分支杆菌菌种快速鉴定

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 分支杆菌菌种快速鉴定 目前，常规的分支杆菌菌种鉴定需采用分支杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长 温度、光产色实验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原 实验、烟酸试验、吐温-80 水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收实验、 亚硝酸盐还原试验)等 10 余项试验，综合分析判定结果，方法复杂、费时，慢生长分支杆菌需 3~4 周方可获得结果，且准确度较差，难以满足临床诊断和治疗的需要。本实验以分支杆菌 rpo β基因为靶基因序列，应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCA-RDBHA)快速鉴定分支杆菌临床 分离株至种的水平，结果报道如下： 1材料与方法 1.1 材料 1.1.1 分支杆菌分离株 经抗酸染色涂片检测阳性的分支杆菌临床分离株 126 株，来自我院 结核科和解放军第三〇九医院。 1.1.2 引物及探针 引物Ⅰ和Ⅱ型及 21 中分支杆菌寡核苷酸探针序列参照文献有伤害生工 生物工程有限公司合成。引物Ⅰ和Ⅱ扩增 360bpNDA 片段。分支杆菌属、结核分支杆菌属复合群、 鸟分枝杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分支杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分支杆菌、 偶然分支杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分支杆菌、戈登分支杆菌、苏加分支杆菌、马 尔摩分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、微黄分支杆菌、土地分支杆菌、耻垢分支杆菌、不产色分支杆 菌和草分枝杆菌菌种对应的探针分别命名为 pMyc、pTub、pAvi、pInt、pKan、pAbs、pScr、pGas、 pFor、pChe、pMar、pSim、pGor、pSzu、pMal、pXen、pFla、pTer、pSme、pNon 和 pPhl。 1.2 方法 1.2.1DNA 制备 刮取改良罗氏培养基上的分支杆菌临场分离株培养物少许，混悬于 1ml 无菌 TE 缓冲液的 1.5ml 离心管内，10 000r/min 离心 10min，去上清，沉淀加入 DNA 提取液 50µl， 煮沸 15min，离心取上清作为 NDA 模板。 1.2.2PCR 扩增 在 25µl 反应体系内，引物Ⅰ，引物Ⅱ终浓度各为 0.2µmlo/L，4*dNTP 终浓 度各为 0.2mmol/L，TapDNA 聚合酶 1U，10*PCR 缓冲液 2.5µl，DNA 模板 3µl，加去离子水至 25µl。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 置 PCR 扩增仪内，扩增条件为 94℃变性 5min 后，94℃ 1min、58℃1min 和 72℃1min，循环 35 次，72℃延伸 7min，2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 1.2.3 探针加尾 20µl5*末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应缓冲液，探针终浓度为 4µmol/L， dTTP 终 浓 度 为 2mmol/L ， TdT80U ， 加 去 离 子 水 至 100µl ， 置 37 ℃ 水 浴 2h ， 加 2µl0.5mol/LEDTA(PH8.0)终止反应。 1.2.4 反向斑点杂交 ①膜芯片制备：取加尾后探针 2pmol 按顺序点于尼龙膜上，置 60℃干 烤固定 2h。②杂交：将生物素标记的 PCR 产物煮沸变性 5min，冰浴 5~10min。