我国促肝细胞生长因子的研究和应用

我国促肝细胞生长因子的研究和应用 我国促肝细胞生长因子的研究和应用 中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005:7—11 我国促肝细胞生长因子的研究和应用* 王乾兰 (深圳科兴生物工程股份有限公司深圳518057) 摘要促肝细胞生长因子具有促进细胞增殖和生长的作用,国内外研究较多.我国对肝细胞生 长因子的研究和应用主要集中在肝源性促肝细胞生长因子上.在国内学者历年研究成果的 基础上,结合我国生产和应用的实际情况,对促肝细胞生长因子的来源,结构,理化性质,生产及 有助于更深入研究. 应用情况进行了综述, 关键词促肝细胞生长因子血源性促肝细胞生长因子肝源性促肝细胞生长因子 促肝细胞生长因子是一类能促进人类及动物 细胞再生的生物活性小分子物质,可促进细胞进行 有丝分裂和生长.在临床上,它们既能启动肝损伤 后的再生与修复,又能抑制某些肝癌细胞的生长, 在肝病治疗药物中占有极其重要的地位.因此,世 界上许多国家一直致力于促肝细胞生长因子的研 究,我国在此方面的研究和应用均处于世界领先水 平.在查阅历年国内外有关促肝细胞生长因子文 献资料的基础上,结合我国生产和临床应用的实际 情况,对国内促肝细胞生长因子的研究,生产和临 床应用现状进行如下综述. 1促肝细胞生长因子的发现和分类 早在1931年,英国学者Higgens和Anderson首 次报道肝部分切除后,残存肝可迅速增殖,肝脏体 积和各种特殊功能均可恢复正常;60年代,一些学 者在肝大部分切除大鼠与正常大鼠之间建立交叉 血循环,发现在肝大部分切除大鼠肝再生期间,正 常大鼠肝细胞也有增生现象.若将肝再生大鼠血 液灌注至移植肝内,也可以出现肝细胞增殖现 象….由此推测肝脏本身可产生一种使肝脏再生 的特殊物质.受此发现的启示,世界各地学者对肝 再生和促进肝细胞生长的物质进行了广泛的研究, 取得了大量成果.但在不同的文献资料中对此物 质称谓繁多,如肝细胞生长因子,促肝细胞生长因 子,肝细胞刺激因子,促肝细胞生长素,肝细胞生长 收稿日期:2004.O1.21修回日期:2004.11-24 *电子信箱:qianlanw@yahoo.com.cn 多肽,肝细胞素,肝细胞肽,肝再生刺激物质,肝细 胞生成素,肝细胞增殖因子等,其英文名称缩写也 各式各样,如:HGF,HSS,ALR,HPN,HPTA,HPO, HPF等.事实上它们均指同一类物质,SFDA批准 其药品名为促肝细胞生长因子. 尽管名称各异,促肝细胞生长因子的家族成员 归于两个:血源性促肝细胞生长因子和肝源性促肝 细胞生长因子.二者在功能上虽具有相似性,但在 来源及理化性质上具有很大差别. 血源性促肝细胞生长因子最初由日本学者 Nakamura等从肝部分切除大鼠血液中获得.而现 已发现在成人和胚胎的皮肤,肾,肺,胃肠等组织的 间质和上皮细胞中其存在'.这类促肝细胞生长 因子的来源和作用范围广泛,具有种族特异性,无 器官特异性,对热和蛋白酶敏感.日本学者在此方 面研究较多,而我国对此类促肝细胞生长因子的研 究很少. 肝源性促肝细胞生长因子由l_abrecque等J 1975年首次从大鼠再生肝悬液中纯化得到.随后, 其他学者相继从大鼠,狗,兔,猪,牛和羊等哺乳动 物的胚胎肝,新生肝或再生肝组织中提取到其活性 成分,目前已证明其仅来源于生长的肝和再生肝. 与血源性促肝细胞生长因子相比,其热稳定和蛋白 稳定性强,作用具有器官特异性,而无种族特异性. 我国对促肝细胞生长因子的研究和应用主要 集中在肝源性促肝细胞生长因子上,且研究和应用 水平均在世界上领先.因此,下文中所说的促肝细 胞生长即特指肝源性促肝细胞生长因子. 8中国生物工程杂志ChinaBiotechnology(增)2005 2促肝细胞生长因子的结构和理化性质 促肝细胞生长因子是一种小分子蛋白.