电脑启动黑屏原理

生物化学与分子生物学实验指导书 生物化学实验指导书 生命科学与工程学院 2007.09 目 录 实验一 总糖的测定 .................................................... 2 实验二 蛋白质及氨基酸的呈色反应 ....................................... 5 实验三 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 .................................... 9 实验四 氨基酸的分离鉴定―纸层析法 ..................................... 13 实验五 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 ..................................... 15 实验六 酪蛋白的制备 ................................................. 18 实验七 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 ................................... 20 实验八 肝细胞核中核酸(RNA和DNA)的分离与测定 ......................... 22 实验九 紫外吸收法测定DNA含量 ........................................ 25 实验十 维生素C的定量测定 ............................................ 26 实验十一 酶的特性 ................................................... 29 实验十三 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 ................................. 37 实验十四 植物体内的转氨基作用 ........................................ 40 实验十五 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 ....................... 44 实验十六 葡聚糖凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 ......................... 50 实验十七 质粒DNA的提取............................................. 55 实验十八 质粒DNA的酶切............................................. 57 实验十九 PCR基因扩增 ............................................... 59 实验二十 琼脂糖凝胶电泳检测DNA ...................................... 61 实验二十一 真核生物基因组DNA制备 ..................................... 63 附录 ............................................................... 65 实验一 总糖的测定 一、目的 掌握直接测定法测定总糖的原理和。 二、原理 样品经处理除去蛋白质等杂志后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，以直接滴定法测定水解后样品中的还原糖总量。 三、器材 1.电炉 2.滴定管 3.锥形瓶 4.容量瓶 四、试剂 1.6mol/L 盐酸溶液 2.0.1%甲基红乙醇溶液:称取0.1g 甲基红，用60%乙醇溶解并定容至100ml。 3.20%氢氧化钠溶液。 4.0.1%转化糖溶液:称取105?烘干至恒重的纯蔗糖1.9000g，用水溶解并移入1000ml 容量瓶中，定容，混匀。取50ml 于100ml 容量瓶中，加6mol/L盐酸5ml，在68-70?水浴中加热15min，取出于流动水下迅速冷却，加甲基红指示剂2 滴，用20%NaOH 溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。此溶液每毫升含转化糖1mg。 5.费林氏A液:称取15g(CuSO4?5H2O)及0.05g次甲基蓝，溶于水并稀释到1L。 6.费林氏B 液:称取50g 酒石酸钾钠及75g 氢氧化钠，溶于水，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1L，贮存于橡皮塞玻璃瓶中。 7.乙酸锌溶液:称取21.9g乙酸锌(Zn(CH3COO)2 ?2H2O)，加3ml冰醋酸，加水溶解并稀释至100ml。 8.10.6%亚铁氰化钾溶液:称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6 ?3H2O]，溶于水,稀释到100ml。 五、操作 1(样品处理 取适量样品，移入250ml 容量瓶中，慢慢加入5ml 乙酸锌溶液和5ml 亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，收集滤液备用。 吸取处理后的样液50m 于100ml 容量瓶中，加入5ml 6mol/L 盐酸溶液，置68-70?水浴中加 热15min，取出后迅速冷却，加甲基红指示剂2 滴，用20%NaOH溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。 2. 碱性酒石酸铜溶液的标定 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml，玻璃珠3 粒。从滴定管滴加约9ml 转化糖标准溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2 秒1 滴的速度继续滴加转化糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗转化糖标准溶液的总体积。平行操作3 次，取其平均值，按下式计算。 式中:F——10ml 碱性酒石酸铜溶液相当于转化糖的质量，mg; C——转化糖标准溶液的浓度，mg/ml; V——标定时消耗转化糖标准溶液的总体积，ml 3. 样品溶液预测 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml，玻璃珠3 粒，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态，待溶液兰色变浅时，以每2 秒1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。 4. 样品溶液测定 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3 粒，从滴定管滴加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml 的样品溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2 秒1 滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。同法平行操作3份，取平均值。 5.实验计算 式中:F——10ml 碱性酒石酸铜溶液相当于转化糖的质量，mg; V1——样品处理液总体积，ml; V2——测定时消耗样品水解液体积，ml; m——样品质量，g。 注意事项 总糖测定的结果一般以转化糖计，但也可以葡萄糖计，要根据产品的质量指标要求而定。如用转化糖表示，应该用标准转化糖溶液标定碱性酒石酸铜溶液，如用葡萄糖表示，则应该用标准葡萄糖溶液标定。 思考题 本实验中为什么要对碱性酒石酸铜溶液进行标定, 实验二 蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、目的 1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应 (一)双缩脱反应 1.原理 2+尿素加热至180?左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 2.试剂 (1)尿素 (2)10%氢氧化钠溶液 (3)1%硫酸铜溶液 (4)2,卵清蛋白溶液 3.操作方法 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10,氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1,硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10,氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1,硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。 (二)茚三酮反应 1.原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 该反应十分灵敏，1:1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO、NH和醛，水合茚三酮被还原23 成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。 反应机理如下: 此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 2.试剂 (1)蛋白质溶液 2,卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水,1:9) (2)0.5,甘氨酸溶液 (3)0.1,茚三酮水溶液 (4)0.1,茚三酮—乙醇溶液 3.操作方法 (1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1,茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 (2)在一小块滤纸上滴一滴0.5,的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1,的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 (三)黄色反应 1.原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下: 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 2.试剂: (1)鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1:20混匀，然后用六层纱布过滤。 (2)大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。 (3)头发 (4)指甲 (5)0.5,苯酚溶液 (6)浓硝酸 (7)0.3,色氨酸溶液 (8)0.3,酪氨酸溶液 (9)10,氢氧化钠溶液 3.操作方法: 向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10,氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。 管 号 1 2 3 4 5 6. 7 材料 鸡蛋清溶 大豆提取 指甲屑 头发 0.5%苯酚 0.3%酪氨0.3%色 (少许) (少许) 氨酸 液(4滴) 液(4滴) (4滴) 酸(4滴) 浓硝酸 2滴 4滴 2 ml 2 ml 4滴 4滴 4滴 现 象 (四)、醋酸铅反应 1.原理 多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。 2.试剂 1(未稀释的鸡蛋清。 2(10%的NaOH溶液 (1.5%Pb(Ac)溶液(醋酸铅溶液) 32 4(浓盐酸 3.操作 向试管中先加入1.5% Pb(Ac)溶液约1毫升，再慢慢滴加10%的NaOH溶液，边加边振2 摇，直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加蛋白质溶液5~6滴，混匀。置酒精灯上加热1分钟，溶液变黑，小心加入浓盐酸约2毫升，黑色褪去，嗅其味，将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。 思考题 通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法,它们的原理, 实验三 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、蛋白质等电点的测定 1.目的 (1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2.原理: 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡: 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3.器材 (1)水浴锅 (2)温度计 (3)200毫升锥形瓶。 (4)100毫升容量瓶。 (5)吸管 (6)试管 (7)试管架 (8)乳钵 4.试剂 (1)0.4,酪蛋白醋酸钠溶液 取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形瓶内，用少量40,50?的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10毫升1当量/升醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50?水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100毫升容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 (2)1.00摩尔,升醋酸溶液 (3)0.10摩尔,升醋酸溶液 (4)0.01摩尔,升醋酸溶液 5.