲酯化衍生后，置入HP5890SERIES?型气相色谱分析仪对甲酯化的细胞固体干粉进行细胞膜脂肪酸分析,4,。脂肪酸的含量通过比较各种被分析脂肪酸的面积与固定浓度的内部物面积而得出。1.2.6裸鼠HT-29细胞皮下移植瘤模型的建立及治疗 取0.2mL(5×107/mL)HT-29细胞皮下接种于裸 鼠右前肢腋下，建立移植瘤模型。接种第10天后将15只裸鼠分为3组(每组5只)进行治疗实验，即PBS对照组，Ad-GFP对照组，Ad-GFP-fat-1基因治疗组，PBS对照组于瘤体内注射PBS60μL:Ad-GFP对照组于瘤体内注射Ad-GFP60μL(2×109pfu/mL):实验组瘤体内注射Ad-GFP-fat-160μL(2×109pfu/mL)。均为隔天1次，共5次，终止治疗后第3天处死小鼠，取肿瘤称重。1.3 统计学处理 所得数据用SAS8.1统计软件进行统计处理，实验结果采用表示，两组间均数比较用t检验，α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。2结果 2.1 fat-1基因在HT-29细胞中的表达 转染Ad-GFP-fat-1并表达fat-1基因的细胞，因表达GFP，表现为亮绿色荧光。在转染后2d，可见60%,70%的细胞受到转染(表达GFP基因)，见图1。fat-1mRNA在Ad-GFP-fat-1转染细胞中呈高表达，但在Ad-GFP(对照)转染的细胞中fat-1mRNA表达阴性(图2)。 A:transfectedwithAd-GFP(control);B:transfectedwithAd-GFP-fat-1图1 转染fat-1基因的HT-29细胞荧光显微镜观察结果 Figure, 1 TheHT-29cellstransfectedwithfat-1geneobservedunder fluorescencemicroscope 2.2转染fat-1基因对HT-29细胞周期和凋亡的影响 转染含有fat-1基因的病毒48h后，处于G0/G1期HT-29细胞的百分率(69.11%?0.47%)较对照组(转染Ad-GFP组)(56.32%?0.38%)明显增高，且凋亡率20.35%?0.32%)较对照组(3.51%?0.24%)明显增加(P<0.01)。2.3 转染fat-1基因对HT-29细胞细胞膜脂肪酸含 , (2010年第37卷第4期 量的影响 与未转染的HT-29细胞相比，转染Ad-GFP-fat-1的HT-29细胞中n-6PUFAs含量降低 (P<0.01)，n-3PUFAs含量升高(P<0.01)，而转染Ad-GFP的对照细胞中n-6PUFAs及n-3PUFAs含量无变化。 mRNA1.4kbp 1 2 mRNA1.9kbp 1:HT-29cellstransfectedwithAd-GFP;2:HT-29cellstransfectedwithAd-GFP-fat-1 图2 转染Ad-GFP和转染Ad-GFP-fat-1HT-29细胞fat-1mRNA 表达的NorthernBlot分析结果Figure2 Analysisoffat-1mRNAinHT-29cellstransfectedwith Ad-GFPandAd-GFP-fat-1byNorthernblot 2.4Ad-GFP-fat-1的体内抗肿瘤作用 用HT-29细胞建立荷瘤裸鼠模型接受 Ad-GFP-fat-1治疗后，肿瘤生长明显减慢。经连续5次治疗，于最后一次治疗后第3天处死小鼠，取肿瘤称重。PBS对照组瘤重为(2.42g?0.24)g，Ad-GFP对照组瘤重为(2.12g?0.22)g，而Ad-GFP-fat-1基因治疗组瘤重为(1.08g?0.29)g，与PBS对照组及Ad-GFP对照组相比，Ad-GFP-fat-1基因治疗组肿瘤显著变小(P<0.01)。3 讨论 大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，其发病率近年来有上升趋势。对局限性病变，根治性切除术是目前可以治愈大肠癌的唯一方法，约70%的患者可手术治疗。但大肠癌初次手术后约50%的患者复发，且复发后再次手术切除率低,5,，而化疗、放疗等治疗方法也未能使其疗效得到明显的提高，所以大肠癌的治疗仍是十分棘手的问题。基因治疗是除了手术、放疗和化疗以外的一种新的肿瘤治疗手段，它有望成为肿瘤综合治疗的重要组成部分,6,。本研究体外实验证明，fat-1基因能在人类大肠癌细胞HT-29内有效表达并发挥功能，这种表达使得细胞膜n-6PUFAs含量降低、n-3PUFAs含量升高，n-6PUFAs/n-3PUFAs比例达到一个适宜的平衡点并能抑制HT-29细胞增殖，促进细胞凋亡。fat-1基因的表达能显著抑制HT-29细胞裸鼠移植瘤的生长。 20世纪90年代国外学者观察到n-3多不饱和脂肪酸可抑制肿瘤细胞的生长,7, ，临床研究表明在乳腺 癌和直肠癌患者的饮食中添加n-3PUFAs，可减轻或抑制肿瘤的发展,8-10,。因此，n-3PUFAs已成为研究的热点，人们更加注意到其作为药物和营养类化合 物的价值。也有研究表明，n-3PUFAs对肿瘤生长的影响依赖于n-6PUFAs的背景水平，即n-6/n-3PU-FAs的比例。当饮食中增加n-3PUFAs而同时又减少n-6PUFAs时，其治疗效果最大。所以，在饮食或组织中控制n-6/n-3PUFAs的比例是控制肿瘤发展的重要策略,11,。本研究通过气相色谱分析检测发现，fat-1基因编码的n-6PUFAs去饱和酶明显改变了HT-29细胞膜n-6/n-3PUFAs的比例，此基因可能是促进HT-29细胞凋亡、抑制其增殖的一个关键原因。 本研究体外实验结果表明，腺病毒介导的fat-1基因在人大肠癌细胞HT-29内的表达，可以作为控制n-6/n-3PUFAs比例的一个理想干预方法，降低了HT-29细胞膜n-6/n-3PUFAs的比例，有效地抑制了HT-29细胞的增殖，促进了凋亡，进而起到抗癌的效果。提示fat-1基因在大肠癌基因治疗中可能具有良好利用价值。 参考文献 1CalvielloG,DiNicuoloF,SeriniS,etal.Docosahexaenoicaciden?hancesthesusceptibilityofhumancolorectalcancercellsto5-?uorouracil[J].CancerChemotherPharmacol,2005,55(1):12-20.2SimopoulosAP.Theimportanceoftheomega-6/omega-3fattyac?idratioincardiovasculardiseaseandotherchronicdiseases[J].ExpBiolMed(Maywood),2008,233(6):674-688. 3SpychallaJP,KinneyAJ,BrowseJ.Identificationofananimalome?ga-3fattyaciddesaturasebyheterologousexpressioninAra-bi?dopsis.ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(4):1142-1147.4KangZB,GeYL,ChenZ,etal.AdenoviralgenetransferofCae?norhabditiselegansn-3fattyaciddesaturaseoptimizesfattyacidcompositioninmammaliancellsProcNatlAcadSciUSA,2001,98(7):4050-4054.5叶颖江,王 杉,周 静,等.DukesB期大肠癌患者术后辅助化疗的 疗效评价[J].中国肿瘤临床,2007,34(3):145-147. 6郑世营,张志德,李德春,等.腺病毒介导的FasL基因转移及对胃癌细胞生长和凋亡的影 响[J].中国肿瘤临床,2001,28(12):905-908.7 巩 涛,李 勇,范立桥,等.ω-3多不饱和脂肪酸对人胃癌 BGC-823细胞PGE2、SOD和MDA的影响[J].中国肿瘤临床,2006,33(19):1102-1104. 8HossainZ,HosokawaM,TakahashiK.Growthinhibitionandin?ductionofapoptosisofcoloncancercelllinesbyapplyingmarinephospholipid[J].NutrCancer,2009,61(1):123-130. 9HofmanováJ,Vaculová A,LojekA,etal.Interactionofpolyunsat?uratedfattyacidsandsodiumbutyrateduringapoptosisinHT-29humancolonadenocarcinomacells[J].EurJNutr,2005,44(1):40-51. 