简便法分离回收血浆白蛋白并清除胆红素_cropped

简便法分离回收血浆白蛋白并清除胆红素_cropped 161 . istry , 1982 , 21?1453 - 1463 . ( 2 Schwartz DE , Paller AS , Lizak PP , et al . Elastase and neutral cathepsin ? basement 7 Mainardi CL , Dixit SN , Kang AH. Degradation of type ) production by human fibroblasts : effect of culture condition on synthesis membranecollagen by a proteinase isolated from human polymorphonu2 and secretionJ . J . Invest . Dermatol , 1986 , 86 ?63 - 68 . clear leukocyte granulesJ . J Biol Chem , 1980 , 255 ?5435 - 5441 . 3 Janoff A , Scherer J . Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes 8 MacDonald JA , Kelly DG. Degradation of fibronection by human leuko 2 ?. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leuko2 cytes elastase J . J biol chem , 1980 , 255 ?8848 - 8858 . cytesJ . J Exp Med , 1968 , 128 ?1137 - 1151 . 9 Heck LW , Blackburn WD , Irwin MH , et al . Degradation of basement 4 Werb Z , Gordon S. Elastase secretion by stimulated macrophages : Char 2 membrane laminin by human neutrophil elastase and cathepsin GJ . AM acterization and regulationJ . J Exp Med , 1975 , 142 ?361 - 377 . J Pathol , 1990 , 136?1267 - 1274 . 5 Lavie G , Zucker - Franklin D , Franklin EC. Elastase - type proteases on 10 Roughleg PJ , Barrett AJ . The degradation of cartilage proteoglycans by the surface of human blood monocytes :possible role in amyloid formation tissue proteinasesJ . Biochem J , 1997 , 167 ?629 - 637 . J . J Immunol , 1980 , 125 ?175 - 180 . 11 Murakami T , Sato M , Higashikawa F , et al . Hepatic clearance of ONO 6 Jiang J , Mistumata M , Shu Q , et al . Migration and proliferation of cell - 5046 , a novel neutrophil elastase inhibitor , in rats and in the rat per2 () fused liver J . J Pharm Pharmacol , 1998 , 50 4?425 - 430 . for arterial intimal growth C . Molecelular Biology Intelligence Unit 5 . Molecelular Mechanisms of Smooth Muscle Contraction , 1999 , ppl 143 - 简便法分离回收血浆白蛋白并清除胆红素 徐 兵 ,江家骥 ,林 灼 ,邱仲琼 ,王冬银 ,陈 怡 ,李勤光 ,胡盈莹 ,陈 敏 ,蒋晓织 () 福州市传染病医院 ,福建 福州 350025 【摘要】在用人工肝治疗时 ,患者要丢失大量血浆 。为了分离回收人工肝废弃血浆中的白蛋白 ,我们用中性盐 NaCl 盐析法沉淀分离白蛋白 ,再用碱性活性碳清除与白蛋白结合的胆红素 ,可回收血浆中 83 %的白蛋白 ,清除血浆 中 74 %的胆红素 ;回收的白蛋白溶液中 NaCl 浓度比回收前增高 115 - 2 倍 , HBV DNA 载量降至用 PCR 荧光定量法 测不出 。本法简便安全 ,回收的血浆白蛋白没有变性 ,有望回输给患者 。 