操作 (1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 试管号 蒸馏水( ml) 0.01M醋酸(ml) 0.1M醋酸(ml) 1M醋酸(ml) 1 8.4 0.6 — — 2 8.7 — 0.3 — 3 8.0 — 1.0 — 4 7.4 — — 1.6 (2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。 (二)蛋白质的沉淀及变性 1.目的 (1)加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 (2)了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 (3)了解蛋白质变性与沉淀的关系。 2.原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 (1)可逆的沉淀反应: 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 (2)不可逆沉淀反应: 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金届离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定部表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 3.试刘 (1)蛋白质溶液 5,卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液(新鲜鸡蛋清:水,1:9) (2)pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液 (3)3%硝酸银溶液 (4)5,三氯乙酸溶液 (5)95,乙醇 (6)饱和硫酸铵溶液 (7)硫酸铵结晶粉末 (8)0.1mol/L盐酸溶液 (9)0.1mol/L氢氧化钠溶液 (10)0.05碳酸钠溶液 (11)0.1mol/L醋酸溶液 (12)甲基红溶液 4.操作 (1)蛋白质的盐析。 无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 加5,卵靖蛋白溶液5毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟 则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么,将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，l此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 (2)重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加3,硝酸银溶液1,2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾出上消液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解,为什么, (3)某些有机酸沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入1毫升5,三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 (4)有机溶剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入2毫升蛋白质溶液，再加入2毫升95,乙醇。混匀，观察沉淀的生成。 思考题 1.通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法?它们的原理? 2.测定pI有什么意义,pI是固定常数的吗, 3.解释下列名词:水化层;双电层;蛋白质变性;盐溶与盐析;蛋白质等电点沉淀。 4.根据实验现象，讨论下列问题: 1) 蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么, 2)简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。 实验四 氨基酸的分离鉴定―纸层析法 一、目的 1.通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 2.掌握氨基酸纸上层层析法的操作技术(点样、平衡、展层、显色、鉴定) 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的: Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、器材 1.层析缸 2.毛细管 3.喷雾器 4.培养皿 5.层析滤纸 四、试剂 1.扩展剂 是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20 mL正丁醇和5 mL冰醋 酸放人分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗 内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。 2.氨基酸溶液 0(5,的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混 合液(各组份浓度均为0(5,)。 3.显色剂 50,lOOmL0(1,水合茚三酮正丁醇溶液。 五、操作 1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2.取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。在纸的一端距边缘2,3 cm处用铅笔划一 直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。 3.点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩 散的直径，最大不超过3 mm。 4.扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿 迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低 于点样线1 cm)。待溶剂上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥 或用吹风机热风吹干。 5.显色 用喷雾器均匀喷上0。1,茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100?) 或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6.计算各种氨基酸的Rf值。 思考题 1.何谓纸层析法? 2.何谓及f值?影响只f值的主要因素是什么? 3.怎样制备扩展剂? 实验五 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一、目的 1.了解电泳分离蛋白质的一般原理。 2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质技术。 二、原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前巳广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。 三、器材 1. 醋酸纤维薄膜(2x 8厘米) 2. 常压电泳仪 3. 点样器(市售或自制) 4. 培养皿(染色及漂洗用) 5. 粗滤纸 6. 坡璃板 7. 竹镊 8. 白磁反应板 四、试剂 1(巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度o(07) 巴比妥2.76克，巴比妥钠15.45克，加水至1000毫升。 2(染色液 氨基黑10B 0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升(可重复使用)。 3(漂洗液 含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。 4(透明液 合无水乙醇7份，冰醋酸3份。 五、操作 1(浸泡:用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面与无光泽面，并在角上用铅笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟。 2(点样:把膜条从缓冲液中取出，央在两层组滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝止)，将点祥器先在放置在白磁反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3厘米处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。 3(电泳:在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。(先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱 除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥(它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”)。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳宝。通电。调节电压至160v，电流强度0.4,0.7毫安,厘米膜宽，电泳时间约为50分钟。 4. 染色:电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。 5(漂洗:将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。 定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别没在体积0.4当量,升的氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2—3分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。 思考题 1.用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点, 2.电泳图谱清晰的关键是什么,如何正确操作, 人血清中5种蛋白质的等电点及分子量 蛋白质种类 等电点(pI) 分子量(M) 血清清蛋白质 4.88 69,000 球蛋白 5.06 200,000 ,1 球蛋白 5.06 300,000 ,2 ß球蛋白 5.12 90,000—150,000 γ球蛋白 6.85—7.50 156,000—300,000 实验六 酪蛋白的制备 一、目的 1.学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2.掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物， 等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀 出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、器材 1.离心机 2.抽滤装置 3.精密pH试纸或酸度计 4.电炉 5.温度计 四、试剂 1.新鲜牛奶 2.95%乙醇 3.无水乙醚 4.0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 先配A液与B液 A液:0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC?3HO 54.44g，定容至2000ml。 2 B液:0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸(含量大于99.8%)12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 5.乙醇——乙醚混合液 乙醇:乙醚=1 :1(V/V) 五、操作 (一)酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40?。在搅拌下慢慢加入预热至40?、pH4.7的醋酸缓冲液100mL， 用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3000 r /min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 (二)酪蛋白的纯化 1.用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟(3 000r/min)，弃去上清液。 2.在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇 —乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3.将沉淀摊开在表面上，风干;得酪蛋白纯品。 (三)准确称重，计算含量和得率。 含量:酪蛋白g/100 mL牛乳(g%) 测得含量 得率:，100%理论含量 式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 思考题 1.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么, 2.试另一种提取酪蛋白的方法。 实验七 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在 碱提取液中加入酸性乙醇溶液可 以使解聚的核糖核酸沉淀， 由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液 中可以测出上述组分的存在。 三、器材 1.乳钵 2.150ml锥形瓶 3.水浴锅 4.量筒 5.布氏漏斗 6.吸管 7.滴管 8.试管及试管架 9.烧杯 10.离心机 11.漏斗 四、试剂 1(0.04mol/L氢氧化钠溶液 2(酸性乙醇溶液 将0.3ml浓盐酸加入30ml乙醇中。 3(95%乙醇 4. 乙醚 5. 