10Vaculov??A,Hofmanov??J,AnderabL,etal.TRAILanddocosa?hexaenoicacidcooperatetoinduceHT-29coloncancercelldeath[J].CancerLett,2005,229(1):43-48 11BerquinIM,EdwardsIJ,ChenYQ.Multi-targetedtherapyofcan?cerbyomega-3fattyacids[J].CancerLett,2008,269(2):363-377. (2009-10-23收稿)(2009-12-05修回) (邢颖校对)改变细胞膜脂肪酸组成防治大肠癌的基因治疗研究 : 单位: 刊名: 英文刊名: 年，卷(期): 被引用次数:李茂刚， 夏立建， 葛银林， 李馨， LI Maogang， XIA Lijian， GE Yinlin， LI Xin李茂刚,LI Maogang(潍坊医学院临床学院,山东省潍坊市,261042)， 夏立建,XIA Lijian(山东省千佛山医院胃肠外科)， 葛银林,李馨,GE Yinlin,LI Xin(青岛大学医学院生 物化学与分子生物学教研室)中国肿瘤临床CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY2010， 37(4)0次 1.Galviello G.Di Nicuolo F.Serim S Docosahexaenoic acid enhances the susceptibility of human colorectal cancer cells to 5-θ uorouracil 2005(1) 2.Simopoulos AP The importance of the omega-6/omega-3 fatty acid ratio in cardiovascular disease and other chronicdiseases 2008(6) 3.Spychalla.JP.Kinney A.J.Browse.J Identification of an animal omega-3 fatty add desaturase by heterologous expression inAra-bidopsis 1997(4) 4.Kang ZB.Ge YL.Ghen Z Adenoviral gene transfer of Gaenorhabditis elegans n-3 fatty acid desaturase optimizes fatty acidcomposition in mammalian cells 2001(7) 5.叶颖江.王杉.周静.丘辉.梁斌.姜可伟.许峰.谢启伟.尹慕军.杨晓东 Dukes B期大肠 癌患者术后辅助化疗的疗效评价[期刊论文]-中国肿瘤临床 2007(3) 6.郑世营.张志德.李德春.葛锦锋.匡玉庭 腺病毒介导的FasL基因转移及对胃癌细胞生 长和凋亡的影响[期刊论文]-中国肿瘤临床 2001(12) 7.巩涛.李勇.范立桥.赵群.宋振川.张志栋 ω-3多不饱和脂肪酸对人胃癌BGC-823细胞 PGE2、SOD和MDA的影响[期刊论文]-中国肿瘤临床2006(19) 8.Hossain Z.Hosokawa M.Takahashi K Growth inhibition and induction of apoptosis of colon cancer cell lines by applyingmarine phospholipid 2009(1) 9.Hofmanová J.Vaculova A.Lojek A Interaction of polyunsaturated fatty adds and sodium butyrate during apoptosis in HT-29human colon adenocarcinoma cells 2005(1) 10.Vaculová A.Hofmanová J.Anderab L TRAIL and docosahexaenoic add cooperate to induce HT--29 colon cancer cell death2005(1) 11.Berquin IM.Edwards IJ.Chen YO Multi-targeted therapy of cancer by omega-3 fatty adds 2008(2) 1.学位论文 司少艳 肝癌靶向调控SEA-CD80基因共表达腺病毒载体的构建及抗癌免疫 效应的研究 2006 原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，在肿瘤致死率的病因中占第二位，发病率呈逐年 上升趋势，严重威胁着人们的健康和生命。手术切除是目前治疗肝癌的首选，但由于肝 癌恶性程度高、发展迅速、容易复发和转移等特点，使肝癌总体疗效不尽如人意。因此，探 索新的肝癌治疗方案有着重要的意义。免疫治疗通过提高肿瘤细胞的免疫原性或效应细胞的 效应性，激发和增强机体的免疫机能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的，是继手术、放疗、 化疗之后出现的又一肿瘤治疗，为肿瘤的预防和治疗开辟了新的途径，近年来发展十分 迅速。 葡萄球菌肠毒素A(SEA)是一种强大的免疫激活剂，它无需抗原提呈细胞的加工处理，而 是以完整的蛋白形式结合于MHC-?类分子沟槽外侧，激活大量的T细胞，同时产生大量的细 胞因子，如TNF-α、IL-2、IFN-γ等，从而产生抗肿瘤效应。为了降低SEA在肿瘤治疗中对 正常MHC-?+细胞的毒副作用，本室首次构建了膜表达型SEA基因，使SEA表达在肿瘤细胞 表面，目的是使其诱导的免疫反应局限在肿瘤局部。SEA诱导的T细胞活化需要TCR和CD28 介导的活化信号的共同参与。而CD80是能够与CD28分子结合的共刺激分子之一，它与T细 胞表面CD28分子的结合为T细胞有效活化提供第二信号。肿瘤治疗的靶向性问题一直为人们 所关注，其中利用肿瘤特异性调控元件调控目的基因的表达是实现肿瘤靶向治疗的途径之一。 本研究的目的是利用本室已构建的膜表达型SEA基因，构建肝癌特异性AFP基因调控元件调 控的SEA/CD80基因共表达重组腺病毒载体，通过瘤内注射方式感染肿瘤细胞，导入SEA和 CD80基因，以提高肿瘤细胞的免疫原性，并提供有效诱导T细胞活化的共刺激分子，以诱导 机体的抗肿瘤免疫应答，对肝癌进行靶向免疫基因治疗，观察其抗癌效应并对其抗癌免疫机 理进行初步研究。 1.小鼠甲胎蛋白基因顺式调控元件的选择性克隆重组及功能研究目的:构建并选择高效的肝癌特异性甲胎蛋白(AFP)基因调控元件。方法:提取小鼠肝脏DNA，采用PCR方法克隆AFP基因增强子?、抑制子和启动子，经过不同组合构建两个真核表达载体:pEGFP-1-EP(含AFP调控序列?:增强子?+启动子)和pEGFP-1-ERP(含AFP调控序列?:增强子?+抑制子+启动子);采用LipofectamineTM2000脂质体体外转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6、黑色素瘤细胞株B16和成纤维细胞株NIH3T3，培养48h后，采用荧光显微镜观察和流式细胞术检测EGFP在上述转染细胞中的表达情况，以判断AFP调控序列?和?的转录调控活性及特异性，从中选择高效的肝癌特异性AFP调控序列。结果:所得AFP基因增强子?、抑制子和启动子序列与Genebank中公布的相关序列一致;荧光显微镜下:pEGFP-1-EP和pEGFP-1-ERP转染Hepa1-6细胞呈强阳性反应，pEGFP-1(空载体)转染Hepa1-6和三种质粒转染的B16、NIH3T3细胞均呈阴性反应;流式细胞术检测结果显示:pEGFP-1-EP转染Hepa1-6阳性细胞率和平均荧光强度高于pEGFP-1-ERP转染Hepa1-6细胞，两者阳性细胞率和平均荧光强度均高于pEGFP-1转染Hepa1-6细胞;pEGFP-1转染Hepa1-6和三种质粒转染B16、NIH3T3阳性细胞率和平均荧光强度均较低。结论:我们所构建小鼠AFP基因调控序列?和调控序列?转录调控活性均具有肝癌特异性，且前者高于后者。我们选择调控序列?作为下一步肝癌特异性基因治疗中使用。 2.SEA/CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及体外感染肝癌细胞的研究目的:构建肝癌靶向调控SEA、CD80基因重组腺病毒载体和SEA/CD80基因共表达重组腺病毒载体，了解其感染Hepa1-6细胞后SEA/CD80的表达情况及体外诱导淋巴细胞增殖活性。方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttle-CMV，构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒，命名为pShuttle2。采用PCR方法从已构建载体pLXSN-SEP亚克隆跨膜型SEA(SEAtm)基因，采用RT-PCR方法从小鼠脾脏克隆CD80基因，中间通过内部核糖体进入位点 (Internalribosomeentrysite，IRES)序列的连接将SEAtm和CD80克隆至pMD18-T-BIS，将AFP增强子、启动子、SEA及CD80基因分别从已构建的pKS-EP载体和pMD18-T-BIS载体上，分别亚克隆至pShuttle2载体，再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183。