【关键词】人工肝 ;血浆白蛋白 ;盐析 ;胆红素 ;活性碳 () 【文章编号】1001 - 5256 200206 - 0340 - 02 【中图分类号】R575 【文献标识码】B Easy method f or separation and recovery of albumin and clearance of bilirubin from plasma XU Bing , J IANG Jia - ji , ( )L IN Zhuo , et al . Fuzhou hospital f or infectious diseases , Fuzhou Fujian 350025 Abstract :During the treatment of artificial liver , a lot of plasma of the patient will be discharged. To separate and recover the a2l bumin from the discharged plasma , we developed the NaCl salt - out and the basic activated carbon adsorbtion methods which showed a rate of recovery of 87 % for albumin and a clearance rate of 74 % for bilirubin. In the recovered albumin solution , NaCl cocentration was increased by 115 - 2 folds and the load of HBV DNA was undetectable by fluorogenic quantitative PCR. The new method was easy and safe . The recovered albumin has not been denatured. It’s very possible that the recovered albumin to be transfused back to the patient in the future . Key words :artificial liver ; plasma albumin ; salt - out ; bilirubin ; activated carbon 人工肝技术主要包括血浆置换 、血浆吸附 、血液; 用碱性活性碳清除回收人工肝废弃血浆中白蛋白 滤过和血液透析 ,其中的血浆置换是通过滤膜将病 胆红素 ,建立了一种快速实用的回收血浆白蛋白方 法 ,现介绍如下 。 人的部分血浆从血液中分离并弃去 ,再给病人补充 1 和方法健康人血浆 。血浆置换可迅速降低血中毒物 ,改善 () ( ) 111 材料 氯化钠 NaCl ,冰醋酸 CHCOOH, 氢 3 病人症状 ,但病人也要损失大量血浆蛋白 。如何回 () 氧化钠 NaOH和活性碳购自上海联试化工试剂有 收利用经血浆置换而废弃的血浆蛋白 ,是人工肝待 ( 限公 司 , 都 是 分 析 纯 。生 化 自 动 分 析 仪 Beckman 解决的问题之一 。我们在体外用盐析法可逆性沉淀 ) CX9和 配 套 试 剂 购 自 Beckman 公 司 。膜 型 血 浆 交 ) ( 换机 KM - 8800 和血液滤器 PS - 06 人 工 肝购 自 收稿日期 :2001 - 09 - 25 修订日期 :2002 - 01 - 04 ( ) Kuraray 公司 。乙肝 病 毒 HBVDNA PCR 荧 光 定 量() 作者简介 :徐兵 1959 - ,男 ,医学硕士 ,副主任检验师 。 () 检测试剂 用于 Roche Lightcycle购自上海复星公司 。 112 方 法盐 析 法 分 离 血 浆 白 蛋 白 :参 照 文 214 HBV 清除情况 : 回收前血浆 HBV DNA 最高达 26 献,略加改进 。用 NaCl 代替硫酸胺 。无菌收集人4 ×10copies/ ml ,回收的蛋白溶液中 HBV DNA 全部 小于 420copies/ ml 。 工肝置换血浆 ,加等量生理盐水 ,用冰醋酸调 p H412 ,p H415 ,分次加入与血浆等量的无菌饱和 NaCl 溶 3 讨论 ( ) 液 ,置 4 ? 3h,12h ,离心 2000 转/ 分 ,20min,弃去 人工肝血浆置换疗法治疗重症肝炎的短期疗效 迅速确切 。但该法置换出来的血浆一般都废弃了 , 全部上清 ,保留沉淀 。 清除与白蛋白结合胆红素 : 在上述沉淀中加 平均每次治疗要废弃约 2500ml 血浆 。目前国外报 () 入适量 经 高 压 灭 菌 的 活 性 碳 混 悬 液 , 用 013mol/ L 道的“分子吸收再循环系统”MARS和“分段血浆分 ( ) NaOH 调 p H 至 1115 ,摇匀 ,5min 后用冰醋酸调 p H 至 离吸收系统”FPSA, 都旨在回收这些血浆中白蛋 ( ) ( 白 ,主要技术是通过不同孔径的滤膜多重滤过 ,选择 714 ,然后离心 2500 转/ 分 ,10 分钟, 吸 取 上 清 勿 1 ) 混入活性碳,即制成回收的白蛋白溶液 。 