1.5mol/L硫酸溶液 6. 浓氨水 7(0.1mol/L硝酸银溶液 8(三氯化铁浓盐酸溶液 将2 mL 10,三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入 到400 mL浓盐酸中。 9(苔黑酚乙醇溶液 溶解6g苔黑酚于100 mL 95,乙醇中(可在冰箱中保存1个月)。 10(定磷试剂 (1)17,硫酸溶液 将17mL浓硫酸(比重1.84)缓缓加入到83 mL水中。 (2)2.5,钼酸铵溶液 将2.5g钼酸铵溶于100 mL水中。 (3)10,抗坏血酸溶液10g 抗坏血酸溶于100 mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。 17,硫酸溶液?2.5,钼酸铵溶液?10,抗坏血酸溶液?水=1?1?1?2(V,V)。 11(酵母粉 五、操作 将15g酵母悬浮于90 mL 0.04 mol,L氢氧化钠溶液 中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶 中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3000 r,min)15分钟，将上清液缓缓倾入30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000 r,min)3分钟。弃去清液。用95,乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。 取200 mg提取的核酸，加入1.5 mol,L硫酸溶液10 mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。 1(嘌呤碱 取水解液1mL加入过量浓氨水，然后加入约1mL0.1mol,L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 2(核糖 取1支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐 酸溶液2 mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 3(磷酸取 1支试管，加入水解液1mL和定磷试剂1mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。 思考题 1(如何得到高产量RNA的粗制品, 2(本实验RNA组分是什么,怎样验证的, 实验八 肝细胞核中核酸(RNA和DNA)的分离与测定 一、目的 学习从肝细胞核中分离核酸并掌握测定核酸的方法。 二、原理 从肝细胞中提取出的核沉淀溶于蔗糖 - 氯化钙盐溶液中 抽提，得核酸粗制品。再用三 氯乙酸及有机溶剂抽提，除去小分子物质和脂类，最后用0.3 mol,L高氯酸(90?)提取， 获得较纯的核酸物质，可进行测定。 为防止核酸大分子的变性降解，在提纯过程中必需在0,4?的条件下操作。 三、器材 1.玻璃匀浆器 2.解剖器 3.显微镜 4.恒温水浴 5.离心机 6.721分光光度计 7.电炉 四、试剂 1.细胞提取液 5 mol/L Tris 0.5 mol/L EDTA 0.25 mol/L 蔗糖 1 mol/L 氯化镁 调整H=7.4(新鲜配制) 2.10mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.4) 3.0.25mol/L蔗糖-3mmol/L氯化钙溶液 4.95%乙醇 5.0.5mol/L三氯乙酸溶液(TCA) 6.0.3mol/L高氯酸溶液(PCA) 7.二苯胺试剂(新鲜配置) 将1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL优级浓HSO溶液。 248(苔黑酚试剂 将0.5 g苔黑酚溶于100mL0.1,FeCl的浓HCl溶液中。 3 9(标准RNA溶液(40μg,mL) 10(标准DNA溶液:(0.15μg,mL) 11. 体重20 g左右健康小白鼠。 五、操作 1(细胞破碎 小白鼠脱颈椎处死后，迅速剖腹取出肝 脏，用冰冷的细胞提取液洗3次，滤纸吸干，称重，放冰冷小烧 杯内，用手术剪剪成小块状，用提取液洗2次，至无色或浅粉色，再剪成浆状，转入匀浆器中，加提取液2mL，手转打匀浆约6次破碎细胞。 用显微镜检查细胞是否破碎，待完全(95,)破碎，则再加细胞提取液10mL制成肝匀浆。 2(收集核沉淀 将匀浆液转入离心管中，离心10分钟(700r,min)，取沉淀混悬于10 mL 10 mol,L Tris-HCl中，离 心10分钟(700 r,min)，得到无红细胞的核沉淀。 3(核酸的分离 核沉淀中加入1mL 0.25 mol,L蔗糖-3mmol,LCaCl2 溶液，悬液置两(或单)层纱布中过滤，入离心管中，离心10分钟(1500 r,min)，收集沉淀，按以下程序提取DNA和RNA。 留核酸提取液测定DNA、RNA含量 。 4(RNA、DNA的定量测定 (1)RNA标准曲线的制作 取7支试管，其中一管为空 白管(加2 mL蒸馏水，苔黑酚2 mL)作对照。其余的依次加入40μg,mL的 RNA标准液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2mL，然后分别向 6支试管中加入蒸馏水，使最终体积为2 mL，再向各管加入2 mL苔黑酚显色剂。 混匀后，置沸水浴中显色 15分钟，用 721型分光光度计在A处测定光吸收值，以空白640nm 管为对照，以光吸收值为纵坐标，以RNA的μg(微克)数为横坐标，绘制标准曲线。 (2)DNA标准曲线的制作 取7支试管，其中一管是空白管(加蒸馏水2 mL，二苯胺2 mL)作对照。其余6支试管依次加入0.15 mg,mL的标准DNA液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，然后分别向 6支试管加入蒸馏水，使最终体积 为2.0 mL，再向各管加入二苯胺2 mL。混匀后，置于沸水浴中显色15分钟，用721型分光光度计在A600nm处测光吸收值，以空白管为对照。以光吸收值为纵坐标，以DNA的mg(毫克)数为横坐标，绘制标准曲线。 (3)核中RNA、DNA含量的测定 ?RNA含量的测定 取2支试管，一支加入样品液2 mL和苔黑酚试剂2 mL，另一支试管加入蒸馏水2 mL和显色剂苔黑酚试剂2 mL(为对照管)，混匀后，置沸水浴中显色15分钟，用分光光度计在A640nm处测光吸收值，查标准曲线，计算RNA含量。 ?DNA含量的测定 取2支试管，一支试管加入样品液2mL和二苯胺试剂2mL。另一试管加入蒸馏水2 mL和显色剂二苯胺试剂2 mL(为对照管)，混匀后，置沸水浴中显色10分钟，用分光光度计在A640nm处测光吸收值，查标准曲线，计算DNA含量。 思考题 快速鉴定RNA和DNA的方法是什么, 实验九 紫外吸收法测定DNA含量 一、目的 1.了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 2.学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。 二、原理 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的浓度。 分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA。或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。对于很稀的溶液可采用荧光光度法。 三、器材 分光光度计 比色杯 四、操作 取DNA样品作适当稀释，配制成5~50ug/ml的溶液，用紫外分光光度计测定260nm处的光密度值(OD)，按下列公式计算，求出该样品的DNA含量。 260 DNA浓度(ug/ml )=OD/0.02×L×稀释倍数 260 (L为比色杯的厚度(光径)，一般为1cm。) 实验十 维生素C的定量测定 一、目的 1. 学习维生素C定量测定法的原理和方法。 2. 进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能。 二、原理 抗坏血酸能还原染料2，6—二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6—二氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。 因此，可用2，6—二氯酚滴定样品中还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标 准染料量与样品中所合的还原型抗坏血酸量成正比。 三、器材 1.容量瓶 2.锥形瓶 3.微量滴定管 4.研钵 5.漏斗 四、试剂 1(2,草酸溶液:草酸2g，溶于100m1蒸馏水。 2(1,草酸溶液:溶1g草酸于100 ml蒸馏水。 3(标准抗坏血酸溶液:准确称取50(0 mg纯抗坏血酸，溶于1,草酸溶液，并稀释至500 m L。贮棕色瓶，冷藏，最好临用时配制。 4(1,HCl溶液。 5(0(1,2，6—二氯酚靛酚溶液，溶500 mg 2，6—二氯酚靛酚于300m1含有104mg NaHC03的热水中，冷却后加水稀释至500 m1，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏(4?约可保存一星期)。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。 6. 松针、新鲜蔬菜(辣椒、青菜、西红柿等)、新鲜水果(桔子、柑子、橙、柚等)。 五、操作 1(不同样品用不同方法提取 (1)松针:水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取0(5g，放入研钵中，加1%HCl溶液5m1一起研磨。放置片刻，将提取液转入50 m1容量瓶中。如此反复2—3次。最后用1,ECt溶液稀释到刻度并混匀，静置10分钟，过滤，滤液备用。 (2)新鲜蔬菜和水果类:水洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20(0g，加2,草酸100m1置组织搅碎机中打成浆状。称取浆状物5(0g，倒入50 m1容量瓶中以2,草酸溶液稀释至刻废。静置10分钟，过滤(最初数m L滤液弃去)。滤液备用。 2(滴定 (1)标准液滴定:准确吸取标准抗坏血酸溶液1(0ml(含0(1mg抗坏血酸)置100 ml锥形瓶中，加9ml1%草酸，微量摘定管以0(1,2，6—二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15秒钟即为终点。由所用染科的体积计算出1m1染料相当于多少mg抗坏血酸。 (2)样液滴定: 准确吸取滤液两份，每份10(0 m1分别放人二个l00 m1锥形瓶内，滴定方法同前。 注意:摘定过程宜迅速，一股不超过2分钟。滴定所用的染料不应少于1ml或多于4m1，如果样品含抗坏血酸太高或太低时，可酌量增减样液。 六、计算 V,滴定时所用去染料m1数。 T=1m1染料能氧化抗坏血酸mg数。 W,10 m1样液相当于含样品之g数。 思考题 试述本实验介绍的2，6-二氯酚靛酚滴定法的优缺点。 实验十一 酶的特性 一、目的 加深对酶的性质的认识。 二、内容 本实验由温度对酶的活力的影响;pH对酶活力的影响;酶的激活剂及抑制剂;酶的专 一性四组实验组成。 (一)温度对酶活力的影响 1(原理 酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适 温度为37,40?，植物酶的最适温度为50,60?。 酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100?，其活性并 无明显改变，但在I100?的溶液中却很快地完全失去活性。 低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。 2(器材 (1)试管及试管架 (2)恒温水浴 (3)冰浴 (4)沸水浴 3(试剂和材料 (1)0.2,淀粉的0.3,氮化钠溶液 需新鲜配制。 (2)稀择50倍的唾液 用蒸馏水漱口，以清除食物残渣、再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量简并稀碌50 倍，(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整)混匀备用。 (3)碘比钾—碘溶液 将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前稀释10倍。 4(操作 淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，退碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或 红色。最简单的糊精遏碘不呈颜色，麦芽糖遏碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。 取3支试管，编号后按下表加入试剂: 管号 1 2 3 淀粉溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 稀释唾液(ml) 1 1 - 煮沸过的稀释唾液(ml) - - 1 摇匀后，将1号、3号两试管放人37?恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10分钟后取出，(将2号管内液体分为两半)用碘化钾—碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将二号管剩下的一半镕液放人37?水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何, (二) pH对酶活性的影响 1(原理 酶的活力受环境pH的影响极为显著;不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6(8。 2(器材 (1)试管及试管架。 (2)吸管 (3)滴管 (4)50毫升锥形瓶。 (5)恒温水浴。 3(试剂和材料: (1)新配制的溶于0.3,氯化钠的0.5,淀粉溶液 (2)稀释50倍的新鲜唾液 (3)0.2摩尔,升磷酸氢二钠溶液 (4)0.1摩尔柠檬酸溶液 (5)碘化钾—碘溶液 (6)pH试纸:pH,5、pH,5(8、pH,6(8、PH,8四种 4(操作方法: 取4个标有号码的50毫升锥形瓶。用吸管按下表添加0.2摩尔,升磷酸氢二钠溶液和0.1摩尔,升柠檬酸溶液以制备pH5(0一8(0的四种缓冲液。 