以获得的重组子转染HEK293细胞后，分别制备空载体腺病毒Ad-empty和重组腺病毒Ad-AFP-SEA(SEA)、Ad-AFP-CD80(CD80)、Ad-AFP-BIS(SEA/CD80)，然后分别感染Hepa1-6、NIH3T3和B16细胞。采用间接免疫荧光法，激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况;对Hepa1-6细胞以MOI为100的量感染腺病毒，采用MTT法观察腺病毒对Hepa1-6细胞生长的影响;采用3H掺入法检测Hepa1-6细胞感染腺病毒后体外诱导淋巴细胞增殖的活性。结果:成功制备了重组腺病毒Ad-AFP-SEA、Ad-AFP-CD80和Ad-AFP-BIS(SEA/CD80);以制备的重组腺病毒感染Hepa1-6细胞后，流式细胞术检测显示SEA和CD80能够在Hepa1-6细胞膜上表达，而在NIH3T3和B16细胞中不表达;激光共聚焦显微镜观察显示，SEA和CD80能够在Hepa1-6细胞膜上共表达;腺病毒本身对Hepa1-6细胞的生长无影响;诱导淋巴细胞增殖结果显示:Hepa1-6细胞感染Ad-AFP-BIS后对淋巴细胞增殖的诱导能力最强，Hepa1-6细胞感染Ad-AFP-SEA和Ad-AFP-CD80后对淋巴细胞增殖的诱导能力高于感染Ad-empty和未感染细胞。Ad-AFP-SEA和Ad-AFP-CD80感染的Hepa1-6细胞之间、Ad-empty和未感染的Hepa1-6细胞之间无明显差异。结论:构建了肝癌靶向调控的SEA、CD80基因重组腺病毒载体和SEA/CD80基因共表达重组腺病毒载体;腺病毒能够介导SEA/CD80在Hepa1-6细胞膜上的表达，且体外能够诱导淋巴细胞的增殖;对细胞的生长无直接毒性作用。为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向免疫基因治疗中的联合应用及其抗癌免疫机制奠定了基础。 3.SEA/CD80基因共表达重组腺病毒抗肝癌免疫效应的研究目的:检测SEA/CD80基因共表达重组腺病毒的体内免疫学效应，及对肝癌的治疗作用。方法:通过瘤体内注射重组腺病 毒的方式，对肝癌进行免疫基因治疗。采用RT-PCR和Westernblot方法检测注射重组腺病毒后的肿瘤组织和正常肝脏组织表达SEA和CD80的情况;采用ELISpot方法和LDH释放实验分别检测脾脏淋巴细胞中肿瘤特异性IFN-γ分泌细胞的频数和细胞毒性T细胞(CTLs)杀伤活性;观察重组腺病毒对肿瘤的治疗作用。结果:注射重组腺病毒后，SEA和CD80能够有效地在肿瘤组织中表达，在正常肝脏组织中不表达;与SEA组、CD80组比较，SEA/CD80组脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量明显增多(P,0.01)，CTL对Hepa1-6细胞的特异性杀伤作用明显增强(P,0.01);在肿瘤治疗实验中，SEA/CD80组肿瘤体积明显小于其它组(P,0.01)，荷瘤小鼠生存期显著大于其它组(P,0.01)。结论:腺病毒介导的SEA/CD80联合免疫基因治疗能够刺激机体产生肿瘤特异性的细胞免疫，对肝癌有良好的治疗作用。 本研究成功地从小鼠肝脏克隆了AFP增强子?、抑制子和启动子，经组合后形成两个调控序列:?AFP增强子?+启动子(EP)，?AFP增强子?+抑制子+启动子(ERP)，并对其转录调控活性进行了比较，结果显示两个调控序列对外源基因的表达调控都具有肝癌特异性，但EP转录活性高于ERP;成功地从小鼠脾脏克隆了CD80基因，并对本室首次构建的跨膜型SEA(SEAtm)进行了亚克隆，利用现有的穿梭质粒pShuttle和pShuttle-CMV构建了新的多克隆位点上游不带启动子，下游带有SV40polyA加尾信号的穿梭质粒，采用AdEasyTM腺病毒制备系统，通过SEA和CD80基因中间插入IRES元件首次构建了肝癌靶向性SEA/CD80共表达重组腺病毒载体Ad-AFP-BIS;体内外实验证实Ad-AFP-BIS感染肿瘤细胞后，能够使肿瘤细胞有效地共表达CD80和跨膜型SEA，且体外能够诱导脾淋巴细胞的增殖，体内能够诱导机体产生肝癌特异性细胞免疫反应;荷瘤小鼠经瘤内注射重组腺病毒Ad-AFP-BIS治疗后，能抑制Hepa1-6肝癌的生长，提高荷瘤小鼠的生存率，延长生存期。本研究为肝癌的靶向免疫基因治疗提供了实验依据。 2.学位论文 李嘉 柯萨奇病毒B3腺病毒载体疫苗Ad/sVP1的构建及免疫效果的研究 2009 目的:柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type3，CVB3)感染所致的病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)严重危害人类健康，也是新生儿猝死的重要原因，目前尚无有效的预防方法。核酸疫苗的问世，为建立有效的预防方法提供了机会。本室前期的大量研究证明，以pcDNA3质粒为载体构建的多种核酸疫苗免疫小鼠后，仅可诱导产生低效价的中和抗体，不能有效阻止致死量病毒感染。因此，提高免疫原性、增强免疫效果是制备CVB3疫苗亟需解决的问题。 目前提高免疫效果的关键因素之一是开发具有较高基因转移率和靶向特异性的转基因载体。在众多载体体系中，复制缺陷型腺病毒载体系统(Replication-Defective AdenovirusVector System)以其广泛的宿主范围、极高的转染效率、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点，在疫苗载体选择中表现出优势，成为极具应用前景的基因转移载体。 VP1是CVB3的主要中和抗原，能诱导机体产生体液和细胞免疫，但用VP1基因构建的核酸疫苗免疫小鼠后产生的中和抗体效价偏低。其主要原因是VP1蛋白在转染细胞中可以表达，但却不能从转染细胞中自主释放，因而不能有效激发抗体应答。 人白细胞介素2(Human interleukin-2，hIL-2)信号肽是由20个氨基酸组成的高度疏水性序列，它可以将合成的蛋白质移向细胞膜并与细胞膜结合，然后把合成的蛋白质分泌到胞外，且可以在不同种属蛋白质间相互使用。本室前期曾将CVB3 VP1基因拼接到人白介素2(hIL-2)信号肽5’端构建了分泌性重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1，免疫小鼠可以增强中和抗体应答。 本研究利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒Ad/sVP1，并通过研究该疫苗免疫BALB/c小鼠后诱生的特异性免疫应答和病毒攻击后的免疫保护作用探讨这种疫苗的应用效果。 方法:(1)目的基因的扩增与鉴定以重组质粒pcDNA3/sVP1为模板，扩增带有信号肽的VP1基因。将扩增产物与pGEM-T载体连接，构建质粒pGEM-T/sVP1。转化DH5α大肠杆菌，提取质粒进行酶切鉴定和测序，筛选重组子。(2)重组穿梭质粒的构建将质粒pGEM-T/sVP1以合适的限制性内切酶进行双酶切，回收带粘末端的目的片段，将目的片断分别与经合适的限制性内切酶双酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接。经转化、筛选和酶切鉴定，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/sVP1。(3)重组腺病毒质粒的构建将质粒用内切酶Pme?线性化。利用 AdEasy系统，经两步法分别在大肠杆菌BJ-5183中与骨架载体pAdEasy-1同源重组，构建重组腺病毒质粒pAd/sVP1。用Pac?酶切鉴定。将阳性质粒转化入感受态E.coli DH5α，挑取阳性克隆。以碱裂解法大量提取，并用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法进行纯化。(4)重组腺病毒Ad/sVP1的包装与扩增将重组腺病毒质粒pAd/sVP1用内切酶Pac?线性化，以阳离子脂质体法转染HEK293(humanembryo kidney293 derived cell line)细胞，并观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达。冻融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293细胞，逐日观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)，及有否彗星样斑块(FOCI)形成。并经第三轮大量扩增，以提高病毒滴度。(5)病毒感染293细胞后48小时，提取细胞总蛋白及细胞培养液，通过SDS-PAGE和Western blot检测VP1蛋白的表达。