军事 医学科学院放射医学研究所利用功能筛选法分离 到人的能编码促肝细胞生长因子的全长cDNA,其 中全长375bp能编码125个氨基酸组成蛋白的开 放读码框,从理论上推测其蛋白分子量为15kDa; SDS.PAGE还原电泳结果也证实其单体分子量约为 15kDa.其多肽中含有8种必需氨基酸,10种非 必需氨基酸,其中含量最高者为甘氨酸,最低者为 酪氨酸.促肝细胞生长因子的组分经紫外线扫描 有两个主要吸收峰,推测除多肽成分外,还有 较大成分的核酸或多聚核酸类物质.此外,促肝细 胞生长因子还含有10种微量元素,其中包括K, Na,Ca,Mg及比正常人血清高15倍的zn和微量的 Se;自然状态下,促肝细胞生长因子除少量以聚 合体存在外,主要以双体形式存在,此时相对分子 量为30kDa…. 对促肝细胞生长因子的研究结果显示其理化 性质如下: (1)是一种亲水的多肽,具有良好的水溶性,其 水溶液呈淡黄色透明液体. (2)具有良好的热稳定性,在100oC保温5min 不失活,65?15min也相对稳定.其冻干粉剂在一 20~C条件下可长期保存,4?保存生物学活性至少 保持7个月,在室温下生物学活性也可保持20d以 上.但其水溶液不稳定,4?时活性仅保持6h【8. (3)具有很好的pH稳定性,在pH2.0,9.0之 间稳定. (4)在0.1%SDS或8M脲中不失活,说明3级 结构对其活性并不重要;而经1%二巯基乙醇和 其活性仍不降低,表明二硫 1%二硫代赤藓醇处理, 键对其活性也非必需. (5)胰蛋白酶,糜蛋白酶可破坏其活性,而经 DNase,RNase和神经氨酸酶处理后其活性无变化, 表明它不是一种糖蛋白. (6)只作用于肝脏细胞,其作用具有器官特异 性而无种属特异性. 3促肝细胞生长因子的功能和作用机理 总的来说,促肝细胞生长因子具有特异的刺激 肝细胞DNA合成增加,有丝分裂加速,从而使肝细 胞再生能力增强,肝脏功能和临床症状得到恢复和 改善,以及激发机体的免疫状态等作用.其作用机 理也由多方面的因素构成. (1)刺激肝细胞DNA的合成,促进肝细胞的再 生.此作用机制有二:其一,促肝细胞生长因子对 钾钠ATP酶的抑制因子起抑制作用,可以改变膜 离子运转机制,致使细胞外Na与细胞内H交换, 导致细胞内环境pH升高,同时细胞外Ca2迅速进 入细胞,因而激发细胞增殖,细胞内cAMP水平的 增高,亦激活一些蛋白激酶,促进肝细胞合成?; 其二,促肝细胞生长因子活性基因与肝细胞膜上受 体相互作用,从而启动DNA合成…. (2)抑制肿瘤坏死因子(TNF)的活性,促进各 种肝炎,尤其是重症肝炎和慢性活动性肝炎患者的 康复.重症肝炎和慢性活动性肝炎患者血清TNF 活性均显着增加,并与病情轻重成正比.TNF为G. 杆菌引起中毒性休克的重要介质,能导致微循环障 碍及DIC,引起毛细胆管炎或直接破坏肝细胞,参 与慢性乙型肝炎的发病机制.而促肝细胞生长因 子能抑制内毒素对TNF的诱生作用,从而抑制TNF 的活性". (3)增强枯否氏细胞功能,从而增强人的免疫 能力.枯否氏细胞是肝内固有的巨噬细胞,它是稳 定肝脏内环境的重要因素,这类细胞与类毒素血 症,肝功能衰竭和肝外并发症的发生密切相关.爆 发性肝功能的衰竭发病机理之一,就是枯否氏细胞 功能减退.促肝细胞生长因子能使试验肝损伤动 物的单核一吞噬细胞系统吞噬功能显着增强,对肠 道吸收的内毒素的解毒起重要作用,提示其通过激 活肝脏枯否氏细胞功能,提高对内源性和外源性内 毒素的消除,降低内毒素血症,减少肝细胞的坏 死'. (4)对肝细胞膜起保护作用,使肝损伤得到有 效恢复.促肝细胞生长因子能使受损肝脏摄取氨 基酸的量显着增加,为损伤肝脏的修复提供原料来 源.它主要通过阻断自由基的脂质过氧化作用,保 护和促进线粒体的复制和增生及粗面内质网的变 化,活跃肝细胞生物氧化功能和蛋白质合成,为肝 脏再生和修复提供能量需要,起到保护肝脏的作 用. (5)具有抗纤维化作用,抑制肝脏纤维化.