瘦素增强脂蛋白酯酶和肝脂酶表达加速胰岛素抵抗肝细胞模型内脂肪代谢.doc

瘦素增强脂蛋白酯酶和肝脂酶达加速胰岛素抵抗肝细胞模型内脂肪代谢.doc 瘦素增强脂蛋白酯酶和肝脂酶表达加速胰岛素抵抗肝细胞模型内脂肪代谢 王 敏～吴晓华～李 真(400037重庆，第三军医大学附属新桥医院妇产科) [摘要] 目的 在体外模型中探讨胰岛素抵抗情况下，瘦素(Leptin)对脂代谢的影响及途径。方法 用1μmol/L胰岛素诱导LO2(人 正常肝细胞) 细胞，构建肝细胞胰岛素抵抗模型，并用0、50、100、250μg/L瘦素以及2μmol/L瘦素拮抗剂 (leptin-A) 分别处理 细胞。实时定量PCR检测细胞中肝脂酶 (HL) 和脂蛋白酯酶 (LPL) mRNA表达;蛋白质免疫印迹法检测细胞中HL和LPL蛋白表达; 油红-O染色观测细胞内油脂的堆积程度。结果 ?高浓度胰岛素处理LO2细胞后，处理组细胞对一定浓度胰岛素的响应比对照组有显 著下降，其代谢葡萄糖效率显著下降，细胞产生胰岛素抵抗。?胰岛素抵抗细胞中HL和LPL mRNA和蛋白水平明显低于对照组细胞。 瘦素处理胰岛素抵抗细胞24小时后，HL和LPL mRNA和蛋白水平有明显回升，细胞内油脂堆积明显减少。?瘦素拮抗剂能明显抑制 瘦素诱导的HL和LPL mRNA和蛋白的上调，导致细胞内油脂明显堆积。结论 肝细胞胰岛素抵抗模型中瘦素通过增强HL、LPL mRNA 和蛋白水平的表达加速细胞内脂肪的代谢。 [关键词] 胰岛素抵抗 (Insulin Resistance, IR), 瘦素，脂蛋白酯酶(LPL)，肝脂酶(HL) [基金项目]国家自然科学基金(30973203) [通讯作者]李 真,E-mail: drlizhen@sina.cn Leptin accelerates lipid metabolism by increasing Lipoprotein lipase and Hepatic lipase expression in insulin-resistant liver cell models Wang Min, Wu Xiaohua, Li Zhen (Department of Obsterics and Gynecology,Xin Qiao Hospital,Third Military Medical University, Chongqing, 400037,China) [Abstract] Objective This study aims to explore the relationship between leptin and the intracellular fat metabolism in insulin resistant liver cell models. Method Insulin resistant liver cell models was generated by using LO2 cells long-term treated with 1μM of insulin. Cells were then treated with Leptin (0，50, 100, 250μg/L) and/or 2μM of Leptin antagonist (leptin-A). The transcription of Hepatic lipase (HL) and Lipoprotein lipase (LPL) gene were determined by real-time quantitative PCR; the expression of HL and LPL were evaluated by western-blot. Oil red O staining observation of leptin in LO2 –I intracellular accumulation of fat. Results 1. LO2 cells cultured in long-term and high concentrations of insulin show a significant decrease in responding to the treatment of identical concentration of insulin, indicating insulin resistance. 