从四个锥形瓶中各取缓冲液3毫升，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5,淀粉溶液2毫升和稀释50倍的唾液2毫升。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管内容物混匀，井依次置于37?恒温水浴中保温。 第四管加入唾液2分钟后，每隔I分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为1分钟。 观察各试管内容物呈现的颜色，pH对唾液淀粉酶活性的影响。 (三) 唾液淀粉酶的活化和抑制 1(原理 酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。 2(器材 (1)恒温水浴 (2)试管及试管架 3(试剂和材料 (1) 0.1,淀扮溶液 (2)稀释50倍的新鲜唾液 (3)1,氯化钠溶液 (4)1,硫酸铜镕液 (5)1%硫酸钠溶液 (6)碘化钾—碘溶液 4(操作 管号 1 2 3 4 0.1%淀粉溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 稀释唾液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 1%硫酸铜溶液(ml) 0.5 — — — 1%氯化钠溶液(ml) — 0.5 — — 1%硫酸钠溶液(ml) — — 0.5 — 蒸馏水(升ml)) — — — 0.5 37?恒温水浴，保温10分钟 碘化钾-碘溶液(滴) 2—3 2—3 2—3 2—3 现象 解释结果，说明本实验第3管的意义。 (四)酶的专一性 1(原理 酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。 淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解，蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解，用Benedict 试剂检查糖的还原性。 2(器材 (1)恒温水浴 (2)沸水浴 (3)试管及试管架 3(试剂 (1)2,蔗糖溶液 (2)溶于0.3%的氯化钠的1,淀粉溶液 (需新鲜配制) (3)稀释50倍的新鲜唾液 (4)蔗糖酶溶液 将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2—3次(离心法)，然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100克，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙用力研磨，提取约1小时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。 (5)Benedict氏试剂 无水硫酸铜1.74克溶于100毫升热水中，冷却后稀释至150毫升。取柠檬酸钠173克，无水碳酸钠100克和600毫升水共热，溶解后冷却并加水至850毫升。再将冷却的150毫升硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。 4. 操作 (1)淀粉酶的专一性 管号 1 2 3 4 5 6 1%淀粉溶液(滴) 4 4 - 4 - 2%蔗糖溶液(滴) - 4 - 4 - 4 稀释唾液(ml) - - 1 1 - - 煮沸过的稀释唾液(ml) - - - - 1 1 蒸馏水(ml) 1 1 - - - - 37?恒温水浴，保温15分钟 Benedict试剂(ml) 1 1 1 1 1 1 37?恒温水浴15分钟 现象 (2)蔗糖酶的专一性 管 号 1 2 3 4 5 6 1%淀粉溶液(滴) 4 4 - 4 - 2%蔗糖溶液(滴) - 4 - 4 - 4 蔗糖酶溶液(ml) - - 1 1 - - 煮沸过的蔗糖酶溶液(ml) - - - - 1 1 蒸馏水(ml) 1 1 - - - - 37?恒温水浴，保温5分钟 Benedict试剂(ml) 1 1 1 1 1 1 37?恒温水浴2-3分钟 现象 解释实验结果。 思考题 1.什么是酶的最适温度及其应用意义, 2.什么是酶反应的最适pH,对酶活性有什么影响, 3.什么是酶的活化剂, 4.什么是酶的抑制剂,与变性剂有何区别, 实验十二 底物浓度对酶促反应速度的影响—米氏常数的测定 一、目的 1.了解底物浓度对酶促反应的影响。 2.掌握测定米氏常数Km的原理和方法。 二、原理 酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示: 式中，v??反应初速度(微摩尔浓度变化/min); V??最大反应速度(微摩尔浓度变化/min); ,S,??底物浓度(mol/L); Km??米氏常数(mol/L)。 这个方程表明当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同， Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小:Km值大，表明亲和力小;Km值小，表明亲合力大。测Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值在0.01,100mmol/L。Linewaeaver―Burk作图法(双倒数作图法)是用实验方法测Km值的最常用的简便方法: 于是实验时可选择不同的,S,，测对应的v; 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver―Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸(L-精氨酸和L-赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。 三、器材 1.50mL三角瓶 2.150mL三角瓶 3.吸管5mL，10mL 4.量筒100mL 5.25mL碱式滴定管及滴定台 6.蝴蝶夹 7.恒温水浴 8.滴管 四、试剂 1.10,40g/L酪蛋白溶液(pH8.5):分别取10、20、30、40g酪蛋白溶于约900mL水中，加20mL 1N NaOH连续振荡，微热直至溶解，以1N HCl 或 1N NaOH调pH至8.5，定容至1L，即生成四种不同,S,的酪蛋白标准溶液。 2.中性甲醛溶液:75mL分析纯甲醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1M NaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。 3.0.25%酚酞加50%乙醇溶液:2.5g酚酞以50%乙醇溶解，定容至1L。 4.标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液:称取2g胰蛋白酶溶于50mL蒸馏水中，放入冰箱保存。 五、操作 1(取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，以0.1M标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。 2(量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37?保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37?保温10分钟，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。(同时计时～)充分混合后立即取出10mL反应液(定为0时样品)加入一含甲醛的小三角瓶中(1号)加10滴酚酞;以0.1M NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOHmL数，每mL加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的0.1M标准NaOH mL数。 3(在2分钟、4分钟、6分钟时，分别取出10mL反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOH mL数。 以滴定度(即耗去的NaOH mL数)对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40(相对于40g/L的酪蛋白浓度)。 然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。 利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与Km值。 注意事项 (1)实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。 (2)本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。 思考题 1.试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么, 3.米氏方程中的Km值有何实际应用, 实验十三 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 一、目的 1(学习分光光度计的原理和使用方法。 2(学习测定淀粉酶活力的方法。 3(了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2(CHO)，nHO?nCHO 6105n2122211 麦芽糖有还原性，能使3，5- 二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸。后者可用分光光度计法测定。 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。 本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。 三、器材 1.离心机 2.离心管 3.研钵 4.电炉 5.容量瓶 6.恒温水浴 7.20mL 具塞刻度试管 8.试管架 9.刻度吸管 10.分光光度计 四、试剂和材料 1.小麦种子 2.标准麦芽糖溶液(1mg/mL):精确称取100mg 麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至 100mL。 3(pH6.9，0.02 mol,L磷酸缓冲液 : 0.2 mol,L磷酸二氢钾67.5 mL与0.2 mol,L磷酸氢二钾82.5mL混合，稀释10倍。 4(1,淀粉溶液 1g可溶性淀粉溶于100 mL 0.02 mol,L磷酸缓冲液中，其中含有0.0067 mol,L氯化钠。 5(1, 3，5-二硝基水杨酸试剂 1g 3，5- 二硝基水杨酸溶于20 mL2 mol,L的氢氧化钠 溶液和 50 mL水中，再加入30g酒石酸钾钠，定容至100 mL。若溶液混浊，可过滤。 6(1,氯化钠溶液 7(海砂5g 五、操作 1(种子发芽 小麦种子浸泡2.5小时后，放入25?恒 温箱内或在室温下发芽。 2(酶液提取 取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加海砂 200 mg，加1,氯化钠溶液10 mL，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心(1500 ,min)6,7分钟。将上清液倒入量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用r 缓冲液将酶提取液稀释10倍。 取干燥种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照(提取步骤同上)。 3(酶活力测定 (1)取25mL刻度试管4支，编号。按下表要求加入各试剂(各试剂须在25?预热10分钟) 1 2 3 4 试管标号 干燥种子(或浸泡发芽3或4天幼苗标准管 空白管 2.5h后)的酶提取液 的酶提取液 酶液(ml) 0.5 0.5 - - 标准麦芽糖溶液(ml) - - 0.5 - 1%淀粉溶液(ml) 1 1 1 1 水(ml) - - - 0.5 将各管混匀，放在25?水浴中，保温3分钟后，立即向各管中加入10,3，5-二硝基水杨酸溶液2 mL。 (2)取出各试管，放入沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25 mL。将各管充分混匀。 2. 发芽3或4天幼1.干燥种子的酶提试管标号 3.标准 4.空白 取液 苗的酶提取液 A500光吸收值 (3)用空白管作对照:在A处?测定各管的光吸收值，将读数填入上表。 500nm 4(计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即: A/B=C/C 标准未知标准未知 式中: c为浓度; A为光吸收值。 本实验规定:25?时3分钟内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位。 则15粒种子或15株幼苗的 总活力单位=c×n×V 酶酶酶 式中:c为酶液中麦芽糖的浓度; 酶 n为酶液稀释倍数; 酶 V为提取酶液的总体积。 酶 思考题 1(为什么此酶提纯整个过程在0,5?条件下进行,而测酶活力时要在25?预 保温,反应后又放入沸水浴中, 2(实验结果说明什么, 实验十四 植物体内的转氨基作用 一、目的 1. 掌握转氨基作用的特点，了解转氨酶的作用。 2. 学习应用纸层析法鉴定氨基转移反应。 3. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。 二、原理 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α,氨基酸的 α—氨基与α—酮基酸的α—酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸—草酸乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)和谷氨酸—丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)的活力最强。它们催化的反应如下。 本实验鉴定植物体内谷丙转氨酶所催化的氨基转移反应,即谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α-酮戊二酸后，生成丙酮酸和谷氨酸。