促 肝细胞生长因子作用于肝脏后,肝细胞再生出现 早,原组织结构修复较好,肝脏微循环功能得到较 好的保护,故肝细胞变性坏死减少,纤维组织增生 2005(增)王乾兰:我国促肝细胞生长因子的研究和应用9 和胶原纤维形成相对减少. (6)含有的氨基酸和微量元素具有营养肝细胞 的作用. 制备和 4我国促肝细胞生长因子的来源, 检测技术 4.1来源 促肝细胞生长因子来源于人类和其它哺乳动 物的胚胎肝或再生肝,而正常成年动物肝脏或体内 其它组织中都未能检测出促肝细胞生长因子的活 性.因此,现在国内企业大多是从动物,如乳鼠,乳 猪,乳羊,乳牛等的肝脏中提取肝细胞生长因子,供 临床应用. 4.2制备工艺 制备肝细胞生长因子工艺流程如下:组织抽提 (匀浆,离心)一粗品提取(超滤,乙醇沉淀等)一蛋 白纯化(离子交换层析,分子筛,亲和层析等)一纯 品蛋白液一制剂一包装. 4.3质量检测 促肝细胞生长因子成品的质量检测项目与检 测方法与其它蛋白质类药品大体相同,如用肉眼观 察外观,用酸度计检测pH,用分光光度法进行定 性,用lowry法测定蛋白浓度,用动物实验检测毒性 等.只是其活性测定方法比较复杂. 经典的测定促肝细胞生长因子活性的方法是 3H.TdR掺入法.此方法是现取大鼠肝细胞,制成 悬液后,接种于96孔细胞培养板内,加入待检样 品,37?,5%CO2下培养24h后加入3H.TdR,再以 同样条件培养6h后,收集细胞,在液体闪烁计数仪 上测定3H.TdR闪烁次数,并按特定的公式计算活 性.此方法准确,但也相当繁琐,且同位素的使用 也不利于检测者安全. 因此目前人们试图用MTT或xTr法代替同位 素掺入法测定促肝细胞生长因子的活性.MrIT名 为四甲基偶氮唑盐,细胞在生长和增殖过程中,线 粒体内的脱氢酶可将黄色的MTr分解成蓝紫色的 Formazan,且生成的Formazan量与细胞生物量呈正 相关,在酶标仪上测得的OD值与作用的样品量之 间具有量效关系.具体操作方法:采用可人工 传代培养的人肝癌细胞(HepG2)代替大鼠原代肝 细胞作为载体.先将一定浓度的HepG2细胞加至 96孔培养板中,加入待检样品后培养24h,弃上清 液,加入MrIT液,继续培养5h,离心弃上清,加入溶 解液,待细胞裂解和Formazan完全溶解后,测定OD 值,计算活性指标. xrIT是一种与MTr类似的四氮唑衍生物,同 样可以被细胞线粒体中的脱氢酶还原成Formazan. 与MrIT不同之处在于,它产生的Formazan是水溶 性的,且呈棕黄色,勿需裂解即可在酶标仪上测OD 值?,因此操作起来比MrIT法更简单. 5我国促肝细胞生长因子的生产和开发 现状 据调查,我国促肝细胞生长因子生产历史已近 l0年,主要有水针剂,粉针剂和颗粒剂3种剂型,4 个品种,全国企业多达28家.具体见表1. 目前有6个同类产品正处于新药申报阶段. 详细见表2. 6我国促肝细胞生长因子的临床应用 大量的动物试验均证实,促肝细胞生长因子具 有良好的保护肝脏功能,促进肝细胞再生的药理作 用,此作用在II缶床治疗病毒性肝炎方面取得很大进 .目前我国临床上主要将其用于各种肝脏疾病 展 的治疗,如:重型肝炎,慢性活动性肝炎,肝硬化等, 并取得了一定的治疗效果. 在治疗重型肝炎方面,经临床应用单位验证. 早期应用可将重型肝炎病死率从平均55%降至 35%.肝细胞生长因子的应用使病人在大量肝细 胞坏死的同时得以及时促进肝细胞再生,恢复肝细 胞功能,度过肝衰竭危险期,从而提高抢救率. 在治疗慢性活动性肝炎方面,因其具有抗纤维 化作用,对吞噬细胞,T细胞,NK细胞有免疫促进 作用,同时也能减少TNF得产生.这些作用对于 治疗慢性活动性肝炎均是有利的. 此外,我国医务工作者还发现促肝细胞生长因 子还具有多方面的生物效应,如用于肾缺血引起的 肾损伤,预防肾功能衰竭;降低血糖;治疗再生障碍 性贫血.