(6)大量扩增重组腺病毒取Ad/sVP1以及本室保存Ad/VP1第三代病毒液感染293细胞，大量扩增重组腺病毒，并以冻融法收集病毒液。将收集到的病毒液利用大量腺病毒纯化试剂盒纯化病毒。(7)重组腺病毒滴度测定待293细胞在96孔板中生长至70-80,汇合时，以不同稀释倍数的上述病毒液感染细胞，感染后48小时GFP阳性细胞计数法测定病毒滴度。病毒滴度=荧光细胞数×病毒液的稀释倍数/病毒液量。(8)动物实验:将6,8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组，分别为PBS对照组、Ad/VP1组、Ad/sVP1组，每组18只，病毒液以PBS稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次每只接种1×107pfu，第0、16天分别免疫，共免疫2次;每次免疫后第14天，内眦静脉取血，分离血清，用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)及ELISA法检测血清CVB3特异性中和抗体和IgG抗体水平;第2次免疫后3周，每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液，采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)杀伤活性的检测;另每组12只小鼠用4LD50CVB3进行腹腔注射，观察并记录小鼠存活情况至感染后第21天;每组剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻击，注射病毒后第7天取血，用于血中病毒滴度的测定。 结果:(1)成功构建了pGEM-T/sVP1，测序和酶切鉴定证明符合预期结果。(2)成功构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/sVP1，酶切分析证明符合预期设计。(3)成功构建重组腺病毒质粒pAd/sVP1，用Pac?酶切得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的片段，PCR鉴定目的基因长度与预期值相符。(4)转染293细胞48小时后，荧光显微镜下观察到基因GFP的表达，重组腺病毒Ad/sVP1包装成功。初代病毒再次感染293细胞，在荧光显微镜下观察到逐日明显的细胞病变和荧光聚集，各代病毒感染细胞后均有彗星样荧光斑块形成。(5)重组腺病毒Ad/sVP1感染293细胞48小时后，经Western Blot检测，在细胞培养液中检测到VP1蛋白。(6)重组腺病毒Ad/vp1、Ad/sVP1大量扩增后的病毒滴度依次为:3.0×109 pfu/ml、5.0×108 pfu/ml。 (7)各次免疫后血清CVB3 VP1特异性IgG水平分别为:Ad/VP1组:1:56.10，1:168.27; Ad/sVP1组:1:66.68，1:503.50;而PBS组未检测到。单因素方差分析表明，Ad/VP1和Ad/sVP1组VP1特异性IgG逐次增加(P<0.01);末次免疫后二组比较，Ad/sVP1组抗体滴度高于Ad/VP1组(P<0.01)。(8)各次免疫后血清CVB3中和抗体水平分别为:Ad/VP1组 :1:8.41，1:31.77;Ad/sVP1组:1:8.91，1:44.87; PBS组未检测到。单因素方 差分析表明Ad/VP1和Ad/sVP1组中和抗体水平逐次增加(P<0.01);第2次免疫后Ad/sVP1组抗体滴度高于Ad/VP1组(P<0.05)。(9)小鼠脾淋巴细胞增殖增殖活性经单因素方差分析表明，以CVB3刺激时，各组间比较无统计学意义;以ConA刺激时，Ad/sVP1组高于其他二组(P<0.05)。 (10)小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明，Ad/sVP1组与Ad/VP1组杀伤率无统计学意义，但二者均高于PBS对照组(P<0.05)。(11)用3LD50 CVB3攻击小鼠后第7d，血清病毒滴度测定结果表明，Ad/sVP1和Ad/VP1组明显低于PBS组(P<0.05)，且Ad/sVP1组较Ad/VP1组显著降低(P<0.05)。(12)4LD50 CVB3感染小鼠后21d，Ad/sVP1组和Ad/VP1组生存率分别为:58.33,，41.67,，PBS组无存活。经过x2检验分析，尚不能确定三组之间有统计学差异。用Kaplan-Meier法进行生存分析，生存率曲线分布有差异，Ad/sVP1组生存状况好于PBS组(p<0.01)，但与Ad/VP1组比较无统计学意义。 结论:(1)本研究利用AdEasy腺病毒载体系统成功包装了重组腺病毒载体疫苗Ad/sVP1，在293细胞内可以表达并分泌至细胞外。(2)Ad/VP1和Ad/sVP1均能诱导小鼠产生中和抗体和特异性IgG抗体，增强脾淋巴细胞增殖活性，降低病毒攻击后血清病毒滴度，提高小鼠的生存率。(3)与Ad/VP1比较，分泌型重组腺病毒Ad/sVP1能更有效的提高体液和脾淋巴细胞增殖活性，降低病毒攻击后的小鼠血中病毒滴度，免疫效果优于Ad/VP1。 3.学位论文 张志云 靶向MDR1基因RNAi腺病毒载体的构建及肝癌细胞转染研究 2006 目的:构建针对MDR1的RNAi腺病毒载体，转染肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM，研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的影响，以及对P-糖蛋白(P-gP)表达和功能的抑制作用。 方法:1.通过分析PGE-1和pshMDR1基因序列，找到包含U6启动子和shRNA序列的完整shRNA表达单元，并且包含两个酶切位点XhoI和XbaI,与pshuttle的MCS的酶切位点吻合。利用XhoI和XbaI双酶切将shRNA表达单元构建到pshuttle，命名为pshuttleMDR1。2.将我们构建的pshRNA-MDR1经PmeI酶切成线形质粒，再进行去磷酸化以防止其自身环化，与腺病毒骨架质粒PAdeasy共同转化含重组酶的BJ5183菌株内完成重组腺病毒质粒PAd-MDR11。3.质粒PAd-MDR11经PacI酶切后产物加入到AD293细胞培养后完成病毒颗粒包装。4.将病毒感染肝癌耐药细胞株SMMC-7721/R流式细胞仪检测细胞膜表面P-gp表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的储留(P-gp功能试验)，激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内Rh123的分布，WesternBlot检测P-gp含量。 结果: 1.重组构建的pshRNA-MDR1及Padeasy-shMDR1载体经过PCR扩增后电泳分析均显示在相对分子质量600bp左右处有一条明亮的条带，符合阳性克隆的特性。 2.罗丹明123与细胞共培养30后经流式细胞仪检测结果提示，PAd-MDR11和PAd-MDR13转染的细胞平均荧光强度显著高于SMMC-7721/R细胞系细胞，阳性率为分别91.5,、90.8,，后者阳性率为29.7,，差异显著(p,0.05)。 3.用间接免疫荧光法检测细胞膜表面P-gp，经流式细胞仪检测可见各组细胞的阳性率分别是:SMMC-7721/S，26.3,;SMMC-7721/R,85.3,;SMMC-7721/R+PAd-MDR1122.9,;SMMC-7721/R+PAd-MDR1330.8,;SMMC-7721/R+PGE-1,85.8,。 4.WesternBlot检测P-gp蛋白表达的变化:经病毒感染的SMMC-7721/R在170Kd处的显色明显低于对照SMMC-7721/R，而与SMMC-7721/S细胞接近。 结论:成功地构建了靶向MDR1基因的RNAi腺病毒载体pAD-MDR11，并能有效降低肝癌耐药细胞MDR1mRNA的表达。 4.学位论文 孟红 表达HBVpreS2/S基因重组腺病毒的研制及其免疫学研究 2005 我国是乙型肝炎的高流行区，有50,-70,的人群受过乙型肝炎病毒(HBV)的感染。部分感染者转为慢性感染过程，造成肝功损害，并有证据表明HBV感染与肝癌的发生密切相关。HBV整合感染特性和免疫耐受机制又给乙肝的治疗带来困难，临床无特效药物，接种疫苗是 控制HBV感染的根本手段。现有的乙肝血源疫苗及基因工程多肽疫苗在若干方面不尽如人意，如铝佐剂仅具有单向免疫调节作用，缺乏诱生TH1方向的细胞免疫作用而导致部分接种对象产生无效免疫应答(尤其是成人)，接种次数多，成本高，需要冷链运输设备，尤其是部分人群对免疫注射有一定的恐惧心里，甚至拒绝接种。 那么，怎样才能使疫苗刺激机体产生THI、TH2双向免疫反应、提高免疫效果、减少注射烦恼? 目前乙肝基因工程疫苗成分为HBsAg蛋白，另外混有铝佐剂以增强免疫效果。 S基因第156-832区编码含226个氨基酸，该片段含有中和性a抗原决定簇位(主蛋白aa124-aa147区段)，能够广泛被MHC分子所识别，该序列保守且稳定，是制作疫苗的理想片段，已由研究分析表明:整个HBsAg主蛋白的结构，两个主要的亲水区?