2. LO2-I have a decreased expression of HL and LPL in both mRNA and proteins levels than LO2 cells. Leptin antagonist inhibit leptin-induced HL and LPL .The mRNA and proteins of HL and LPL were increased significantly, after treated with leptin for 24 hours, the intracellular accumulation of lipid was also significantly reduced .3. Leptin antagonist can inhibit leptin-induced HL， LPL mRNA and protein increase, reducing fat hydrolysis. Conclusion Leptin accelerates lipid metabolism by increasing LPL and HL expression in both mRNA and protein levels in gestational diabetes liver cell models. [Key words] Insulin Resistance (IR), Leptin，Hepatic Lipase (LPL), Lipoprotein Lipase (HL) Supported by the National Natural Science Foundation of China (30973203). Corresponding authoe:Li Zhen, drlizhen@sina.cn 妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是指在妊娠期首次发生或发现不同程度的糖耐量异常， [1]是妊娠期常见严重危害母儿健康的并发症之一。GDM易造成巨大儿，死胎新生儿呼吸窘迫综合征，低血糖等，子[2][3]代将来儿童期肥胖，神经心理失调等风险性也明显增加。但是引起该症的原因至今为止还未完全了解清楚。 细胞培养用无酚红的RPMI1640培养液和胎牛血清购自美国胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)是一种因 Life technology公司;人胰岛素(货号#I3536)购自美国组织细胞不能对胰岛素产生正常响应而产生的生理现[4]Sigma-Aldrich公司;GOD-POD试剂盒购自美国Roche公司;瘦象，是妊娠期糖尿病的重要标志。胰岛素抵抗的细胞 素(leptin,货号#300-27)购自美国Peprotech公司;瘦素拮抗剂对循环系统中脂质摄入减少，而甘油三酯的水解则会加 (瘦素的竞争性抑制剂，leptin-A, 货号#CYT-702)购自以色列快，从而使游离脂肪酸浓度增高，而游离脂肪酸经过三[4]TMProSpec公司;TrizolRNA提取试剂盒购自美国Life 羧酸循环更促进了血糖浓度的进一步提高。 technology公司;逆转录试剂盒购自中国全式金生物技术公司;瘦素(leptin)是肥胖基因(ob)编码的产物，由 SYBR预混RT-PCR试剂购自美国Bio-Rad公司;鼠单克隆抗LPL脂肪组织分泌。其主要生理作用是促进糖原和脂肪的分 [5]抗体(货号#ab21356)购自美国Abcam公司;兔多克隆抗HL抗解，参与糖脂代谢，从而调控机体的能量代谢平衡， 体(货号#sc-21007)购自美国Santa Cruz公司;HRP标记的山是近年来研究的热点。瘦素和胰岛素的关系密切，目前 羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG抗体购自中国中杉金桥公司。 所知，只有这两种激素被认为是肥胖信号，标志机体的 [6][7]脂肪含量。在怀孕期间，瘦素水平会显著提高，但1.2 人肝细胞胰岛素抵抗模型的建立 人肝细胞株LO2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞关于瘦素水平的提高是否是导致GDM的原因这一问，[8-13]库。LO2细胞置于含10%胎牛血清的无酚红RPMI1640培养液中，虽然不乏报道，但一直还存在争论。这些报道大多 于37?，5% CO下培养。 