值得注意的是它对于某些肿瘤,如黑 色素瘤也有抑制作用. 10中国生物工程杂志ChinaBiotechnology(增)2oo5 促肝细胞生长素注射液 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 促肝细胞生长素颗粒剂 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射用促肝细胞生长素 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 颗粒剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 注射剂 2ml:30,ttg 20mg 60mg 20mg 20mg 5g:50mg 20mg 60mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 20mg 威海赛洛金药业有限公司 南京南大药业有限责任公司 广东阳江制药厂有限公司 广东阳江制药厂有限公司 广东宏远集团药业有限公司 广东宏远集团药业有限公司 四环药业股份有限公司 广东药物研究所制药厂 广东药物研究所制药厂 杭州澳亚生物技术有限公司 吉林省富春制药有限公司 吉林亚泰生物药业股份有限公司 广东省大日生物化学药业有限公司 吉林西点药业科技发展股份有限公司 保定三九济世生物药业有限公司 哈高科白天鹅药业集团有限公司 黑龙江迪龙制药有限公司 黑龙江江世药业有限公司 黑龙江飞峡制药工业有限公司 海南通用同盟药业有限公司 广西北生药业股份有限公司 吉林敖东药业集团延吉股份有限公司 吉林华康药业股份有限公司 吉林省辉南辉发制药股份有限公司 吉林马应龙制药有限公司 吉林辉南长龙生化药业股份有限公司 安徽丰原药业股份有限公司 白求恩医科大学制药厂 山西康宝生物制品股份有限公司 吉林新星药业有限公司 吉林玉皇药业有限公司 表2待生产的促肝细胞生长因子 7我国促肝细胞生长因子应用存在的问题 促肝细胞生长因子具有多方面的生物效应,在 近年来的临床应用中已经发挥了重要的作用,而基 因工程产品的开发更为其展示了广阔的前景.但 纵观国内目前研究和应用情况,笔者认为如下问题 值得关注: (1)到目前为止,因从动物肝脏中提取的肝细 胞生长因子纯度不够,以致抗原性不均一,个别病 例出现胃寒,发热,头痛,头晕,皮疹等不良反应,占 治疗病例的0.91%.如应用基因工程和蛋白质工 程技术改造自然提取物,得到高纯度的新型制剂, 其副作用能否就此消除还有待研究. (2)研究发现高剂量的促肝细胞生长因子能抑 制人肝癌细胞的生长,小剂量则对人的某些肝癌细 胞具有刺激生长作用,潜在用药剂量安全问题. (3)重症肝炎患者血清中促肝细胞生长因子水 平增高很多,超过体外培养原代肝细胞对促肝细胞 生长因子达到促细胞分裂最高活性所需的浓度,这 时若再外给促肝细胞生长因子,是否仍有疗效的问 题需要进一步探讨. 2005(增)王乾兰:我国促肝细胞生长因子的研究和应用ll 参考文献 [1JMoohenFL,BarcherNLR.Regenerationofratliver:transferof humoralagentbycrosscirculation.Science,1967,158:272 [2JNakamuraT,NawaK,IchiharaA.Partialpurificationand characterizationofhepatocytegrowthfactorfrom~l'alnof hepatectomizedrats.BiochemBiophysResCommun,1984,122: 1450 [3]ZamegarR,MichalopoulesGK.1rhemanyfacesofhepatocyte wtl1factor:fromhepatopiesistohematopoiesis.JCellBiol, 1995.129(5):1177—1180 [4]LabrecqueDR,PeschLA.Preparationandpartialcharacterization ofhepaticregenerativestimulatorsubstancefromratliver.J Physiol,1975,248:273 [5]杨晓明,谢玲,等.