检测溶 性分离 回 输 白 蛋 白。这 些 方 法 都 是 在 体 外 循 环 () 液生化组成和 HBV 载量变化 : 用生化自 连体情况下进行 ,技术要求高 ,故目前还未普及 。 + - 动分 析 仪 测 定 溶 液 的 球 蛋 白 、白 蛋 白 、Na 、Cl 、 本文设计了一套简便的离体处理技术回收白蛋白 : 6 6 Ca 、Mg 和 胆 红 素 。计 算 NaCl 剩 余 量 、蛋 白 回 收 用中性盐盐析法分离白蛋白 ; 用活性碳清除吸附的 率 、胆 红 素 清 除 率 。用 荧 光 定 量 PCR 测 定 HBV 胆红素 。全部操作 过 程 都 在 封 闭 瓶 内 用 注 射 器 进 行 ,可有效防止污染 。目前分离白蛋白的方法主要 DNA ,计算 HBV 清除率 。 统计学处理 :两组间比较用 t 检验 , P < 0105 为 有盐析法和低温乙醇法 ,后者回收率高 ,白蛋白纯度 相差显著 。 高 ,但生产条件要求严格 。盐析法是通过高浓度中 () 性盐 硫酸铵 、硫酸钠 、氯化钠等去水化作用和离子 2 结果 () 211 蛋白质的回收情况 1:本法回收的蛋白质主 中和 作 用 , 聚 集 蛋 白 质 , 并 在 等 电 点 p H 值 附 近 沉 () 要是白蛋白 占 70 %,白蛋白的平均回收率是 83 %。 淀 。再降低盐浓度和改变 p H ,使沉淀重新溶解为有 () 表 1 不同浓度 NaCl 盐析法蛋白质回收量 g/ L , x ?s活性的蛋白 。盐析法温和简便 ,蛋白质不易变性 ,虽 然蛋白回收率和纯度较低 ,但可满足临床需要 。本 NaCl 饱和度 总蛋白 白蛋白 球蛋白 34 ?513 26 ?510 8 ?213 50 % 文用 NaCl 盐析法 。NaCl 无毒 ,虽然回收蛋白溶液中 33 % 32 ?31125 ?4177 ?118NaCl 浓度较高 , 但经适当稀释即可在 生 理 范 围 , 故 3# 16 % 7 ?21021 ?518 14 ?416 6 6 不必除盐 ; 其余 Ca 、Mg 均明显降低 , 不影响回收 注 :与 33 %NaCl 饱和度组比较 3 为 P < 0105 , # 为 P < 0101 + 蛋白溶液再利用 。正常时血浆中胆红素绝大部分与 () 212 NaCl 残留量 :回收前 Na 141 ?1014mmol/ L , (() 白蛋白结合 通过盐键 、氢键和电荷转移与白蛋白的 盐析后为 302 ?2516mmol/ L ,增加 115 倍 。回收前 - (( ) ) Cl 103 ?915mmol/ L ,盐析后为 209 ?1713mmol/ ) 阳离子基团结合,当 p H 值大于 11 时也可使胆红素 3 L ,增加 2 倍 。经适当稀释即可在生理范围 ,故不必 与白蛋白解离 。本法用 p H 1115 溶液和活性碳吸 6 ( ) 除盐 。Ca 由 回 收 前 214 ?0104 mmol/ L , 降 为 0 ; 附 ,可使 74 %与白蛋白结合的胆红素解离并清除 , 6 ( ( ) ) Mg 由 0187 ?0105 mmol/ L 降 至 0109 ?0102 ( ) 而且只要及时 < 5 分钟将 p H 调回 714 ,白蛋白不 mmol/ L 。 会发生不可逆变性 ,回收白蛋白溶液澄清 ,蛋白质测 ( ) 213 胆红素清除情况 表 2: 盐析后弃去上清液 ,定值无明显变化 ,有望回输给病人 。在回输前还必 使总胆红素平均降低 45 % ; 经活性碳吸附后又使总 须作无菌试验 ,内毒素和热原等指标测定 ,只要严格 ( 胆红素平均降低 55 % 主要是从白蛋白解离的胆红 控制所用试剂和器具 ,就可使这些指标在正常范围 。 ) 素;最后残余的总胆红素是回收前的 26 % 。 (μ) 表 2 盐析和吸附后溶液胆红素含量 mol/ L , x ?s[ 参 考 文 献 ] 1 Falkenhagen D , Strobl W , Vogt G , et al . Fractionated plasma separation 回收前 盐析后 吸附后 and adsorption system : a novel system for blood purification to remove al2 #3270 ?8718 145 ?6219 总胆红素 71 ?915 () bumin bound substances. J . Artif - Organs , 1999 , 23 1?81 - 86 . 349 ?817 直接胆红素 144 ?6312 70 ?2911 2 卢锦汉 ,张以浩 ,赵铠主编. 医学生物制品学 M . 北京 : 人民卫生 3# 间接胆红素 126 ?6015 75 ?4616 22 ?1317 出版社. 1995 ,844 . 注 : 与 回 收 前 比 较 3 为 P < 0101 , 与 盐 析 后 组 比 较 # 为 P < 3 KPM 海韦. 胆红素M. 北京 :北京大学出版社. 1991 . 92 - 107 . 0101 。