专注于比较妊娠人群中GDM患者与正常人的瘦素水平2 [15-18]的差异，但人群和环境等因素都会对结果产生影响，而用高浓度胰岛素诱导细胞的胰岛素抵抗，简单来说，5按2 ×10细胞每孔的密度接种于6 孔细胞培养板中, 分为胰岛关于瘦素作用的研究也往往直接探讨瘦素与疾病之间[5, 14]素诱导组和对照组, 并设平行组培养。24 h后向胰岛素诱导组的关系而忽视胰岛素抵抗的状态，这可能是相关研 - 6 每孔加入2 mL 新配制的含有1 ×10mol / L 人胰岛素的培养究，尤其是瘦素和GDM之间的关系目前仍没有定论的原 液, 对照组加入不含胰岛素的培养液, 继续培养48小时后。分因之一。综上所述，我们认为:1、在包括GDM在内的 别更换含0 、1 、10 、50 、100 、200 ng / mL 人胰岛素的胰岛素抵抗相关疾病中，IR引起脂代谢的紊乱，与糖 培养液, 培养30 min，加入葡萄糖5.6 mmol / L, 继续培养2 h。代谢紊乱相互促进;2、瘦素是人体内脂代谢过程的重 取培养液上清, 用GOD- POD 法测定培养上清中的残留的葡萄糖要参与者，参与脂代谢，与胰岛素关系密切。3. 要明 含量:根据操作说明书将配制测量工作液, 并平衡至室温, 从6 确瘦素与胰岛素抵抗引起的GDM的关系，必须首先了解 孔板中每孔取10 μL 培养上清入1.0 mL 工作液; 同时设空白瘦素在胰岛素抵抗状态下对细胞的作用。因此，本实验 和样本。标准曲线样本用PBS按倍比稀释法稀释。37?保温旨在研究瘦素在胰岛素抵抗的情况下对脂代谢有怎样 5 ~ 10 min , 于490 nm 处测各孔光密度值。 的影响。 肝细胞作为机体三大营养物质代谢的重要细胞，其1.3 实时定量PCR(real-time quantitative PCR)法检 合成的酶类是调控三大营养物质代谢的关键分子。其中测LO2和 LO2-I细胞中LPL和 HL mRNA的表达 将LO2和胰岛素抵抗的LO2细胞(LO2-I)接种于6孔板中，肝脏细胞合成的脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase, LPL) 其中LO2-I保持胰岛素诱导条件。24h后弃去培养基，分别用0、和肝脂酶 (Hepatic lipase, HL)是调节脂类代谢的关 50、 100、 250μg/L浓度瘦素和2μmol/L瘦素拮抗剂处理LO2-I键酶，催化甘油三脂的水解。血清中LPL、HL含量或活 细胞24h后，用Trizol法提取细胞总RNA。逆转录试剂盒将RNA性的降低可使脂质清除能力下降，导致TG升高及代谢 逆转为cDNA。用SYBR法实时定量PCR检测基因表达。扩增程序紊乱。本实验利用高浓度胰岛素处理人肝细胞系L02 [15-18]为:2min，95?预变性，94?变性15sec，55?退火15sec，68?细胞，诱导细胞胰岛素抵抗，通过研究瘦素对胰岛 延伸30sec，从第二步起共进行40个循环，最后65?制备溶解素抵抗的肝细胞LPL和HL关键酶的作用，研究瘦素在 曲线。扩增的引物如下:LPL: 胰岛素抵抗的情况下对脂代谢的影响。 5’-AGTAGCAGAGTCCGTGGCTA-3’(正向引物) 1 材料与方法 5’-ATAAACCGGGCCACATCCTG-3’ (反向引物);HL: 1.1 主要试剂 5’-CCCCCAGCAATCGTCTTTCT-3’ (正向引物)，采用SPSS16.0统计软件行单因素方差。 5’-TGCAGCAAGGAGTCGATGAA-3’ (反向引物); 2结果 GAPDH:5’-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’ (正向引物)， 2.1 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法( GOD- POD) 法鉴定5’-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3’ (反向引物) 细胞模型 从图1可见，两组培养液中残存葡萄糖含量都随着胰岛素浓1.4 Western blot检测LO2和 LO2-I细胞中LPL和 HL 度的升高而降低,但胰岛素诱导组的降低幅度显著(P，0.01)低的表达 在6孔板中接种LO2和LO2-I细胞，其中LO2-I保持胰岛素于对照组。实验结果证明胰岛素诱导组细胞表现出IR，与GDM诱导条件。分别用0、50、100、 250μg/L瘦素和2μmol/L瘦时胰岛素抵抗增强相似，细胞模型建立成功。 素拮抗剂处理LO2-I细胞24h后提取总蛋白。