在反应后用纸层析法检查底物丙氨酸的减少和产物谷氨酸的生成(定性鉴定);采用分光光度法测定产物丙酮酸的生成和谷丙转氨酶的活力(定量测定)，即丙酮酸与2，4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4—二硝基苯腙 ，后者加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定，从丙酮酸2，4—二硝基苯腙的生成量，可以计算酶的活力。 三、器材 1.研钵 2.10ml量筒 3.离心机 4.移液管 5.恒温箱 6.漏斗 7.层析缸 8.层析纸 9.毛细管 10.吹风机。 四、试剂 1.绿豆芽(25?温箱萌发约2天，芽长约0.5cm)或其它植物材料。 2. 0(1摩尔,升磷酸缓冲液(pH7(4) 3(2.0微摩尔,毫升丙酮酸钠标准溶液 取分析纯丙酮酸钠11毫克溶解于50毫升磷酸缓冲液内(当日配制)。 4 谷丙转氨酶底物 取分析纯α—酮戊二酸29(2毫克，DL—丙氨酸1(78克置于小烧杯内，加1摩尔,升氢氧化钠溶液约10毫升使完全溶解，调整pH至7(4后，加磷酸缓冲液至100毫升。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α,酮戊二酸2.0微摩尔，丙氨酸200微摩尔。在冰箱内可保存一周。 5(2(4—二硝基苯肼溶液 在200毫升锥形瓶内放入分析纯2(4—二硝基苯肼19(8毫克加100毫升1摩尔,升盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4—二硝基苯肼全部溶解后，滤人棕色玻璃瓶内，置冰箱内保存。 6(0(4摩尔,升氢氧化钠溶液 7. 0.1mol/L丙氨酸溶液， 8. 0.1%谷氨酸溶液 9. 0.1%丙氨酸 10. 2%醋酸 11.扩展剂—酚的饱和水溶液 将2份酚和1份水(按重量计算)混合后，放入分液漏斗中，振荡。静止24小时以后 分层，将下部酚层放到瓶中备用(可重复用4次)。 12.显色剂 0.1%水和茚三酮的正丁醇溶液 五、操作 1.酶液的提取 ，放入研钵中，加5ml磷酸缓冲液(pH8.0)研磨成匀浆，转取发芽2天的绿豆芽5粒 入离心管。研钵再用该5ml缓冲溶液冲洗，并入离心管中，以3000r/min的转速离心10min，取上清液备用。 2.谷氨酸产物的定性鉴定 (1)酶促反应 取2支试管，分别标上0”、1”两个号。按下表所列的次序添加各试剂。 将试管摇匀后置于37?恒温箱中保温30min。取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液终止酶反应，于沸水浴中加热10min，使蛋白质完全沉淀，冷却后离心或过滤，取上清液或滤液备用。 )纸层析 (2 取培养皿一个，加入酚水饱和液约1cm(小心，酚有腐蚀性)。取圆形滤纸一张，在滤纸中心剪一小孔(直径约1—2mm)并以圆心为中心约1cm为半径划一圆做为底线。在此底线上，用铅笔点4个原点(等距离)表明1、2、3、4(见图)。用4根毛细玻璃管分别吸取以上2种滤液和标准的谷氨酸和丙氨酸溶液，依次点在滤纸上表明号码的原点处，用吹风机吹干后，再重复点样2—4。注意4点的大小应尽量一致，其直径不大于3mm。然后将滤纸平放含有饱和酚液的培养皿上。另取滤纸小条卷成筒状直径约为1—2mm将其下端剪成刷状。将次小筒插入滤纸中心小孔，(不要突出于纸面上)，使滤纸通过此小筒与酚溶液相连(注意勿使滤纸的其他部分与酚溶液接触)。用大小相同的培养皿盖在滤纸上(见图)，此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩展。当酚溶液扩展到距离纸边缘1.5cm时(约需40—50分钟)，取出滤纸用铅笔划下酚溶液扩展之边缘，并用热风吹干。用喷雾器喷上水合茚三酮溶液，再用热风吹干。用铅笔圈下各显色点，测定各显色点的Rf值，由个点的Rf值分析实验结果。 3.丙酮酸产物的定量测定 (1)标准曲线制作:取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。 2，4,二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α—酮戊二酸与2，4—二硝基苯肼反应，生成α—酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底 物(内含α—酮戊二酸)以抵消由α—酮戊二酸产生的消光影响。 以丙酮酸的umol数为横座标，光吸收值为纵座标，绘制标准曲线。 反应加样表 丙酮酸产物 谷氨酸产物 标准曲线的制作 的定量鉴定 的定性鉴定 试 剂(ml) 试管号 试管号 试管号 0 1 2 3 4 5 0’ 1’ 0” 1” 丙酮酸钠标准液 — 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 — — — — GPT底物 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.50 1.0 1.0 酶 — — — — — — — 0.50 — 1.0 磷酸缓冲液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 — 1.0 — 水浴37?，10min 2，4二硝基苯肼溶液 见操作 0.50 0.5 0.50 0.5 0.5 0.50 0.50 0.50 水浴37?，10min 五 .2 0.4mol/L氢氧化钠溶液 5 5 5 5 5 5 5 在室温下静置30分钟后，在520nm波长处， 以空白(0或0’管)调零点，读取各管吸光值。 (2)丙酮酸产物的定量测定 取2支试管，分别标上0’，1’两个号。按下表所列的次序添加各试剂。 由所测得之吸光值直接查标准曲线，即可得知丙酮酸的产量。 转氨酶的活力 4. 本实验规定: 1微摩尔丙酮酸代表1.0单位酶活力。 计算5粒豆芽中转氨酶的活力单位数。 思考题 1.名词解释 联合脱氨基作用;转氨基作用;氧化脱氨基作用;生糖氨基酸;生酮氨基酸 2.图示或张贴层析图，鉴定丙氨酸和α-酮戊二酸是否进行了转氨基作用，并写出相关 的反应式。 3.实验操作过程中，为何不能用手接触滤纸, 实验十五 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 一、目的 1(学习SDS—PAGE测定蛋白质分子量的原理。 2(掌握SDS—PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体—丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂—N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, 简称PAGE)。 由于各种蛋白质所带的净电荷、分子量大小和形状不同，在电泳中会产生不同的电荷效应和分子筛效应，不连续电泳还有浓缩效应，因而有不同的迁移率。 聚丙烯酰胺凝胶由于富含酰胺基，故它是稳定的亲水凝胶。结构中不带电荷，因而在电场中电泳电渗现象极为微小。网状结构能限制蛋白质大分子的扩散运动，具有良好的抗对流作用。在合适浓度范围内还具有较好的透明度，一定的机械强度，以及化学上惰性、吸附作用很小等许多优点。 十二烷基硫酸钠(简称SDS)是阴离子表面活性剂，它在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在。单体SDS能与蛋白质结合生成蛋白质—SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，所以生成的蛋白质—SDS复合物所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质所带净电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，。在蛋白质溶液中，加入SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位，SDS可使蛋白质亚单位中的氢键、疏水键打开，因此SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变，蛋白质—SDS复合物形状近似雪茄形的长椭圆棒，不同复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述两种情况，蛋白质—SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度有关，也就是只与蛋白质分子量有关。在电泳体系中加入十二烷基硫酸钠(简称SDS)，则电泳迁移率主要依赖于蛋白质分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)。 蛋白质分子量在10，000—200，000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可用下列公式表示: lgM,K,bmr b上式中，为蛋白质分子量;为常数;为斜率;为相对迁移率(即蛋白质的KMmr 电泳迁移距离除以示踪染料迁移距离)。 根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制作出一条标准曲线。在相同条件下只要测得未知分子量的蛋白质的电泳迁移率，即可从标准曲线求得其近似分子量。 不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围(见表3-1)，可根据所测分子量的范围选择最适凝聚浓度，并尽可能选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白。 分子量范围与凝胶浓度的关系 凝胶浓度 交联度 分子量范围 5% 2.6% 25,000—200,000 10% 2.6% 10,000—70,000 15% 2.6% 10,000—50,000 由于SDS—PAGE具有设备简单、快速，分辨率和灵敏度高等优点，广泛应用于生物化学、分子生物学、基因工程、医学及免疫学等方面。 SDS—PAGE作为一种测定蛋白质分子量的方法，尽管对于大部分蛋白质来说，在比较广泛的分子量范围内，蛋白质的迁移率与其分子量的对数确实存在着线性关系，但是有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的(如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等)，他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS—PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。为此，对这类样品分子量的测定，还必须采用其他测定方法作参照。当然这也使得SDS—PAGE特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定。 另外，还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质(如组蛋白F1)，含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白(如胶原蛋白)等，它们在SDS—凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。 三、器材 1.夹心式垂直板电泳槽(附带凝胶模135×100×1.5mm，1台/组)， 2.直流稳压电源(电压300—600V，电流50—100mA)， 3细长头的滴管1只/组 4.1ml注射器， 5.微量注射器(10或50μL)， 四、试剂 1. 标准蛋白质试剂盒(20次/支):按使用说明配制 2. 胰蛋白酶 3. 连续体系SDS—PAGE有关试剂 1)0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液: 称 NaHPO?12HO51.58g及NaHPO?2HO8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。 242242 2) 样品溶解液(上样液) 0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油和0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法如下表: SDS 巯基乙醇 甘油 溴酚蓝 0.2mol/L pH磷酸盐缓冲液 加重蒸水至最后总体积为 100mg 0.1ml 1ml 2mg 0.5ml 10ml 3) 凝胶贮液 称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶内，4?贮存可用1—2个月。 4) 凝胶缓冲液 称SDS0.2g，加0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4?贮存，用前稍加温使SDS溶解。 5) 1%TEMED 取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4?贮存。 6) 10%过硫酸铵(AP) 称AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶内4?贮存。 7) 电极缓冲液(0.1%SDS，0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液): 称SDS1克，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1L。 8) 2%琼脂(糖)粉 称琼脂(糖)2g，加100ml上述电极缓冲液，4?贮存。 4. 固定液 取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 5. 染色液 ，加上述固定液250ml，过滤后应用。 考马斯亮蓝R250 0.125g 6. 脱色液 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1L。 五、操作 (一)安装夹心式垂直板电泳槽 夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个凵形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板(梳子)所组成。