(aa24-aa79)和?(aa99-aa168)镶嵌于三个疏水区(分别位于aa7-aa23、aa80-aa98和aa169-aa226)之间。HBsAg中和性a抗原决定簇在亲水区?内，由两对二硫键(分别位于Cys124s-s-Cys137，Cys139-s-sCys147)形成双环(1oop)构型。 S蛋白及其基因虽然相对稳定，但是缺乏细胞免疫刺激表位，免疫原性较弱，因此在保留S基因基础上，补充含有能够刺激TH1方向免疫反应的抗原片段有望提高免疫效果。 preS2基因编码55个氨基酸的PreS2蛋白，是HBV与靶细胞结合的重要蛋白，也是理想的疫苗抗原，PreS2抗原有强的T、B细胞识别决定簇和肝细胞膜及B细胞膜结合的位点，在机体抗HBV感染免疫中起重要作用，实验证实单独用PreS1和PreS2抗原接种均能使其获得抵抗HBV感染的保护性免疫。preS的免疫原性比S强。另外，在preS2序列中没有半胱胺酸(Cys)残基，受立体结构的影响相对较少，利用基因工程表达产物容易模拟PreS2区的若干功能。 由此可见，在保留S基因基础上，补充抗原片段preS2有望提高免疫效果。同时，利用腺病毒载体通过感染呼吸道黏膜将疫苗抗原呈递给机体免疫系统，可避免注射之烦恼。 此外，由于铝佐剂可以强烈刺激机体产生高效的体液免疫反应，却不能刺激机体产生细胞免疫反应，因此，改进佐剂也将提高免疫效果。 目的: 根据上述思路，该课题参考报道文献方法，将乙肝病毒preS2-S基因片段插入腺病毒载体。采用不同佐剂、不同免疫途径、不同免疫时间在BALB/C鼠研究了其体液免疫反应和细胞免疫反应，探讨其在新型HBV疫苗开发中的价值。方法: 1.重组腺病毒载体的构建 1.1preS2/S基因的克隆根据GenBankHBVadr株preS2/S片段基因序列，设计引物，利用PCR法从“大三阳”乙肝患者血清标本中扩增出目的DNA片段，将PCR产物回收后与pUCm-T载体连接，转化DH5α。挑取阳性菌落，进行DNA序列分析，将测序结果与GenBank发表序列进行同源性分析。 1.2穿梭质粒pShuttlepreS2/S的构建设计带有Kpn?和Af?酶切位点的引物PCR扩增preS2/S基因，将PCR产物回收后与pUC-Teasy载体连接，并在DH5α扩增、提取质粒，用Kpn?、Afl?酶切pKApreS2/S，所得的片段经同样酶切的p-Shuttle穿梭载体连接，转化，筛选。 1.3重组的腺病毒载体的构建提取质粒pShuttlepreS2/S，用PI-SceI、I-CeuI双酶切，回收所需的目的基因片段，回收片段与经同样酶切的腺病毒载体PAdeno-X连接，转化E.coli，筛选，然后进行PCR鉴定并测序确定阳性克隆。 1.4重组腺病毒载体转染HEK293细胞及其preS2/S抗原的检测挑选阳性克隆扩增后，提取重组腺病毒质粒，经PacI酶切纯化后转染HEK293细胞，并用免疫荧光方法检查293细胞是否表达目的抗原。 2.动物试验 2.1预试验将获得的4株重组腺病毒疫苗分别免疫BALB/C小鼠，一个月时观察小鼠的一般情况，用ELISA检测特异性IgG抗体的产生，筛选毒性小而且免疫原性强的重组病毒株。 2.2动物免疫试验将初次筛选出的重组腺病毒分组免疫接种动物，分组为:重组腺病毒组、偶联佐剂重组腺病毒组;空载体病毒对照组和偶联佐剂空载体组。分别经鼻黏膜和皮下注射途径接种SPF级的BALB/C小鼠，并且以空佐剂作为阴性对照、商业疫苗HBsAg铝佐剂阳性对照(也分黏膜免疫途径和皮下免疫途径)。每2周接种1次，共接种5次。于接种疫苗3次后7d用ELISA初次检测小鼠体内特异性IgG抗体的产生，接种5次后7d最终检测诱导体液免疫和细胞免疫的效果。 实验结果: 1.克隆了preS2/S，通过穿梭质粒pShuttlepre将S2/S重组于腺病毒载体，并在HEK293细胞中转染获得了4株表达HBVpreS2/S重组腺病毒，接种重组病毒的293细胞可用免疫荧光检测到preS2/S表达。 2.动物免疫接种预试验4株重组疫苗中N4、N2无毒性且有一定效果(ELISAIgG抗体1:10);N3血清1:10稀释未测到IgG抗体;N1具有小鼠肠道毒性且免疫效果差(1:10)未测到IgG抗体。 3.动物免疫接种正式试验 3.1三次免疫后2周抗体检测重组腺病毒各组免疫小鼠血清在1:100稀释度均未检测到特异性血清IgG阳性抗体; 3.2五次免疫后1周抗体检测重组腺病毒鼻黏膜组(无佐剂)动物在1:100-1:800均可测得阳性IgG抗体(P/N值?2.1)。重组腺病毒诱导产生的IgG抗体水平低于重组腺病毒/佐剂组(P,0.05);重组疫苗/佐剂组(鼻黏膜接种)诱导小鼠产生抗体水平与商业腺病毒比较无明显差异(P,0.05)。皮下接种重组腺病毒或重组腺病毒/佐剂在1:100-1:800未测得阳性IgG抗体;各阴性对照组(空载体、空佐剂、二者偶联物)未测得IgG阳性抗体。 3.3细胞免疫检测 3.3.1小鼠NK杀伤活性重组腺病毒(50.9,)刺激机体产生高于常规疫苗(11.8,)的NK杀伤率与常规疫苗组比较P,0.01。 3.3.2小鼠诱生γ-干扰素和白细胞介素2的检测脾淋巴细胞体外培养后，重组腺病毒组黏膜接种(80pg/ml、89pg/ml)产生了高于商业疫苗组(46pg/ml、34pg/ml、)和正常对照组(40.9、IL-2:28.6)的γ-干扰素和白细胞介素2。 结论: 1.该课题制备的表达HBVpreS2/S的重组腺病毒鼻腔接种可诱导小鼠产生特异性IgG抗体，偶联佐剂可提高其免疫效果，滴度可达到商业疫苗注射途径诱导的IgG抗体水平。 2.重组腺病毒可刺激机体产生细胞免疫反应，重组腺病毒偶联佐剂优于商业疫苗。该结果提示本重组腺病毒作为预防性疫苗具有良好的应用前景，另外具有作为治疗性疫苗的潜在可能性。 5.学位论文 张琴 人MCHR2基因siRNA腺病毒载体构建、稳定细胞株建立及其蛋白质组学研究 2009 肥胖症作为一种营养代谢性疾病，是心脑血管疾病、糖尿病、高血压、高脂血症以及癌症等多种疾病的高危因素，现已成为全球性的健康问题。多年来研究发现肥胖的发生与下丘脑对摄食的神经内分泌调控密切相关，由下丘脑分泌的促食肽黑色素浓集激素(MCH)及其受体(MCHR1和MCHR2)的发现为肥胖发生机制及防治的研究提供了新的靶点。通过构建转基因和基因敲除动物模型已对MCH及MCHR1与肥胖及能量代谢的关系进行了深入细致的研究，但有关MCHR2的功能及其与肥胖的关系至今仍不清楚。因此，本课题一方面构建了靶向人MCHR2 基因的siRNA重组腺病毒载体，以便从动物水平研究MCHR2的功能;另一方面构建了两个稳定表达MCHR2基因的细胞株:SH-SY5Y-MCHR2及SHG-44-MCHR2，并利用这两个细胞株进行MCHR2功能的蛋白质组学研究，从细胞蛋白整体水平探讨MCHR2功能及作用机制。研究内容包括以下三个部分: 1.人MCHR2基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定。方法:人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体p SES-HUS上得到p SES-HUS-MCHR2siRNA，并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MCHR2siRNA，在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，感染稳定转染MCHR2的CHO细胞株CHO-MCHR2，RT-PCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响。结果:p SES-HUS-MCHR2siRNA经Kpn?、EcoR?双酶切后只有8500bp左右的条带，同时测序结果正确，证明构建成功。重组腺病毒质粒经Pac?酶切后可见一条4.5kb和一条约30kb的条带，表明同源重组成功。线性化同源重组的腺病毒，转染293细胞，于荧光显微镜下可见红色荧光表达。Adeasy- MCHR2siRNA(50pfu/cell)处理CHO-MCHR2细胞48h后，RT-PCR及Western Blot检测到MCHR2在转录与蛋白水平的表达都明显降低(相比Adeasy-SES-HUS对照组)。结论:成功构建MCHR2siRNA重组腺病毒载体，Adeasy-MCHR2siRNA腺病毒能有效地抑制CHO-MCHR2细胞中MCHR2表达，能够用于动物水平研究MCHR2功能。 2.稳定表达人MCHR2基因的SHG-44-MCHR2及SH-SY5Y-MCHR2细胞株的建立与鉴定。方法:?PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到 pcDNA3.1(+)，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)MCHR2，并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞，通过G418筛选，建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系，命名为SHG-44-MCHR2，用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达，并检测细胞内Ca2+流动。?