BCA法检测蛋白浓 度，并加入上样缓冲液100?煮沸蛋白备用。将总蛋白50 μg 于预先配制好的10%聚丙烯酰胺凝胶上样孔中进行分离。通过 “三明治”湿法转印将已经分离好的蛋白转印于预先活化好的 PVDF膜上。转印完成后的PVDF膜用5%的脱脂奶粉摇床上封闭 2h。随后鼠单克隆LPL (1:1000) 和兔多克隆HL(1:500) 4?孵 育过夜，PBST洗3次/10min，用合适的二抗常温孵育2 h，PBST 洗3次/10min后显色拍照分析。 1.5 油红-O染色 采用lillie氏油红O染色法，显微镜下观测LO2-I、leptin I细胞、leptin和leptin-A共同处理的LO2-I细胞 处理的LO2- 以及普通LO2细胞等各组细胞内脂肪堆积的程度:将无菌的细胞图1 GOD- POD检测2组LO2细胞(黑色)内培养液中葡萄糖的残留量;aa表爬片提前置于24孔板中，种植LO2和LO2-I细胞于24孔板中，示对照组相同相应浓度比较:P，0.01 其中LO2-I保持胰岛素诱导条件。细胞贴壁24h后，弃去培养基，2.2 LO2和 LO2-I细胞中LPL和 HLmRNA的表达变化 分别对细胞进行适当的处理，24h后取出带有细胞的细胞爬片，实时定量PCR检测发现LPL和HL在LO2细胞中的表达量分用PBS轻微冲洗细胞爬片3次，50%异丙醇固定1min，油红O染别是LO2-I中的1.89倍和2.12倍(图2,A、B),且具有显著性差色10min，蒸馏水冲洗3次，0.1蒸馏水冲洗3次，苏木精染色异(P，0.01)， 100μg/L的瘦素能明显的逆转由胰岛素引起的 ，0.1%盐酸分离染色封片后在显微镜(olympus，Japan)下釆5minLO2-I 细胞HL和LPL mRNA的降低(图2 C、D)。瘦素拮抗剂能集细胞图片。采集时，选取5个视野，分别为:左上，左下，右明显的抑制瘦素诱导的LPL和HL mRNA的增高(图3)。 上，右下以及居中的视野进行观察，视野下油脂颜色呈红色。用 ImageJ软件计算图中红色所占区域面积。 1.6统计学分析 ABCD A:, LO2和LO2-I中LPL mRNA相对表达量;B: LO2和LO2-I中HL mRNA相对表达量;C:不同瘦素浓度处理LO2-I后LPL mRNA相对表达量;D: 不同瘦素浓度处理LO2-I后HL mRNA相对表达量 图2 定量PCR检测胰岛素诱导的LO2-I细胞中LPL(A)和HL(B)的表达a: p<0.05,与正常对照组相比;aa: P，0.01与正常对照组相比 A B a: P，0.01与瘦素拮抗剂组相比 A A: LO2-A处理LO2-I后LPL mRNA相对表达量;B: LO2-A处理LO2-I后HL mRNA相对表达量 图3 Q-PCR检测瘦素拮抗剂对瘦素诱导的LPL和HL mRNA表达变化的影响 2.3. LO2和 LO2-I细胞中LPL和 HL蛋白表达变化 Western blot检测发现与正常LO2细胞相比，LPL和HL蛋 白在高浓度胰岛素诱导的LO2-I细胞中表达明显降低(图4)。瘦 素处理LO2-I细胞24 h可以逆转由胰岛素诱导引起的LO2细胞 LPL和HL蛋白的降低。瘦素增强LO2-I细胞HL和LPL蛋白的表 达。2μmol/L瘦素拮抗剂能明显的拮抗瘦素诱导的LO2-I细胞 图5)。 HL和LPL蛋白的上调( B a: P<0.05,与联合组相比 A:瘦素拮抗剂对LO2-I细胞LPL蛋白表达的影响;B:瘦素拮抗剂对LO2-I细 胞HL蛋白表达的影响; 图5 瘦素拮抗剂能明显的抑制瘦素诱导的LPL(A)和HL(B)蛋白的表达 AB 2.4 胰岛素诱导后的LO2细胞内油脂含量明显增高, 瘦素能明显抑制LO2-I细胞内油脂堆积。 油红-o油脂染色结果显示，与正常LO2细胞(图2，A)相比， 胰岛素诱导后的LO2细胞(图2，B)内油脂含量(红色面积)明显 增高(p<0.01)。100μg/L的瘦素处理LO2-I细胞24h后油脂量 较LO2-I细胞有明显的减少。2μM瘦素拮抗剂与瘦素共同处理 CD 的细胞中，油脂含量与leptin单独处理组有显著差异，但与未a: P<0.05,与正常对照组相比 加瘦素处理的LO2-I细胞相比没有显著差异。 A:LO2和LO2-I细胞中LPL蛋白表达;B:不同浓度瘦素处理LO2-I后LPL 蛋白表达情况;C: LO2和LO2-I细胞中HL蛋白表达;D: 不同浓度瘦素处理 LO2-I后LPL蛋白表达 图4 Western blot检测LO2、LO2-I细胞内LPL和HL的表达及不同浓度 瘦素对LO2-I细胞内HL和LPL表达变化的影响 前人的研究发现血清瘦素水平与胰岛素的基础分泌水平相 [28]关，而血清瘦素水平取决于皮下脂肪数量。