电泳槽由上贮槽(白金电极在上或面对短玻璃板)，下贮槽(白金电极在下或面对长玻璃板)和回纹冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部分按下列顺序组装: 1) 装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 2) 将长、短玻璃板分别插到凵形硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3) 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4) 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 5) 竖直电泳槽，用细长头滴管吸取已熔化的2%琼脂(糖)加在长玻璃板下端与硅胶 框交界的缝隙内，其目的是封住空隙，加琼脂(糖)溶液时中应避免有气泡。 (二)配胶及凝胶板的制备 1. 配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。下表表示配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量(单位/ml)。 20ml不同浓度分离胶各试剂用量 凝 胶 浓 试 度 剂 5% 10% 7.5% 凝胶贮液30%Acr—0.8%Bis 3.33 6.66 5.00 0.2mol/LpH7.2磷酸缓冲液内含10.00 10.00 10.00 0.2%SDS 1%TEMED 2.00 2.00 2.00 重蒸馏水 4.57 1.13 2.90 10%AP 0.10 0.20 0.10 2. 凝胶板的制备 按表配制20ml 10%浓度的胶，将分离胶混合液直接倒入两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽模板。凝胶聚合约需30min，20—30min后，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可准备加样。 (三)加样 加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10—15μL。如果样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。 (四)电泳 上槽接负极，下槽接正极，打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至60mA，待染料前沿迁移至距硅胶框底边1—1.5cm处，停止电泳。 (五)凝胶板剥离 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲撬开短玻璃板，在凝胶板切下一 角作为前沿标记。在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。 (六)染色与脱色 先用固定液将凝胶固定1小时，再将染色液倒入培养皿内，染色40min左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 (七)绘制标准曲线 将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离(cm)(即染料迁移距离)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)(即样品迁移距离)，如图所示。按下式计算相对迁移率m: R 样品迁移距离cm，， 相对迁移率m,R，，染料迁移距离cm 以标准蛋白质的分子量为纵坐标，对应的相对迁移率为横坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线，根据待测样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。 样品及标准蛋白在连续SDS-PAGE分离示意图 样品槽1,2,4,5,为待测样品，样品槽3为标准蛋白 思考题 1. 名词解释: 聚丙烯酰胺凝胶电泳中浓缩效应、电荷效应、分子筛效应; 2. 根据实验结果绘出标准蛋白质的标准曲线，并计算出待测蛋白的分子量。 3. 通过本次实验学习，讨论下列问题: 1)SDS—PAGE用于蛋白质分子量测定的基础是什么, 2)对于由多条肽链组成的蛋白质，SDS—PAGE能否测定出它的分子量，如何测定出, 实验十六 葡聚糖凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 一、目的 1. 初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 2. 学习用标准蛋白质混合液制作V, K对的“选择曲线”以及测定未知蛋白质lgMeavr 样品分子量的方法。 二、原理 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。目前关于凝胶层析的原理有许多假设和理论，普遍接受的是分子筛效应。凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后装入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。对凝胶层析分离的简单过程可用图4-1表示。 大 分 子 小分子凝胶颗粒 小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留， 大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 当凝胶装柱后，柱床容积为“总容积”V，它由V,V,V三部分组成: t0ig V,V，V，V t0ig 式中V为外容积，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积，相应于一般层析法0 中柱内流动相的容积;V为内容积，即凝胶颗粒内部所含水相容积，相应于一般层析法中的i 固定相容积;V为凝胶本身的容积。 g 洗脱容积V是自加入样品时算起，到组分最大浓度峰出现时所流出的容积，它与V,V的关e0i 系为: V,V，KVe0di 式中K为分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大d 小和凝胶颗粒空隙的大小分布有关。上式可改写成: VV,e0 K,dVi Kav是有效分配系数，对交联度小的凝胶Kav与Kd差别较小，而对交联度大的凝胶二者差别较大。Kav可用下式表示: V,Ve0 K,avV,Vt0 根据凝胶层析原理，对同一类型化合物的特征与组分的分子量有关。流过凝胶柱时，按分子大小顺序流出，分子量大的走在前面。洗脱容积Ve是该物质分子量对数的线性函数: V,K,KlgMe12r 式中，为常数，为分子量。 K,KM12r 也可以用(有效分配系数)代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通VKeav 常多以对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”。如图4-2所示。选择曲线的Kav 斜率说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定于溶质分子量大小，每一类型的化合物如球蛋白类等都有自己特殊的选择曲线，可用于测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。 球蛋白分子量选择曲线 为了测定分子量，就必须知道一根特定柱的V，V和V，从而计算出K，K等。V可用t0idav0不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖—2000等有颜色的溶液，通过测定大分子物质的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积就是该柱的V值。选一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积V，减去V0e0就是V，常用硫酸铵来测定。V可用下式计算: it 2D,, ,V,h,,t2,, h为常数3.14，D为柱直径，为凝胶床的高度。 , 三、器材 1.层析柱:柱管(直径1.0~1.3cm;管长90~100cm) 2.721分光光度计 3.脱脂棉 四、试剂 1. 蛋白质样品(采用氯化高铁血红素溶液8mg/ml):2ml/组 2. 标准蛋白质混合液:2ml/组 3mg/ml蓝色葡聚糖，8mg/ml肌红蛋白，0.3mg/ml DNP-天冬氨酸。溶剂为含15%(V/V) 甘油的洗脱缓冲液。 3. 蓝色葡聚糖—2000(2mg/ml):2ml/组 4. 硫酸铵(1—2mg/ml):2ml/组 5. 洗脱液[0.05mol/LTris—盐酸溶液(pH7.5)，内含0.1mol/LNaCl]: 50ml 0.1mol/L Tris溶液与40.3ml 0.1mol/L盐酸混匀后，溶解0.585克NaCl， 加水稀释至100ml，即得洗脱液 6. Sephadex G-75 7. 5%Ba(Ac) 2 五、操作 (一)一般操作 1. 凝胶的处理(教师准备) 将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，在室温下放置，使之充分溶胀。为了缩短时间，可在沸水浴中加热将近100?，这样可缩短溶胀时间至几小时，而且可以杀死细菌和霉菌，并 排除凝胶内气泡。 2. 装柱 装柱前将凝胶上面过多的溶液倾出，用真空干燥器抽尽凝胶中空 气。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后 在缓慢搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝 胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉 集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 接着通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放 一张滤纸片或一团脱脂棉，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持 凝胶上端有一段液体。 3. 加样 加紧上、下进出水口夹子，以防止操作压改变。用1ml移液管吸取1ml样品混合液，将移液管尖端小心插入柱中液面下方1cm处，小心释放样品，使其在脱脂棉上端形成一个层面，过程大约需要2分钟完成。看到样品层刚好完全流入凝胶床时，向柱上小心的添加缓冲液至合适高度(约5cm左右)，以保证流速的稳定。(注意:不能使胶床上端无充裕的缓冲液，以防干裂) 4. 洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，先收集10ml流出液，用洗脱液以每管4ml/管流速洗脱，用试管收集流出液，并对每管编号。当所有有色物质洗脱下来后，关闭螺旋夹停止洗脱。然后在对应的波长下读各管的光吸收值。 (二)、蛋白质分子量的测定 1. 测定V0和Vi 将0.5ml蓝色葡聚糖—2000和硫酸铵混合液(2mg/ml)上柱、洗脱，分别测出蓝色葡聚糖的洗脱体积Ve即为该柱的V0，硫酸铵的洗脱体积Ve即为该柱的Vi。蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵的洗脱峰用Ba(Ac)2判断。 2. 标准曲线的制作 按上述方法将1ml标准蛋白质混合液上柱、洗脱，用试管收集。`收集后，于以下对应波长下读各管的光吸收值: 蓝色葡聚糖(蓝色):650nm 肌红蛋白(琥珀色):500nm P-天冬氨酸(黄色):440nm 以洗脱体积为横坐标，光吸收值为纵坐标作洗脱曲线。根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(Ve)，然后以蛋白质分子量的对数lgMr为纵坐标，Ve为横坐标，作出标准曲线。同时根据已测出的V0和Vi以及计算出的Vt，求出Kav。也可以Kav为横坐标，lgMr为纵坐标作出标准曲线。 3. 未知样品分子量的测定 将未知样品按标准曲线的条件操作。根据洗脱峰的位置，量出洗脱体积，也可以计算出Kav，分别由标准曲线查得样品的分子量。 思 考 题 1. 凝胶过滤的介质有哪些，各过滤介质的异同是什么, 2. 通过本次实验学习，讨论SDS—PAGE和凝胶过滤法测定蛋白质分子量的异同。 实验十七 质粒DNA的提取 一、目的 1.了解碱裂解质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想; 2.掌握提取质粒实验中的各项基本技术。 二、原理 质粒DNA提取是基因工程操作中最常用与基本的技术，有多种方法可供选择。例如利用碱性或煮沸条件下质粒DNA和染色体DNA变性、复性的不同来进行分离的碱法;利用EB(溴化乙锭)插入造成不同构型的DNA浮力密度不同的CsCl法;利用在酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布而开环和线性分子在酚相分布的酸酚法等等。 碱裂解法是小量提取质粒最常用的方法，是根据共价闭环质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0,12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链相互盘旋，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭环质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、器材 1.离心机 2.离心管 3.移液 4.三角瓶 四、试剂 1.溶液?:50mmol/L Tis-HCl(pH8.0)、10 mmol/L EDTA 2.溶液?:0.4mol/L NaOH、2%SDS，用前等体积混合。 3.溶液?:5mol/L乙酸钾 60ml、冰乙酸11.5ml 、水28.5ml。 4.酚/氯仿(1:1) 5.无水乙醇 6.70%乙醇 五、操作 1.分别取1.4ml菌液至两支1.5ml离心管，4?，12500 rpm离心1分钟收集菌体。(以后操作两管均相同) 2.弃上清，12500 rpm离心1 分钟，用移液枪将上清液吸干净(此步骤是关键步骤，否 则质粒提不出)。取沉淀，重悬于100μl溶液?(预冷的)，用移液枪吹打至完全分散(必须充分混匀)。 3.加入新配的溶液?200μl立即温和混匀，直到溶液变得澄清(细胞破碎)。(此时溶液应非常粘稠，打开盖时可拉出丝，如果不能，质粒就提不出)。 4.加入溶液?150μl(预冷的)，温和混匀(非常轻柔缓慢的颠倒混匀)，出现白色沉淀。 5.12500 rpm，4?，离心15分钟，取上清液(约400ul)至另一1.5ml离心管，注意不要取到沉淀。 6. 向上清液中加等体积酚/氯仿，反复混匀，室温放置10分钟，12500 rpm，4?，离心5分钟，将上清液转至另一离心管中。 