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细胞传感器及其在药物中应用的研究主要内容细胞传感器的研究现状细胞－硅器件界面模型LAPS器件与制备实验测试系统的构建实验结果分析与讨论总结与展望1.细胞传感器的研究现状光学显微镜光学显微镜是最传统也是最广泛应用于细胞研究和观察的仪器，上图给出的一个神经元细胞的荧光显微图。在细胞的观察研究中，主要使用相差显微镜、荧光显微镜，目前还有体视显微镜。早期的微吸管或微丝电极（a）进行细胞胞内信号检测或细胞膜阻抗测量时，需要用一个微与细胞膜相接触，在接触面处形成紧密封接，即“全细胞膜”技术；（b）微吸管直接刺入细胞内，记录胞内电位；（c）金属丝或微靠近细胞膜附近，可以记录胞外信号。膜片钳电极尖端与封接微区形成一个微小的膜片（membranepatch），微电极经过细胞、溶液中的参考电极和放大电路构成回路，A1的同相输入端外加一控制命令，可使细胞膜钳位于钳制电压，但该命令信号源电路并不影响被测细胞的活性状态。细胞与传感器的相同点对多种刺激敏感，如试剂、药品、电、光等都有输入和输出端口可以将其它信号转换为电信号细胞：具有更高的敏感性、选择性细胞传感器的发展细胞传感器(Cell-basedBiosensor,CBB):将活细胞作为敏感元件，检测生物活性物质的功能性信息。细胞传感器具有高度选择性和敏感性，响应迅速，可以检测多种已知或未知物质，可以广泛应用于环境监测（如生化武器，地下水污染），药物筛选，新药开发和基础神经学研究。细胞与硅器件的结合细胞拥有很多受体，可以将化学信号转换为电信号，如果将细胞有效得与电子读出器件耦合，则细胞可以作为万能的生物传感器应用在很多领域。细胞传感器/细胞芯片的现状场效应晶体管（FET）细胞传感器微电极阵列（MEA）细胞传感器基于光寻址电位传感器（LAPS）的细胞微生理计神经细胞动作电位神经细胞的静息电位是－70mV左右，受到刺激时，细胞膜发生去极化，当去极化达到－55mV时，将引发一次动作电位，这里的－55mV就是这一神经元的阈刺激。如果神经元没能达到阈电位水平，那么就不会有动作电位产生，而一旦达到阈电位，则动作电位会始终保持它这种固有的大小和波形。FET阵列细胞传感器将离体的神经细胞培养在FET上3－4天后，固定工作点VGS与VDS，给一个细胞加电或药物刺激，记录IDS的变化，从而反映神经细胞动作电位变化情况。FET阵列记录到的心肌细胞活动情况心肌细胞培养在FET阵列上，0s－29s是心肌细胞正常搏动情况，29s－50s执行加药过程，加入0.1μmol/L的去甲肾上腺素，引起信号波动，图中不显示，50s以后是换液结束后药物作用下细胞搏动的变化，未记录到信号的，是由于该位点的FET未接触到栅极微电极阵列细胞传感器(a)斯坦福大学集成中心制作的36个直径为10μm的平面微电极的阵列(b)一点加刺激，阵列同步记录的其它位置心肌细胞的动作电位对细胞胞外代谢产物的测量葡萄糖作为碳源的含有各种要素的哺乳动物细胞中质子产生和排出的主要细胞代谢机制基于胞外pH值测量的微生理计在硅衬底上腐蚀出小井，填入培养细胞（用合适的培养基覆盖）。在小井下面采用LED扫描，并通过脉冲激光激励在硅中产生电子－空穴对。2.细胞－硅器件界面模型LAPS的工作原理细胞与LAPS传感器的耦合三明治线缆模型当神经元粘着于SiO2表面时，在神经元和芯片之间有一层导电的电解液间隙（即培养液），这样，用SiO2隔开了半导体硅，用细胞膜隔开了细胞质，这种结点具有线缆的特性：间隙形成了线缆的芯，SiO2和细胞膜形成了外面的包层，这种结构被定义为三明治线缆模型。