用基因重组方法将MCHR2全长cDNA克隆到质粒pEGFPN1，构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2，并用 LipofectamineTM转染到SH-SY5Y细胞，通过G418筛选，建立稳定表达MCHR2的SH-SY5Y-MCHR2细胞系命名为SH-SY5Y-MCHR2，采用RT-PCR、Western blot检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果:?扩增出MCHR2全长cDNA;成功构建pcDNA3.1-MCHR2;RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测SHG-44-MCHR2到MCHR2的表达，并准确定位于细胞膜上。MCH作用于MCHR2后，可促使细胞内钙库释放Ca2+进而使胞内Ca2+浓度出现明显而短暂的升高，Ca2+振荡过程在MCH刺激后30,50s内完成。?成功构建真核表达载体pEGFPN1- MCHR2;RT-PCR、Western blot检测到SH-SY5Y-MCHR2细胞MCHR2的表达，激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的SH-SY5Y-MCHR2细胞融合蛋白定位于细胞膜，而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞(命名为SH-SY5Y-mock)EGFP定位于全细胞。结论:成功建立了稳定表达MCHR2基因的SHG-44-MCHR2及SH-SY5Y-MCHR2细胞株，为后续关于MCHR2功能的体外蛋白质组学研究打下了基础。 3.人MCHR2基因功能的蛋白质组学研究。方法:通过双向凝胶电泳分离MCH处理后的SHG-44-MCHR2细胞与其对照细胞SHG-44-mock、SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞总蛋白，并对2-DE条件进行优化，最终选取了SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞PH3-10NL胶条(上样量200μg)的电泳图进行PDQuest图像分析，MALDI-TOF质谱鉴定，Mascot软件查询SWISS-PORT蛋白质数据库;半定量RT-PCR检测INSIG2、ACOT8、IDH3A、PCK1、PFKFB4 mRNA水平变化，Western blot在蛋白质水平对IDH3A及PFKFB4进行验证。结果:MCH处理后的SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞用PH3-10NL胶条(上样量200μg)获得分辨率高、重复性好的细胞双向电泳图谱，图 像分析显示有43个蛋白斑点表达有差异，经MALDI-TOF检测，鉴定了34个可能蛋白，21个上调表达(IDH3A、PCK1、PFKFB4、ACSM5等)，13个下调表达(INSIG2、ACOT8、RAB2B等)。MCH处理后的SH-SY5Y-MCHR2细胞 IDH3A、PCK1、PFKFB4 mRNA表达上调，而INSIG2、ACOT8mRNA表达下调。IDH3A、PFKFB4蛋白质在MCH处理的SH-SY5Y-MCHR2细胞中表达上调。结论:MCH处理后的SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞有多种蛋白质差异表达，这些蛋白质参与细胞的脂代谢、糖代谢、能量代谢及细胞转运等多种信号通路，提示MCHR2可能通过这些蛋白质参与了能量平衡的调节，并可能与肥胖、糖尿病等疾病相关联。 6.期刊论文 司少艳.隋延仿.张秀敏.李侠.冯凯.韩瑞刚 肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体的构建及体外生物学活性鉴定 -中国肿瘤2007,16(7) [目的]构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因重组腺病毒载体.[方法]首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttle-CMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2.将AFP增强子、启动子及SEA基因分别从已构建的pKS-EP载体和pMDl8-T-SEA载体上,亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183.以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepal-6和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3.采用间接免疫荧光法,经荧光显微镜观察和流式细胞术检测SEA在细胞膜表面的表达.采用3H掺入法检测膜表达的SEA体外诱导淋巴细胞增殖的活性.[结果]SEA能够靶向性地表达在高表达AFP的Hepal-6细胞膜上,在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达,并且体外能够诱导淋巴细胞增殖.[结论]成功地构建了肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体,为进一步研究SEA在肝癌靶向基因治疗中的应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础. 7.学位论文 杜宏春 水通道蛋白-1在结核性胸腔积液中的变化及机制研究 2007 胸腔积液是肺、胸膜及其它许多全身疾病的常见临床表现之一，任何病理原因加速其产生和减少其吸收时，就会出现病理性的胸腔积液。 近20余年来，人们相继发现了细胞膜表面的离子通道(如Na<'+>、Cl<'->、K<'+>等离子通道)及多种水通道蛋白(AQPs)，并证实这些通道在细胞内外液体转运中发挥着极其重要的生理功能。水通道蛋白的发现彻底改变了人们对水分子跨越细胞膜转运基本理论的认识。 在与胸膜腔类似的腹膜腔，腹膜问皮细胞及腹膜下毛细血管有AQP1的大量表达;通过AQP1基因敲除的大鼠的动物实验表明，AQP1是腹膜透析中高渗液体超滤中水转运的主要通道。 但目前关于胸膜上的AQP1是否影响胸腔内液体的吸收尚有争议。小鼠脏层胸膜微血管的内皮及问皮细胞上有AQP1丰富表达，在鼠胸膜腔内渗透压增高时对水的转运起主要作用。但在其它引起胸腔液体短时间大量积聚的病理状态如结核、肿瘤性积液时，表达在胸膜上的AQP1的作用及地位如何?目前国内外尚未见报道。AQP1是否在促进病理性胸腔积液的形成中起着始动作用，还需要更深入的研究。 本研究旨在探讨AQP1在结核性胸腔积液大鼠胸膜上表达的变化及其作用，从而揭示结核性胸腔积液胸水转运的机制，并对其治疗提供靶点。主要研究内容如下: 1(建立结核性胸腔积液大鼠的动物模型，观察AQP1在结核性胸腔积液大鼠胸膜组织中的表达。 2(构建克隆有AQP1的复制缺陷型重组腺病毒。 3(重组腺病毒(Ad(rAQP-1感染大鼠胸膜间皮细胞以观察AQP-1基因在胸膜间皮细胞的表达情况及对其影响。 4(胸膜腔注射腺病毒将AQP-1基因转入胸膜，探讨上调AQP-1基因对正常大鼠及结核性胸腔积液大鼠的影响。 第一章.水通道蛋白-1在结核性胸腔积液大鼠胸膜上的表达。 目的: 探讨胸膜上水通道蛋白-1(AQP-1)的表达与结核性胸腔积液大鼠胸水形成之间的关系。 方法:48只健康Wistar大鼠随机分为实验组和生理盐水对照组，实验组根据动物处死时间分成结核性胸腔积液1d组，3d组，5d组和生理盐水对照组(每组各12只)，实验组胸膜腔内注入0.06mg(2ml)标准人型结核分枝杆菌，对照组则注射等体积生理盐水。应用免疫组织化学检测AOP-1在大鼠胸膜上的分布及蛋白质的表达，实时荧光定量R-(PCR及western blot方法检测各组大鼠AQP-1基因在结核性胸腔积液形成前后胸膜上mRNA及蛋白表达的变化。 小结: 结核性胸腔积液时大鼠脏、壁层胸膜的AQP-1表达增多，AQP-1的增多可能与结核性胸腔积液的形成有关。 第二章.大鼠AQP-1重组腺病毒载体的构建及鉴定。 目的: 构建克隆有大鼠水通道蛋白-1基因(rAQP-1)的重组腺病毒，并观察外源基因在细胞中的表达情况。为后续的动物体内实验奠定基础。 方法: 采用RT-PCR的方法从健康Wistar大鼠新鲜肾脏组织中提取出的总RNA中克隆rAQP-1基因，于Xba ?和Kpn ?位点亚克隆入腺病毒穿梭载体成为pAdTrack-CM V(rAQP-1;Pme?将其线性化后与腺病毒基因组载体pAdEasy-1共转染Ecoli BJ5183而同源重组为pAd(rAQP-1;再经Pac?