近年来许多学者对 瘦素与胰岛素的关系进行了深入的研究并提出脂肪胰岛素内分 [29]泌轴的概念目前已被众多的试验所证实。胰岛素有利于葡萄糖 的利用和转化，使脂肪的合成增加。瘦素作用于下丘脑的瘦素受 体，导致摄食减少能量消耗增加，脂肪贮存减少，并能通过激活 胰岛细胞上的三磷酸腺苷依赖的钾离子通道而抑制胰岛素的分 [26]泌，从而减轻高胰岛素血症，然后减少自身的分泌。高浓度的 瘦素在体外几乎完全抑制了胰岛素对脂肪细胞的作用，去除瘦素 [30]数小时之后，脂肪细胞又重新获得了对胰岛素的敏感性。虽然 对瘦素能影响脂肪代谢这一观点已经早为学界所认知接受，但是a:P<0.05,与LO2-I组组相比;aa:P，0.01与对照组(LO2组)相比 其机制却不甚明了。脂蛋白酶以及脂肪酶主要是分解脂肪行程游 [31]图6 油红O油脂染色检测LO2细胞和胰岛素诱导后的LO2细胞内油脂的含离的脂肪酸。Liang CP等研究发现肥胖小鼠肝脏中的HL和量。 LPL mRNA含量和功能明显降低，通过瘦素治疗后能明显增加 [32, 33]3 讨论 HL mRNA和LPL mRNA的表达 。这些研究均提示瘦素对 我们的研究证实了在胰岛素抵抗的细胞模型中，瘦素通过脂肪的分解作用可能是基于对HL和LPL表达的调节上，增加HL和LPL参与胰岛素抵抗条件下的脂代谢过程，为进一步探讨HL和LPL的表达以达到水解油脂的目的。 HL和瘦素与妊娠期糖尿病与II型糖尿病之间的关系提供了细胞学意 我们的研究同样发现，胰岛素能降低LO2肝细胞内义上的理论基础，虽然如此，我们的模型只能诱导胰岛素抵抗，LPL mRNA和蛋白表达，加速细胞内脂肪堆积。而在胰岛素抵并不能完全模拟病理条件下的体内环境，因此这些发现还有待体抗的肝细胞模型中，瘦素能恢复甚至增加HL和LPL mRNA和内研究的进一步证实。 蛋白的含量。瘦素拮抗剂能明显的抑制瘦素诱导的HL和LPL 妊娠期糖尿病与II型糖尿病在对胰岛素的响应机制方面基蛋白的表达。油脂染色证明瘦素能明显降低LO2-I细胞中的脂肪 [4]本相同，都以IR为重要标志。肝脏内胰岛素敏感性的降低会堆积，这提示LO2-I模型中瘦素对脂肪的分解作用是基于对HL导致肝脏内葡萄糖含量上调，高胰岛素血症，增加胰岛β细胞应和LPL的调节。临床研究发现血清中甘油三酯含量的增加是胰 [19][34]激，产生高血糖症 。 动物模型研究证实肝脏内的IR在糖尿岛素抵抗的结果，也是胰岛素敏感性受损的主要致病因素。据 [20]此，我们可以推测，高浓度胰岛素诱导瘦素的产生，增加瘦素将病的发生中起着重要作用 。在细胞模型中Yang 等用胰岛素 和葡萄糖诱导肌肉细胞IR模型，发现细胞中会出现脂肪堆积 导致HL和LPL mRNA的表达上调，合成增加，上调的HL和[21][15]。本实验利用胰岛素和葡萄糖诱导LO2肝细胞IR模型，LPL通过水解脂肪加了血清中甘油和脂肪酸的含量，为糖类合成LO2-I出现葡萄糖耐受以及脂肪堆积的现象与前人研究结果一提供了原料，从而进一步加重GDM。 致。 总之，本文的研究通过建立胰岛素抵抗的肝细胞模型，发现 瘦素被认为作为胰岛素的反馈调节激素在肥胖和能量分配瘦素在胰岛素抵抗的情况下能通过增加HL和LPL的mRNA以 [22]及蛋白水平缓解胰岛素抵抗产生的脂肪堆积。然而，这种作用可以及在大脑发育中起着重要的作用。妊娠期间妇女血清内瘦素 [23]的明显增高主要来源于胎盘绒毛滋养细胞的分泌。研究早已发能也是GDM患者体内游离脂肪酸和甘油含量增加和GDM血糖 [24, 25]升高的原因之一。我们的研究表明了瘦素与胰岛素抵抗间可能存现瘦素与胰岛素水平在子宫内部存在着相互调节。一方面胰 岛素能刺激脂肪组织产生瘦素，另一方面瘦素又可直接作用于胰在相互调控的关系，而胰岛素抵抗是GDM的重要标志。此外， [26]岛细胞的瘦素受体抑制胰岛素的分泌。胰岛素能明显的降低脂我们证实瘦素通过HL和LPL参与胰岛素抵抗条件下的脂代谢过肪酶的合成，减少脂肪分解，加速脂肪堆积。Kralisch发现胰岛程中，HL和LPL是否能成为今后瘦素与妊娠期糖尿病关系的研 究中的新的测量指标，还需要进一步的研究。 素能降低体外培养3T3L1脂肪细胞内脂肪酶mRNA的含量，且 [27]呈时间和剂量依赖性。 参考文献 [1]. 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