将膜芯片放入反 应袋中，加入杂交液(5*SSC，1% blocking 试剂，0.1%十二烷基肌氨酸钠，0.02%SDS)5ml，加 入变性 PCR 产物 15~20µl，混匀，封袋。54℃孵育 30min。③洗膜芯片：洗液Ⅰ(2*SSC，0.1%SDS) 室温洗膜 2 次，每次 10min;洗液Ⅱ(0.1*SDS，0.1%SDS)室温洗膜 10min1 次。④酶结合物与标 记 PCR 产物结合：链亲和素-碱性磷酸酶结合物以适当比例稀释后于杂交后的膜芯片室温作用 30min。⑤洗膜芯片：缓冲液(100mmol/LTris-HCL，lmmol/L NaCl，PH7.5)室温洗膜 2次，每次 10min，缓冲液(100mmol/L Tris-HCL，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，PH9.5)室温洗膜 10min1 次。⑥显色：用 BICP-NBT 系统显色，待探针显色后，用 TE 洗膜终止反应。⑦结果观察：根据 杂交斑点判定结果。 1.2.5 PCR-DNA 测序 对 PCR-RDBHA 鉴定为 NTM 的 BACTEC-960 培养物再次进行 PCR 扩增， 将扩增产物纯化后送上海生工生物工程有限公司进行 DNA 测序。 2结果 2.PCR 扩增 3.引物Ⅰ和引物Ⅱ扩增从 126 株经抗酸染色阳性的分支杆菌临场分离株培养物制备 DNA 模 板，2% 琼脂糖凝胶电泳检测均可见 360bpDNA 扩增条带。 2.2RDBHA 检测 PCR 阳性扩增产物 RDBHA 检测结果表明：126 株中，115 株鉴定为 MTC，11 株为 NIM。NIM 中 1 株堪萨斯分枝杆菌，1株戈登分支杆菌，2株瘰疬分枝杆菌，4 株胞内分支杆菌，3株脓肿 分支杆菌。 2.3PCR-DNA 测序 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 11 株 NTM PCR-DNA 测序序列与已知分支杆菌标准菌株 rpoβ基因序列进行同源性分析鉴定 至种。以测定结果为对照组，PCR-RDBHA 与 PCR-DNA 测序鉴定结果一致。 3讨论 分支杆菌属包括 MTC、麻风分枝杆菌和 NTM。目前已报道 100 余种分支杆菌，其中约 30 种 与人祸不同的动物疾病有关。自 20 世纪 80 年代早期以来，结核病及 NTM 感染疫情在世界范围 内呈上升趋势。临床实验室检出 NTM 的几率正在增加。致病性 NTM 引起的 NTM 肺病与肺结核的 临床表现、X线特征极其相似，但临床治疗不同，许多 NTM 对抗结核药物天然耐药，常规 化疗效果不佳。因此，分支杆菌菌种鉴定对临床诊断、鉴别诊断和治疗均有重要意义。 近年来，以 PCR 为基础的各种分子检测技术的发展，为分支杆菌菌种鉴定提供了新的技术 手段。临床上实用而具有开发价值的反向斑点杂交技术，在菌种鉴别检测方面已显示出极大优 势。分支杆菌 rpoβ基因具有分支杆菌属以及信息保守区和特异性可变区，以此为靶基因建立 的 PCR-RDBHA 所扩增的 rpoβ基因 360bp 片段中含有 2 个序列高变区，不同分支杆菌菌种间变 异较大，利用差异的分支杆菌属、MTC 和 19 种 NTM 菌种寡核苷酸探针排列固定于尼龙膜载 体上，与生物素标记的分支杆菌菌种 PCR 扩增产物进行杂交，再与链亲和素-碱性磷酸酶结合物 作用，显色后，根据杂交斑点判定结果，能将分支杆菌鉴定至种的水平。 本实验应用 PCR-RDBHA 检测分支杆菌临床分离株，结果表明，126 株培养物中 MTC115 株 (91.3%)，NTM11 株(8.7%)，NTM 的菌种鉴定及引起的疾病不容忽视。目前，DNA 测序是公认的 检测分子差异的最可靠方法，对不同分支杆菌菌种间 rpoβ基因特异性可变区的差异进行分析， 能达到菌种鉴定的目的。本实验以 PCR-DNA 测序为对照，11 株 NTM PCR-RDBHA 与 PCR-DNA 测序 鉴定结果一致。结果表明，PCR-RDBHA 鉴定分支杆菌菌种简便，不需要特殊仪器，易普及，快 速，在获得分支杆菌阳性分离株后 1d 即可获得结果，且结果准确，具有良好的临床应用价值。