7. 向上清液中加入800μl无水乙醇，混匀后，12500rpm离心10分钟。 8.弃上清(直接倒掉)，将离心管倒扣在吸水纸上数秒，吸干净壁上的残留乙醇。 9.加入500μl 70%乙醇，混匀，8000rpm离心2分钟。 10.弃上清(直接倒掉，不用枪吸)，充分干燥(室温放置半小时或超净台吹干十分钟左右)。 11.加10μl灭菌双蒸水, 5μl 10mg/ml的RNAase(RNA酶)，溶解质粒DNA，充分混匀(用枪吹打数十次)。 12.所提取的两管DNA一管用于酶切 ;另一管取1ul稀释至50ul作PCR的模板DNA，其余部分用于电泳时直接点样。 思考题 DNA提取过程中如何除去蛋白质杂质, 实验十八 质粒DNA的酶切 一、目的 1.了解一般限制性内切酶的各种特性; 2.掌握酶的保存与使用方法; 3.对质粒进行酶切。 二、原理 限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。分子实验中常用的是?型限制性内切酶，它能够识别4,7个核苷酸的具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平末端和粘性末端的DNA片段，常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。 限制性内切酶的反应条件是实验成功的重要因素，只有正确选用反应时间、温度、缓冲体系、DNA的浓度与纯度等，才能达到最佳的酶切效果。此外，DNA制品中的污染常会影响酶切效果，这种抑制可通过增加酶作用单位数，增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。 三、器材 1.离心管 2.移液枪 3.恒温水浴 四、试剂 1.EcoR? 2.Hind? 3.10×Buffer 五、操作 1. 取两只1.5ml离心管，分别标上EcoR?(或Hind?)、双酶切。 2. 取质粒5μl分别加入1.5ml离心管中。 3. 加入1μl 10×Buffer，轻弹管壁混匀。 4. 加入灭菌双蒸水3.5μl(或3.0ul)，轻弹管壁混匀。 5. 分别加入(1)0.5μl EcoR?或Hind?;(2)0.5μl EcoR?和0.5μl Hind?， 轻弹管壁混匀。 6. 37?保温3小时，加终止液，准备电泳。 思考题 什么是限制性内切酶, 实验十九 PCR基因扩增 一、目的 学习PCR 反应的基本原理与实验技术。 二、原理 多聚酶链式反应(PCR)的原理类似与DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA 片段两侧 n和与其两侧互补的两个寡核苷酸因物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、Mgcl、两个合成的2 DNA引物、耐热Tag聚合酶。 三、器材 1.移液枪 2.离心管 3.PCR仪 四、试剂 1.10×buffer 2.dNTP 引物1 3. 4.引物2 5.Tag聚合酶 五、操作 在0.2mlEppendorf管内配制25ul反应体系: 反应物 体积/ul ddHO 15.5 2 10×PCR缓冲液 2.5 2.5mmol/L dNTP 2.0 MgCl 1.5 2 引物1 1.0 引物2 1.0 DNA模板 1.0 Tag酶 0.5(U) 2. 按下述程序进行扩增(根据所用模板适当调整扩增条件) (1) 94? 预变性 3min; (2) 94? 变性 35second; (3) 58? 退火 35 second; 4) 72? 延伸1 min20 second ( (5) 重复步骤(2)-(5)30次; (6) 72? 延伸 10 min 。 3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。 思考题 PCR技术的应用有哪些, 实验二十 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 二、原理 DNA的电泳分离技术是基因工程中的一项基本技术，也是DNA、RNA检测和分离的重要手段。琼脂糖凝胶电泳具有快速、简便、样品用量少、灵明度高，一次测定可获多种信息等特点。 DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同。DNA片段的迁移率与分子大小及高级结构也有密切关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同，但结构不同的DNA分子。如质粒的三种构型的泳动率不同:超螺旋闭合环状质粒最快，线型质粒其次，开环质粒最慢。 溴酚蓝为电泳指示剂，呈蓝紫色，在不同凝胶中分子筛效应小，近似自由电泳，迁移速度变化不大，在1%琼脂糖凝胶电泳中，其迁移率与0.6kb的双链线性DNA片段大致相同。 核酸需染色才能显出带型，最常用的核酸荧光染料为溴化乙锭(EB)。EB可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下发出橘红色荧光。EB为强诱变剂，并有中度毒性，取用时要戴手套，试验操作要小心，含EB的材料要抛弃至指定地点。 三、器材 1.电泳仪 2.电泳槽 3.移液枪 四、试剂 1. 5×TBE: 配1000mlTBE需 Tris 54克，硼酸 27.5克，0.5mol/L EDTA 20ml，pH 8.0。 2. 凝胶上样缓冲液(6×):溴酚蓝 0.25%，蔗糖 40%。 3. 琼脂糖 4. 溴化乙锭(EB) 五、操作 1. 制胶 1) 称取0.2g琼脂糖至三角瓶，加入20ml 1×TAE缓冲液中。 2) 加热溶化至完全溶解，无颗粒状琼脂糖。 3) 将胶槽放平，一块挡板插入胶槽一端，另一块挡板插入胶槽中间的凹口。 4) 倒入少许胶液，快速转动胶槽，任其自然凝固，封住挡板与胶槽之间空隙。 将冷却至60?左右(隔着手套感觉不很烫手)的胶液倒入胶槽，形成均匀的胶面，5) 注意勿产生气泡。 6) 在胶槽一端放入梳子。 7) 等凝胶完全凝固后，竖直方向拔除梳子，去掉两块挡板，将凝胶移入电泳槽中。 8) 加入1×TAE缓冲液至高出胶面2,5mm。 2. 样品准备与点样 (1) 分别取2μl上样缓冲液至质粒管、EcoR?(或Hind?)和双酶切管，混匀。 取5μl混合液，点样(枪头稍稍插入点样孔上方缓冲液中，非常轻缓的注入点 样孔中)。 2) 取4μl加样缓冲液至扩增管中，混匀。取10μl混合液，点样。 ( 3. 记录点样顺序 4. 电泳:接通电泳仪和电泳槽，(红色电极插入红色电极孔中，黑色电极插入黑色电 极孔中，点样孔应在黑色电极一端),恒压80V，当溴酚蓝带泳动到超过凝胶长度 的2/3处时，结束电泳。先关掉电泳仪，再取出凝胶(凝胶易破，小心取出)。 5. 紫外灯下观察并记录结果。 思考题 点样时应注意什么, 实验二十一 真核生物基因组DNA制备 一、目的 学习从真核生物中提取DNA的方法。 二、原理 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白 而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提 的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 三、器材 1.离心机 2.离心管 3.移液枪 4.恒温水浴 四、试剂 1.液氮 2. 5 mol/L KCl 3.异丙醇 4.酚,氯仿 5. TE缓冲液 6.TENbf 7. 70,乙醇 8.新鲜植物叶片 五、操作 1. 取4g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末状(越细越好)。 2. 转移至50ml离心管中，加入16ml TENbf，充分混匀。65?水浴保温20min。 3. 从水浴中取出离心管，加入5ml 5 mol/L KCl溶液，混匀，水浴20min。 4. 4000r/min 离心 20 min。 5. 将上清液转移到另一50ml离心管中。 6. 加等体积酚,氯仿混匀，12000r,min 离心5min，取上清。 7. 加等体积氯仿，混匀，12000r,min 离心5min，取上清。 8. 加入0.6,1倍体积的异丙醇(沉淀DNA)，混匀。放置一段时间。 9. 离心获得沉淀，70,乙醇洗3次。风干沉淀。 10.加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。 11.取3μL上清液,琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量。 思考题 如何获得高纯度的基因组DNA, 附录 一、实验室规则 1. 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。 2. 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字简练、准确，要求同学们记录完整准确的实验数据，养成良好的实事求是的工作作风和求真务实的科学态度，严禁伪造实验数据，弄虚作假。完成实验后经指导老师检查同意，方可离开实验室，课后写出#实验#，于下次实验前上交。 3. 实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐，公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。 勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器须洗净放好，将实验台面抹试干 净，才能离开实验室。 4. 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心细致，防 止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告指导老 师，不得擅自动手检修。 5. 实验室内严禁吸烟～煤气灯应随用随关，严格做到:人在火在，人走火灭。乙醇、丙酮、 乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即关好煤气开 关和水笼头，拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查，严防发生安全事故。 6. 所有实验用的废液，废弃物等，都要收集在适当的容器内，加以储存再处理，不能倒在 水槽内或到处乱扔。 7. 仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。 8. 实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。 二、实验报告的要求 1. 实验前必须了解实验实习内容和有关课程内容，明确实验目的，操作规程正确，操作认真，独立思考，认真观察，作好记录，按时完成实验实习并撰写实验实习报告。 2. 在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件(试剂配制及仪器)和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始实验数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括:关于实验方法(或操作技术)和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象以及思考题，进行探讨;对于实验设计的认识、体会和建议;对实验课的改进意见等。 三、常用的生物化学实验方法 (一)分光光度法 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱对物质进行定性或定量分析的一项技术。它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。 1.原理 光的本质是一种电磁波，具有不同的波长。肉眼可见的光称为可见光，波长范围在400,760nm，波长,400 nm的光称为紫外光，波长,760 nm的光称为红外光。可见光区的光因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的光称为单色光。单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光。可见光区的单色光按波长顺序排列为:红、橙、黄、绿、青、蓝、紫。 许多物质的溶液具有颜色，有色溶液所呈现的颜色是由于溶液中的物质对光的选择性吸收所致。不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同，因此具有其特有的吸收光谱。即使是相同的物质由于其含量不同，对光的吸收程度也不同。利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或利用物质对一定波长光的吸收程度来测定物质含量的方法，称为分光光度法。所使用的仪器称为分光光度计。 朗伯—比尔(Lambert—Beer)定律是分光光度法的基本原理。当一束单色光通过一均 II匀的溶液时，一部分被吸收，一部分透过，设入射光的强度为I，透射光强度为，则0I0 T为透光度，用表示。 当溶液的液层厚度不变时，溶液的浓度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。即: CK(式中为吸光系数，为浓度 ) ,lgT,K,C 当溶液浓度不变时，溶液的液层厚度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。即: L,lgT,K,L(为液层厚度) 将以上两式合并可用下式表示: ,lgT,K,C,L 研究表明:溶液对光的吸收程度即吸光度又称消光度或光密度与透光度，，，，，，AEOD 呈负对数关系,即 ，，T A,,lgT A,KCL故 上式为朗伯—比尔定律，其意义为:当一束单色光通过一均匀溶液时，溶液对单色光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度的乘积呈正比。 朗伯—比尔定律常被用于测定有色溶液中物质含量，其方法是配制已知浓度的标准液 ，将待测液与标准液以同样的方法显色，然后放在厚度相同的比色皿中进行比色，，，，，ST 测定其吸光度,得和 ，根据朗伯—比尔定律: AAST A,KCLA,KCLSSSSTTTT 两式相除得: AKCLSSSS , AKCLTTTT K由于是同一类物质其值相同,又由于比色皿的厚度相等，所以，则 K,KL,L STST ACSS, ACTT ATC,，C TSAS 此即Lambert-Beer定律的应用公式。 2.应用 利用分光光度法对物质进行定量测定主要有以下几种方法: (1)标准管法 将待测溶液与已知浓度的标准溶液在相同条件下分别测定A值，然后按下式求得待测溶液中物质的含量。 