肝再生增强因子的分子克隆及其性能研 究.中国科学(C辑),1997,27(5):463468 [6]姚志强,杨为松,等.肝再生刺激物质的纯化及生物学活性 研究.临床肝胆病杂志,1993,9(4):192,194 [7]郭昱,吴梧桐.肝细胞生长因子及肝细胞刺激因子的研究 概况.药学进展,2000,24(2):7377 [8]彭齐荣,李灼亮.创新知识与促肝细胞生长素的研制.医学 与哲学,1999,20(4):12 [9]杨治河.肝细胞生长因子与肝刺激物质.四川解剖学杂志, 1998,6(I):3O一33 [1O]谢青,郭靖,等.HGF治疗鸭急性肝坏死的实验研究.上海 第二军医大学,1994,14(4):334 [11]张宜俊,孔祥平,等.促肝细胞生长素治疗慢性病毒性肝炎 1668例疗效观察.临床肝胆病杂志,1995,11(3):137 [12]李国钦.肝细胞生长因子能否刺激肝再生的研究.中西医 结合肝病杂志.200O,10(2):59—61 [13]林梅.肝源性肝细胞生长因子的研究与临床应用现状.中 国实用内科杂志,1997,17(1):5657 [14]雷殿良,马宵,等.NTT比色法测定促肝细胞生长物质对肝 细胞生长的刺激活性.微生物学免疫学进展,1999,27(3): l6—20 [15]吴楠,崔恒.XTr比色法在细胞活性检测中的应用.国外医 学.临床生物化学与检验学分册,1998,19(5):2O4,206 [16]丘玉昌,吴曙光.肝细胞生长因子与组织器官损伤再修复. 国外医学,生理病理科学与临床分册,1999,19(1):6769 [17]白晓谊,宋朝晖,等.肝细胞生长因子在心血管疾病中的研 究现状.医学综述,2003,9(11):679680 ProgressofResearchandApplicationonHepatocyte Growth—promotingFactorinChina WANGQian—lan (ShenzhenKexingBiotechCo,LTDShezhen518057,China) AbstractIthasbeenresearchedanddemonstratedSOfarovertheworldthatHepatocyteGrow th—promotingFactor (HGF)iscapabilityofpromotingcellmultiplicationandgrowth.InChina,theresarchonHGF ismainlyfastenonthose derviedfromlivers.BasedonthedocumentsonHGFpublishedinthepastyears,theHGF'Sder ivation,structure, physical— chemicalcharacteristics,productionandclinicalapplicationwerereviewed.Meanwhile,the productionand applicationofHGFinChinawereoutlined. KeywordsHepatocytegrowth?-promotingfactorHepatocytegrowth??promotingfactorderviedfromblood Hepatocytegrowth-promotingfactorderivedliver