三明治线缆模型等效电路（a）三明治模型等效电路（b）点接触模型模型的数学表达1在三明治线缆的极小面积应用基尔霍夫法则和欧姆法则，可以得到电压VJ（x,y,t）的动力学等式，从而得到通过SiO2的电容电流、间隙的电解液上的欧姆电流及结点处的复合电流。模型的数学表达2实际情况是，在测量过程中，我们并不知道结点的形状，因此，无法应用一个详细的结点处的结构模型。为了设计和评估实验，将结点处结构简化，用全电容、全电阻来描述细胞膜和SiO2，引入一个“点接触模型”的概念。LAPS的等效电路根据Stern双电层模型以及半导体MOS结构理论，对LAPS传感器进行等效。模型数学表达1模型数学表达2在等效电路中光生电流源Ig起着重要作用3.LAPS器件设计与制备表面处理对细胞传感器的作用　　　Neher指出，生物组织在自然情况下，细胞与细胞之间的间距是10－20nm，经验证，在人工基底培养细胞，若不经过特殊处理，细胞与基底之间的距离不小于40nm（Neher,2001）。细胞与硅器件耦合的情况，直接影响测量信号的大小所以，耦合问题直接影响了生物学与微电子学的结合，在细胞传感器研究中，是一个不可回避的难点。影响细胞固定和生长的几个因素化学因素：表面官能团，电荷物理因素：粗糙度促进细胞附着和生长的方法1硅片表面羟基离子注入：在硅片表面的键合态中，只有Si-O-H对材料表面的亲水性有最大贡献。化学方法处理表面，引导细胞生长：表面涂层，BDMS，APDMS。改变粗糙度促使细胞粘附：20nm~50nm的粗糙度最适宜细胞贴附生长。利用特殊形貌的表面促使细胞生长：采用反应离子蚀刻技术在硅片表面制备“硅草”。硅片上制作特殊结构固定细胞：神经井或尖桩篱栅。促进细胞附着和生长的方法2神经井芯片（a）海马神经元细胞在神经井中培养天后的图片，部分突触从井中探出，与其它神经元联系，形成网络，比例尺是100μm；（b）神经井剖面图，井底中央有一6μm的金电极，比例尺是20μm；（c）神经井示意图。促进细胞附着和生长的方法3图中所示是培养在尖桩篱栅神经芯片上的神经网络（a）双向的尖桩篱栅神经芯片，（比例尺20μm），图中标出了刺激翼（St），晶体管（S源极，D漏极，G栅极）；（b）池塘蜗牛的神经元离体培养3天后，固定在尖桩篱栅内（比例尺20μm）；（c）细胞培养2天后胞体固定于尖桩篱栅内，伸展出神经突触形成网络（比例尺100μm）。我们采用的表面处理方法1表面做不同处理后LAPS的输出特性比较处理后细胞培养情况培养4天后的乳鼠脑皮层细胞，胞体直径约20um我们采用的表面处理方法2表面做聚酰亚胺小坑制备好的LAPS，表面涂一薄层聚酰亚胺，通过标准光刻技术，将聚酰亚胺层蚀刻出一个个的小洞，直径大约为3mm，然后对器件进行涂PLOL层的处理，裸露的LAPS表面会有细胞贴附生长。（a）示意图，（b）实际器件拍照。单细胞传感器制备过程(1)基底硅片；(2)热氧化生长SiO2层；(3)硅片背面蒸铝；(4)粘着方孔的培养皿；(5)将进液和出液管安置在测量腔中；(6)用PLOL做表面涂层。LAPS细胞传感器左侧是器件示意图，右侧是实物4.实验系统构建测试系统示意图细胞生长后先镜检，镜检后，将芯片固定于显微镜观察平台，接好进液出液管，启动泵工作，将培养液和药物泵至初始状态，调节显微镜平台，使激光束聚焦到单个细胞上，一切准备就绪，开始测量。