酶切后转染HEK-293细胞进行重组腺病毒的包装，利用Western blot和RT-PCR的方法鉴定。经反复感染HEK-293对重组腺病毒进行大规模扩增纯化后，获得的病毒滴度为6.0×10<'10>pfu/mL。 小结:采用体外连接法分别成功构建了携带大鼠AQP-1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-AQP-1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为研究水通道蛋白-1在结核性胸腔积液中的作用奠定了基础。 第三章.大鼠AQP-1基因干预对结核性胸腔积液的影响研究。 第一节.重组腺病毒Ad(rAQP-1感染rPMCs以及基因的表达目的重组腺病毒Ad(rAQP-1感染大鼠胸膜间皮细胞以观察AQP-1基因在胸膜间皮细胞的表达情况及对其影响。 方法: 无菌操作下采用胸膜腔胰酶消化法获得大鼠胸膜间皮细胞，培养间皮细胞至3代，并使用免疫组化法对细胞进行鉴定。将重组腺病毒感染rPMC并同时做好对照组。细胞分组如下:实验组使用含rAQP-1重组腺病毒(Ad.AQP-1)感染rPMC(loaded rPMC/rAQP-1);对照组则使用不含AQP-1的重组腺病毒(Ad.GFP)感染rPMC(loaded rPMC/rAQP-1-)。用不同的感染倍数(multipleof infection，m.o.i)的Ad.r AQP-1/Ad.GFP感染rPMC，在荧光显微镜下观察感染效率，并用RT-PCR和Western blot方法检测外源基因r AQP-1在rPMC中的表达情况。并用流式细胞术检测Ad.rAQP-1对胸膜间皮细胞增殖的影响。 小结 : 1.胸膜腔胰酶消化法可成功的培养大鼠胸膜间皮细胞。 2.重组腺病毒Ad.rAQP-1对胸膜间皮细胞有高的感染效率。 3.重组腺病毒Ad.rAQP-1感染不影响胸膜间皮细胞的生长。 4.生理情况下AQP-1对胸膜间皮细胞的水的转运作用不大。 第二节.上调AQP-1基因表达对结核性胸腔积液大鼠的影响。 目的: 胸膜腔注射腺病毒将AQP-1基因转入胸膜，探讨上调AQP-1基因对正常大鼠及结核性胸 腔积液大鼠的影响。 方法: 结核性胸腔积液大鼠模型建立方法同前。36只Wistar大鼠随机分为六组:A组，正常对照组(6只);B组，结核性胸腔积液组(6只)，大鼠胸膜腔接种0.06mg结核杆菌后3天处死;C组，Ad-rAQP-1+结核杆菌接种组(6只)，大鼠胸膜腔注射5×10<'9>PFU重组腺病毒Ad-rAQP-1七天后胸膜腔接种0.06mg结核杆菌，动物于胸膜腔接种结核杆菌后3天处死;D组，Ad-GFP+结核杆菌接种组(6只)，大鼠胸膜腔注射5×10<'9>PFU对照腺病毒七天后胸膜腔接种0.06mg结核杆菌，动物于胸膜腔接种结核杆菌后3天处死;E组，Ad-rAQP-1组(6只)，正常大鼠胸膜腔注射5×10<'9>PFU重组腺病毒Ad-rAQP-1，注射7天后处死。F组，对照腺病毒Ad-GFP组(6只)，正常大鼠胸膜腔注射5×10<'2>PFU对照腺病毒，注射7天后处死。留取胸水及壁、脏层胸膜待检。采用免疫组化方法检测AQP-1蛋白表达。 小结 : 1(胸膜腔注射Ad-AQP1可有效上调胸膜组织AQP-1表达，胸膜腔是基因治疗的有效部位。 2(单独提高正常大鼠胸膜AQP-1水平不能引起胸腔积液。 3(预先提高胸膜AQP-1的水平，可加速结核性胸腔积液胸水形成。 4(AQP1可能与结核性胸腔积液胸水的形成有关。 结论: 结核性胸腔积液时大鼠脏、壁层胸膜的AQP-1表达增多;重组腺病毒载体Ad(rAQP-1可有效上调胸膜间皮细胞AQP-1表达，为动物体内实验提供一个好的解决方案;胸膜腔是基因治疗的有效部位，胸膜腔注射Ad-AQP1可显著上调胸膜组织AQP-1的表达;预先提高胸膜AQP-1的水平，可加速结核性胸腔积液胸水的产生。研究表明AQP-1在结核性胸腔积液的产生中起着重要作用，可为病理性胸腔积液的防治提供新的思路。 8.学位论文 杨世忠 HBx蛋白诱导肝癌细胞上皮-间叶样表型转化及其分子机制初步探讨 2006 既往大量研究提示乙肝病毒和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)发生关系密切，然而关于乙肝病毒对肝细胞癌侵袭转移影响的研究却很少;近年来，鉴于发现乙肝病毒X基因编码的HBx蛋白可以激活多个与肿瘤侵袭转移相关的原癌基因(如c-Src等)及转录因子，HBx蛋白在肝细胞癌侵袭转移中的调控作用开始引起关注。由于在HBx蛋白所激活的诸多原癌基因/信号通路中，酪氨酸激酶家族的c-Src是介导上皮-间叶样表型转化的关键因子之一，因此我们推想:HBx蛋白是否可以通过激活c-Src来诱导肝癌细胞发生上皮-间叶样表型转化，从而促进其侵袭转移呢? 上皮-间叶样表型转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)指上皮细胞获得了成纤维细胞样表型，其特征是细胞标志物改变和细胞内骨架重排等，其结果是细胞间粘附减弱、细胞运动能力大大增强。 为了检验我们的假想，本实验设计如下:首先，在肝细胞癌组织标本上，用免疫组化方法检测了HBx、活化型c-src、上皮标志物(E-cadherin、β-catenin、α-catenin)、间叶标志物(N-cadherin、vimentin、fibronectin)在肝细胞癌组织的表达，并评价其临床意义;然后，构建含HBx基因的重组腺病毒载体，包装产生腺病毒，并进一步感染SMMC-7721细胞。观察转染HBx基因后的SMMC-7721细胞的形态变化，并检测上皮标志物和间叶标志物的表达情况。再给予c-src激酶抑制剂PP2和阴性对照PP3，评价HBx蛋白是否通过活化c-Src来发挥诱导作用。最后，将腺病毒感染的SMMC-7721细胞接种到裸鼠皮下和脾脏，评价HBx蛋白对肝癌细胞在裸鼠体内生长和转移的影响。 本组实验主要的结果及结论如下: 1.76例肝细胞癌组织中，有52例(52/76，68.4,)HBx表达阳性，有38例(38/76，50,) 活化型c-Src表达阳性;上皮标志物在肝癌细胞膜的表达情况是，26例E-cadherin表达缺失(26/76，34.2,)，18例α-catenin(18/76，23.7,)表达缺失，15例β-catenin(15/76，19.7,)表达缺失;间叶标志物在肝癌细胞浆的表达情况是，N-cadherin有42例 (42/76，55.3,)表达阳性，Vimentin有9例(9/76，11.8,)表达阳性，Fibronectin有35例(35/76，46.1,)表达阳性。统计分析显示，E-cadherin和β-catenin等上皮标志物在肝癌细胞膜上的表达缺失，以及N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等间叶标志物在肝癌细胞浆中的阳性表达均与肿瘤静脉侵袭等相关，这就提示在肝癌细胞中，上皮标志物的表达减弱和间叶标志物的表达增强，可能协同促进了肝细胞癌侵袭转移;统计分析还表明，HBx表达和c-Src活化显著相关，并且两者均与E-cadherin表达缺失和N-cadherin阳性表达相关;这就提示，在肝癌细胞中，HBx可能通过活化c-Src同时调控了上皮标志物和间叶标志物的表达。 2.经过基因测序和酶切鉴定，HBx基因正确插入到所构建的重组腺病毒载体中，荧光显微镜下包装细胞中见到绿色荧光蛋白(GFP)表达;因此我们成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体及其阴性对照空载体;在腺病毒感染的靶细胞中，荧光显微镜下可见GFP表达，RT-PCR检测到HBxmRNA表达，Westernblotting和免疫细胞化学等方法检测到HBx蛋白表达。这说明，我们制备的重组腺病毒成功感染肝癌细胞株SMMC-7721，目的基因得到高表达。 3.腺病毒感染SMMC-7721细胞一周后，空载体对照组细胞维持母细胞的上皮样表型，而含HBx基因的实验组细胞转化为梭形，细胞离散;给予PP2后，实验组细胞由梭形恢复原来的上皮表型，而给予PP3后细胞形态无明显变化。这初步说明，HBx蛋白可以诱导肝癌细胞发生上皮-间叶样表型转化，而c-Src活化在其中发挥了关键作用。通过RT-PC、Westernblotting和免疫细胞化学等方法进一步检测转染HBx基因后，肝癌细胞标志物的表达变化，发现上皮标志物E-cadherin和α-catenin在实验组细胞中的表达水平显著低于对照组细胞，而间叶标志物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等在实验组细胞中的表达显著高于对照组;实验组细胞给予PP2后能够逆转上述HBx基因转染的效应，而给予PP3后无明显变化。这进一步提示，HBx蛋白通过活化c-Src诱导肝癌细胞发生了上皮-间叶样表型转化。 4.细胞运动实验和细胞侵袭实验结果显示:转染HBx基因的实验组细胞运动能力和侵袭能力显著强于对照组细胞;腺病毒感染的细胞接种到裸鼠脾脏后，实验组细胞形成的肝转移灶数目显著多于对照组。