ATC,，C TSAS (2)标准曲线法 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测定出它们的A值，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线。在测定待测溶液时，操作条件应与制作标准曲线时相同，以待测液的A值从标准曲线上查出该样品的相应浓度。 (3)吸收系数法 cm时，溶液对某波长的吸光度称为该物质的当某物质溶液的浓度为1mol/L，厚度为1 摩尔吸光系数，以ε表示。ε值可通过实验测得，也可由手册中查出。 已知某物质ε值，只要测出其A值再根据下式便可求得样品的浓度。 A,Cε 3.分光光度计 分光光度计种类较多，其结构基本相似，以722型分光光度计为例说明。 (1)主要部件 722型分光光度计的主要部件包括光源室、单色光器、试样室、光电池暗盒、电子系统及数字显色器等部件。 (2)工作过程 聚光镜 滤色片 钨灯 入射狭缝 反射镜 准直镜 出光狭缝聚光镜光栅光门样品室 光电池 图1-1 722型分光光度计光学系统图 如图所示:由钨灯发出的连续辐射光经滤色片选择及聚光镜聚光后经入射光狭缝进入单色光器，进入单色光器的复合光通过平面反射镜反射及准直镜准直变成平行光射向色散元件光栅，光栅将入射的复合光通过衍射作用形成按照一定顺序均匀排列的连续单色光谱，此单 色光重新回到准直镜上，由于仪器出射狭缝设置在准直镜的焦面上，这样从光栅色散出来的光谱经准直镜后利用聚光原理成像在出射狭缝上，通过调节与准直镜和光栅联动的波长调节旋纽，出射狭缝可选出指定带宽的单色光。单色光通过聚光镜落在试样室被测样品中心，一部分被吸收，一部分透过，透射光经光门射向光电池，产生光电流，光电流经检流计的仪表显示出来。 (3)波长的选择 Lambert—Beer定律只适用于单色光，不同颜色的溶液，吸收的单色光是不同的。因此，不同颜色的待测溶液，应选择不同波长的单色光。其选择原则是使被测溶液的单位浓度的吸光度变化最大，也即最容易被溶液吸收的波长。通常是根据其光吸收曲线来选择最佳测定波长。 (4)操作方法 ?.将灵敏度旋纽调至“1”档。 ?.打开电源开关，接通电源。 ?.选择开关置于“T”，选择需要的波长。仪器预热20分钟。 ?.打开试样室盖(光门自动关闭)，调节“0”旋纽，使数字显示为“00.0”。将空白液、标准液和待测液分别装入比色皿中，使空白液对准光路。盖上试样室盖，调节透光率“100%”旋纽，使数字显示为“100.0”，如不显示“100.0”可适当增加灵敏度的挡数。 ?.吸光度A的测量:将选择开关置于“A”，调节吸光度调节旋纽，使数字显示“0.00”，然后将标准液和待测液分别推入光路，读取其吸光度。 ?.浓度C的测量:将选择开关由“A”旋置“C”，将标准液推入光路，调节浓度旋纽，使数字显示为标准液浓度，将待测液推入光路，读出被测样品的浓度值。 ?.比色完毕后关闭电源开关，将比色皿冲洗干净，倒置于实验台上。 (5)注意事项及维护 ?.使用仪器前应先了解本仪器的结构和工作原理以及各个操作旋纽的功能。 ?.在未接通电源前，应对仪器进行检查，电源通地要良好，各个调节旋纽应在起始位置。放大器暗盒的硅胶如变红色应及时更换或烘干后再用。 ?.每台仪器所配套的比色杯不能与其他仪器上的比色杯单个调换。 ?.仪器停止工作时，应切断电源。 ?.保持仪器的清洁和干燥，仪器在停止使用时应用塑料套子将仪器罩住，在套子内放数袋硅胶防潮。 ?.仪器工作数月或搬动后，要检查波长和吸光度精度，以确保仪器的使用和精度。 (二) 电泳法 带电粒子在电场中向着电性相反的电极移动的现象称为电泳。利用电泳对物质进行分离的方法称为电泳法。 1.原理 设一带电粒子在电场中所受的力为F，F的大小取决于粒子所带的电荷Q和电场强度X，即: F , QX ’又按stoke定律，一球形的粒子运动时所受到的阻力F与粒子的运动速度V 、粒子的半径r、介质的粘度η的关系为: ’F,6πrηV 当电泳达到平衡时，带电粒子在电场作匀速运动，则 ’ F , F 即: QX , 6πrηV 移项得: QV,(1)X6πrη V/X表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率，以μ表示，即 QV,,μ(2)X6πrη 由式(2)可见粒子的迁移率在一定条件下取决于粒子所带的电荷及形状的大小，带电荷多而颗粒小的迁移率快，反之则迁移率慢。 在实验中，电泳速度为单位时间t(秒)内移动的距离d(cm)，即 d V, t 电场强度X为单位距离ι(cm)内的电势差(伏)，即当距离为1cm、电势差为E时，则 EX, ι 以V,d/t ，X,E/ι代入(2)式即得 ddV ιtμ,,,EιXE t 2所以迁移率的单位为cm/sec?V 如A物质在电场中移动的距离为 EtdμA,Aι B物质在电场中移动的距离为 EtdμB,Bι 两物质移动距离的差为: Et?d ,(d,d),(μ,μ)A B AB ι 由上式说明A物质和B物质能否分离取决于两者的迁移率，如相同则不能分离，如不同则能分离。电泳技术能对各种物质进行分离就是利用各物质迁移率的差别。不同的物质由于其所带电荷的性质、多少及分子大小、形状的不同，从而具有不同的迁移率，经过一定时间的电泳后可达到将其分离的目的。 2.影响电泳的的因素 (1)样品 电泳速度与被分离物的带电荷量成正比，分子大小成反比。球形的分子电泳速度比纤维状的快。 (2)溶液的pH 溶液的pH决定了电泳物质的带电状态及带电量。为了保持溶液在整个电泳过程中有较稳定的pH，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白常用pH8.6的巴比妥缓冲液。 (3)缓冲液的离子强度 离子强度(I)是指溶液中各种离子的摩尔浓度(c)与其电荷数平方(z)乘积总和的ii1/2。即 2 I,1/2?czii 如:0.154mol/L的氯化钠溶液的离子强度为: 22I,1/2?(0.154×1，0.154×1),0.154 电泳时要求离子强度在0.05,0.1之间。离子强度过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH的恒定;离子强度过高，则样品所带的分电流降低，使电泳速度减慢。 (4)电场强度 电场强度与电泳速度成正比。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。以醋酸纤维薄膜为例，其长度为8厘米，两端的电势差为120V，则电场强度为120/8,15V/cm。电场强度越高，电泳速度越快;但电压越高，产热量增加可使蛋白质变性而不能分离。所以高压电泳时(电场强度,50V/cm)常需要用冷却装置。 (5)电渗 在电场中液体对固体的相对移动，称为电渗。在水溶液中，电泳所用的支持物表面的化学基团可解离而带电，如滤纸表面的羟基解离使介质表面带负电荷。水是极性分子，因此与滤纸表面接触的水溶液带正电荷。在电场作用下，则向负极移动。电泳和电渗往往是同时发生的，带电粒子的移动距离受电渗影响。若电泳的方向与电渗的方向相反，则电泳的实际距离等于两者距离之差;若两者的方向相同，则电泳的实际距离为两者距离之和。 固体固体 正极负极负极正极,,,,,,,,,,,,,，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，,,,,,,,,,,,,, 表面带正电表面带负电带正电的水层向负极移动带负电的水层向正极移动 图1-2 电渗示意图 3.区带电泳的分类 利用支持物作载体，被分离物质经电泳后形成区带，称为区带电泳。 (1)按支持物的物理性状不同分类 ?滤纸及其他纤维膜电泳 如醋酸纤维薄膜、玻璃纤维电泳等。 ?粉末电泳 如纤维素粉、淀粉、硅胶电泳等。 ?凝胶电泳 如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 (2)按支持物的装置的形式不同分类 ?水平式电泳 支持物水平放置，是最常用的电泳方式。 ?垂直板式电泳 比较少用，如聚丙烯酰胺凝胶垂直板式电泳。 ?垂直柱式电泳 如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。 ?连续流动电泳 它是利用溶液的虹吸作用和电场的引力来分离样品。将支持物垂直竖立，两边各放一电极，溶液和样品自顶部流下，与电泳方向垂直。样品一方面受电场作用向所带电荷相反的电极方向移动，另一方面在缓冲液的推动下垂直向下移动，两种因素共同作用使样品分离。 (3)按pH的连续性分类 ?连续pH电泳 指电泳的全过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。 ?不连续pH电泳 指缓冲液和电泳支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。 4.电泳技术的应用 电泳技术主要用于分离各种有机物如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷酸、核酸等，所以电泳技术是医学科学中重要的研究技术。 (三)层析法 1.概念 层析法是根据混合物中各组分的理化性质(溶解度、吸附力、分子极性、分子形状和大小等)的不同，通过一定的支持物(层析柱或层析板)将各组分分离分析的方法。由于其主要是依据物质的物理性质不同将各种物质进行分离，故该方法是一种广泛应用的物理化学分离分析技术，也是生物化学最常用的分离技术之一。 层析法分析测定的对象是混合物，一般是将样品放在一定的支持物上，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中在层析中固定不动的称为固定相，在层析中不断流过固定相的液体或气体称为流动相，被层析的混合物中各组分随着流动相的移动被层析分离，即通过层析将混合物中各组分一一分开，作定性定量分析。层析法具有高效能、高度选择性、高度灵敏度和操作简便等特点，尤其适合样品含量少，杂质含量多的复杂生物样品的分析。 2.分类 (1)按两相所处的状态分类 流动相为液态的称为液相层析，流动相为气态的称为气相层析。固定相也有两种状态， 一种是以固体吸附剂作固定相，另一种是以吸附在固体上的液体作固定相，故可分为如下几类: 液—固层析 1.液相层析,液—液层析 气—固层析2.气相层析,气—液层析 (2)按层析的原理分类 ?吸附层析 固定相是固体吸附剂。利用固体吸附剂表面对不同组分的吸附能力的差异达到分离的目的。 ?2.分配层析 固定相为液体。利用不同组分在固定相和流动相之间分配系数(即溶解度)不同使物质分离。 ?离子交换层析 固定相为离子交换剂。利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 ?凝胶层析 固定相为凝胶。利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。 (3)按操作方式不同分类 ?柱层析 将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动，以达到分离的目的。 ?纸层析 以滤纸作载体，点样后用流动相展开，以达到分离的目的。 ?薄层层析 将粒度适当的吸附剂均匀地涂成薄层，点样后用流动相展开，以达到分离的目的。 (四) 离心分离法 利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差别将悬浮液中的微粒从溶液中进行分离、浓缩和提纯的一种方法，称为离心分离法。 1.原理 悬浮液静止不动时，由于重力场的作用，悬浮液中比液体重的微粒逐渐沉降，粒子越重下沉越快;反之，密度比液体小的微粒就向上浮。微粒在重力场中下沉或上浮的速度与颗粒的密度、大小和形状有关，而且还与重力场的强度、液体的粘度有关。另外微粒还有扩散运动。 红细胞等直径在数微米的颗粒可以利用重力来观察其沉降速度，如血沉。但对更小的 微粒如病毒、蛋白质分子等则不能利用重力来观察它们的沉降速度。因为其颗粒越小，沉降速度越慢，而且扩散现象也越严重，所以需加大重力场，即利用离心的方法产生离心力来克服扩散现象。 (1)离心力 时，任何颗粒均受到一个当离心机转子以一定的角速度ω旋转，颗粒的旋转半径为r 向外的离心力，即 2F , ωr ω为角速度，以弧度/秒表示，r为旋转半径，指离心管的中心线到旋转轴中心的距离，以cm表示。 离心力F通常以地心引力的倍数表示，称为相对离心力(RCF)。RCF是指离心场中作用 2于颗粒的离心力相当于地心引力的倍数，单位是重力加速度g(980cm/sec),即 2ωrRCF , (1) g 由于 2πrpmω ,60 带入(1)式得: 224π(rpm)r-52×(rpm)×r1.118×10RCF , ,g360 式中的rpm为离心机每分钟转数，由上式可以看出相对离心力与转速平方和旋转半径的乘积成正比。 (2)沉降速度 沉降速度V是指在离心力作用下，单位时间内颗粒沉降的距离。一个球形颗粒的沉降速度不仅取决于离心力的大小，也取决于颗粒的密度和半径以及悬浮介质的粘度。 2σ,ρd 2rV , ω18η d为颗粒直径，σ为颗粒密度，ρ为介质密度，η为溶液的粘度。 沉降系数 -13沉降系数是指单位离心力作用下，颗粒的沉降速度，用S表示，1S,1×10秒。 2V dσ,ρS , ,2ωr18η 从上式可以看出:在离心场中如果颗粒的密度大于介质的密度(σ,ρ)，则S,0，颗粒发生沉降;σ,ρ时，S,0，颗粒沉降到某一位置达到平衡;σ,ρ时，S,0，颗粒发生漂浮。 由于沉降系数与颗粒的分子大小成正比，故常用S来描述生物大分子的分子大小。 2.分类 根据离心机的转速的不同，可将其分为低速离心机(转速,6 000rpm)、高速离心机(转速,25 000rpm)和超速离心机(转速,30 000rpm)。 根据离心机的用途不同，可将其分为分析离心机和制备离心机。其中制备离心技术又分为分级离心技术和密度梯度离心技术。 3.离心机的使用 生化实验中常用的是普通离心机(1 000,4 000rpm),用于分离血清、沉淀蛋白质等。使用方法及注意事项如下: )使用前在无负荷的情况下，开动离心机(3 000转/mim)，检查离心机转动是否平(1 稳;检查套管内是否有橡皮软垫。 (2)检查合格后，将盛有离心液的离心管放入离心套管内，位置要对称，重量要用天平平衡，如不平衡，可在离心管和套管的间隙内加水来调节重量使之达到平衡。 (3)离心管中的液体不能装的太满(占2/3)，以免溢出。 (4)盖上离心机盖子，接通电源，缓慢逐步加速到所需速度。不能一下将速度调到最大，以免引起强烈的震动而损坏电机或使离心管破碎。 (5)毕，将转速缓慢逐步钮回起点，任其自动停稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。 (6)离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即切断电源，待检查排除故障后方能使用。