测量系统实物图进样系统观察平台（a）观察平台系统，（b）观察和选择细胞时所用系统，（c）激光束对准细胞时所用系统，此时由半透膜代替挡板。测量过程中对光源的调节实验测量界面该图是无细胞测试过程中的一组数据。0－120s是加培养液后的基线测量；A点开始泵3工作，抽出培养液，在大约20s的时间里，由于LAPS器件表面电解液被抽干，所以测量信号为0；B点开始加药，当培养腔逐渐被药物充满时，信号又回到初始时的幅度，C点加药结束，采样频率20KHz。5.实验结果分析与讨论LAPS重复性测量光源调制频率与输出光电压200－10KHz为工作范围，我们选择4KHz作为工作频率特性曲线随频率的变化一、多光源微生理计可同时检测细胞在药物作用下胞外K+、Ca2+、H+三种离子的代谢情况测量结果分析1乳鼠肾细胞在标准培养液中，细胞外微环境pH的变化。泵工作通2min培养液，断开泵，培养腔静止3min，如此循环，测量6个周期。测量结果分析2乳鼠心肌细胞在苯妥英钠作用下，细胞外微环境三种离子浓度的变化二、单细胞传感器可测量在刺激作用下单个细胞的胞外动作电位，从而确定刺激对细胞的作用是兴奋剂还是抑制剂。测量结果分析1表面处理结果－细胞形态正常，突触伸展明显，生长情况良好，部分神经元细胞形成突触联系。测量结果分析2单细胞动作电位模拟测量结果测量结果分析3单细胞传感器在浓度为10μg/ml的乙酰胆碱作用下，记录到的响应曲线测量结果分析4（a）培养腔中泵入培养液，记录基线；（b）培养腔泵入浓度为10μg/ml的乙酰胆碱，记录到细胞传感器的响应曲线三、嗅觉与味觉芯片的初步研究当嗅细胞受到气味刺激时，会把这种信息传递给大脑，嗅觉与味觉在功能上相互配合，对于鉴别外界化学物质具有重要意义。味觉示意图当味蕾受到刺激时，会把刺激信息传递给大脑味蕾细胞在玻片上的生长图中（a）与（b）均为在玻璃片上离休培养6天后的乳鼠味蕾细胞。嗅细胞在玻片上的生长（a）嗅球的僧帽细胞，三角形，有明显的细胞核；（b）嗅上皮的双极细胞，互相连接。嗅球细胞在LAPS芯片上的培养情况图中箭头所指为嗅球细胞，可以看到细胞形态完整，呈明显的僧帽形。基于LAPS的嗅觉芯片嗅球的僧帽细胞，三角形；（b）嗅上皮细胞，明显双极。测量结果分析1浓度为25μmol/L的Glu刺激下，传感器响应信号的FFT测量结果分析2浓度为25μmol/L的Glu刺激下，传感器响应信号的FFT（0－200Hz的分量）测量结果分析3浓度为25μmol/L的Glu刺激下，传感器响应信号的FFT6.总结与展望主要创新点1．深入研究了细胞－硅器件耦合界面模型及LAPS的测量模型。2．提出了一种新型的多功能细胞传感器微生理计3．提出了基于LAPS的单细胞传感器的设计和制作方法，设计了一套全自动进样给药系统。4．提出了基于LAPS的细胞传感器的药物分析和药效评价的方法，证明了该类细胞传感器用于监测细胞活动的可行性。有待改进的方面1．药物选择，需进行大量的细胞和药物实验，建立药物评价数据库。2．进一步提高系统信噪比，减小环境震动和自然光干扰，减少测量过程中引入人为的干扰；另外，传感器的表面处理，也是影响信号幅度大小和信噪比的重要因素。3．改进信号处理方法。正在进行的工作1将FET和ISFET阵列制备在同一芯片上，可以同时检测细胞的胞外代谢和胞外微环境中动作电位的变化，我们已经将心肌细胞成功地培养在这一阵列上。正在进行的工作2采用lift-off技术在玻璃上制备微电极阵列，然后将味觉细胞培养在微电极阵列上进行胞外刺激和相应测量。正在进行的工作3结合芯片测量技术与膜片钳技术，对嗅觉和味觉生理进行定量的研究。