因此上述体外实验和体内实验结果都提示，HBx蛋白诱导肝癌细胞发生上皮-间叶样表型转化后，促进了肝癌细胞运动侵袭能力提高。 5.转染HBx基因后，SMMC-7721细胞生长曲线左移，倍增时间缩短，说明HBx蛋白促进了肝癌细胞生长;体内实验显示，转染HBx基因的实验组细胞在裸鼠皮下和脾脏接种后，形成的肿瘤体积和重量均显著大于对照组;因此，HBx蛋白促进了肝癌细胞生长。 综上所述，本研究主要结论如下: 1.HBx蛋白可以诱导肝癌细胞发生上皮-间叶样表型转化，其特征是肝癌细胞形态转化为梭形，E-cadherin等上皮标志物表达下调，而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等间叶标志物表达增强;而且发生上皮-间叶样表型转化后，肝癌细胞在体内、体外的运动和侵袭转移能力显著提高。 2.在HBx蛋白诱导肝癌细胞发生上皮-间叶样表型转化过程中，c-Src被活化并发挥了关键作用。 3.HBx蛋白可以促进肝癌细胞生长。 9.学位论文 刘本德 腺病毒介导肝细胞生长因子基因治疗缺血性心脏病作用机制的研究 2005 冠心病是一种常见的心脏疾病，冠心病病人由于心脏冠状动脉器质性病变和或功能性改 变，导致心肌血供不足，从而产生一系列临床症状和心脏结构及功能的改变。研究已证实，病变冠状动脉的病理变化主要包括冠状动脉壁出现脂质条纹、纤维斑块与复合病变三种情况。上述三种情况的基础主要包括管壁细胞的种类、数目、结构与功能发生改变，尤其是血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的变化。目前，有关冠心病的发病机制主要有脂浸润学说、损伤反应学说和单克隆学说、血栓形成和血小板聚集学说等。根据这些发病理论，目前临床上所用的治疗方法主要在于努力增加冠脉的供血从而减少心肌缺血的问题。目前临床上所使用的治疗方法虽然在一定时间内显著改善了缺血心肌的血供并提高了患者的生存时间与生存率，但尚不能改变冠脉病变的根本原因。 近年来，随着分子生物学研究的迅速发展，特别是人类基因组项目的成功实施，能够从分子到蛋白水平探讨冠状动脉粥样硬化发病的原因以及相关的治疗方法。目前已知，肝细胞生长因子(HGF)是一种多功能的细胞生长因子，分子量为103KD，其前体是由728个氨基酸残基组成的单链，经蛋白酶水解后可产生有生物活性的异二聚体，其作用受体为细胞膜上的C-MET受体，种属分析表明，人和大鼠的HGF具有高度的同源性。晚近的研究表明，HGF对缺血心肌细胞具有保护作用，然而其保护作用的机制并不十分清楚。为了探讨肝细胞生长因子治疗缺血性心脏病的作用机制，我们进行了本项实验研究工作，共分为三部分。第一部分:肝细胞生长因子基因重组腺病毒载体的构建 目的:利用AD-EASYTM系统，构建高效而又安全的肝细胞生长因子(HGF)基因腺病毒载体，以研究HGF基因在心脏内的表达，并研究其对血管内皮细胞，血管平滑肌细胞及心肌细胞的作用。并建立心肌缺血模型，观察该载体对心肌缺血的治疗作用。 方法:从人胎肝中抽提总RNA，并以该肝细胞总RNA为摸版，利用合成的一对引物，采用RT-PCR技术获得HGF基因的cDNA，并引入酶切位点，先转入感受态质粒，再转化大肠杆菌进行扩增，筛选阳性菌落，经酶切及测序，证实目的HGF基因已经转入，再将该基因转入pUC18质粒，pUC18质粒与AD-EASY质粒进行同源重组，用PacI酶切成线性化DNA，利用脂质胺转染293细胞，经三轮扩增，制备高效表达并用绿色荧光标志HGF基因重组腺病毒载体(Ad-HGF)。并将该载体作实验组，与HGF组作比较，观察对VEC的抗凋亡作用。 结果:在荧光显微镜发现293细胞发光率为100,，HGF基因重组腺病毒载体的HGFcDNA经过测序鉴定与基因库序列一致。Ad-HGF组与HGF组间无明显差异(P,0.05)。 结论:Ad-HGF和HGF具有其相同生物学效应，由于HGF合成昂贵，Ad-HGF合成成本低，效率高，为大量制备该载体提供依据. 第二部分:肝细胞生长因子基因对体外培养血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞的作用 目的:为研究腺病毒载体毒介导肝细胞生长因子(HGF)基因感染血管内皮细胞，血管平滑肌细胞及心肌细胞后，在不同情况下各种细胞的凋亡情况。 方法:用HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF)感染血管内皮细胞，血管平滑肌细胞及心肌细胞，先缺氧一小时后，收集各种细胞，以未感染Ad-HGF的内皮细胞为对照组，按凋亡试剂盒上的要求，用双染方法，进行流式细胞记数，观察不同情况下各组细胞的凋亡情况。 结果:1.血管内皮细胞在正常供氧和缺氧的情况下，感染组细胞凋亡数低于未感染组组(P,0.01)有显著意义。2.感染Ad-HGF的血管平滑肌细胞和未感染组，分别在正常供氧和缺氧情况下，细胞的凋亡和迁移情况二者(P,0.05)无明显差异。3.心肌细胞分别在正常供氧和缺氧情况下，感染组心肌细胞凋亡数低于未感染组。(P,0.05)，有显著意义。 结论:腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因感染内皮细胞后，能在缺氧和正常供氧情况下有效地阻止细胞发生凋亡;腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因感染心肌细胞后能在缺氧情况下阻止心肌细胞发生凋亡;但是，腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因感染血管平滑细胞后，在缺氧情况下不能很有效抑制细胞凋亡和迁移。 第三部分:Ad-HGF对心肌缺血的治疗作用 目的:研究心肌发生急性缺血时，直接转染Ad-HGF后心肌缺血的变化情况。 方法:12周的雄性WKY大鼠60只，随机分成二组，每组30只，常规消毒麻醉后，制造心肌缺血模型，采用直接转染方法，分别转染Ad-HGF及注射DMEM培养基到缺血大鼠心肌组织。其后，在不同的梗死时间取出大鼠的心脏组织，使用免疫组化方法，研究AD-HGF对不同梗死时间点大鼠心脏组织中各个区域心肌细胞凋亡数目、新生血管数目以及梗死心肌面积的影响。 结果:1.Ad-HGF转染组3天后HGF开始表达，第7天时表达效率最高，第14天时表达基本消失。免疫组化也证实AD-HGF感染组有HGF表达，DMEM组无任何HGF表达信号;2.两组新生血管数于更死后的前7天无明显差别，14天时差异显著(P,0.05)。3.第28天时发现Ad-HGF组的缺血区比DMEM组明显减小;4.AD-HGF感染组心肌细胞凋亡数明显少于对照组(P,0.01)。 结论:Ad-HGF能够促进梗死区域血管的生长，减少细胞凋亡的发生，减少心肌梗死面积。 10.期刊论文 司少艳.隋延仿.胡沛臻.张秀敏.葛伟.李增山.黄杨.SI Shao-yan.SUI Yan-fang.HU Pei-zhen.ZHANG Xiu-min.GE Wei.LIZeng-shan.HUANG Yang 肝癌靶向性SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定 -细胞与分子免疫学杂志2006,22(5) 目的:构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体.方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttle-CMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2.将AFP增强子、启动子、 SEA及CD80基因分别从已构建的pKS-EP载体和pMD18-T-BIS载体上,分别亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183.以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa1-6和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3.采用间接免疫荧光法,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达.采用 3H掺入法检测膜表达的SEA诱导淋巴细胞增殖的活性.结果:以制备的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,SEA和CD80能够靶向性地共表达在高表达AFP的Hepa1-6细胞膜上,而在不表达AFP的B16、 NIH3T3细胞膜上不表达.结论:成功地构建肝癌靶向性SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向基因治疗中的联合应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础. 本文链接: 授权使用:云南大学(yndx)，授权号:e5844879-96dd-419a-b264-9e2100f25b80 下载时间:2010年11月1日