蟾蜍坐骨神经干复合动作电位特性

蟾蜍坐骨神经干复合动作电位特性 【摘要】 目的：研究蟾蜍坐骨神经干的特性、双相动作电位形成机制及神经损伤、药物对神经兴奋传导的影响。：应用微机生物信号采集处理系统测定蟾蜍坐骨神经干复合动作电位。结果：刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms时，中枢端引导的第一对引导电极双向动作电位正相振幅和负相振幅分别为3.77±1.75mV和2.38±0.98mV，正相振幅大于负相振幅，(P<0.01)；第一对引导电极动作电位正相时程和负相时程分别为1.19±0.13ms和2.48±0.42ms，正相时程短于负相时程，(P<0.01)；第二对引导电极双向动作电位正相振幅和负相振幅分别为2.35±0.77mV和1.24±0.41mV，负相振幅小于正相振幅，(P<0.01)；第二对引导电极动作电位正相时程和负相时程分别为1.69±0.21ms和2.78±0.48ms，，负相时程长于正相时程，(P<0.01)。刺激电压1.0V，波宽0.1ms，末梢端引导的第一对引导电极等于10mm、20mm、30mm时末梢端引导的动作电位正相振幅A10p、A20p、A30p分别为8.60±2.92mV、10.87±3.59mV、10.93±3.63mV，A20p、A30p均大于A10p，且有显著性差异(P<0.01)，A20p、A30p之间无明显差异（p>0.05）。负相振幅A10n、A20n、A30n分别为4.49±1.67mV、5.80±2.10mV、3.81±1.37mV，A20n、A30n与A10n，有显著性差异(P<0.01)。刺激电压1.0V，波宽0.1ms，末梢端引导的双相动作电位正相振幅为8.96±3.43mV，负相振幅为4.61±2.10mV，正相振幅大于负相振幅,（p<0.01）；正相时程为1.15±0.18ms，负相时程为2.42±0.34ms，正相时程小于负相时程,（p<0.01）；刺激电压1.0V，波宽0.1ms，末梢端引导的单相动作电位振幅为10.32±4.18mV，大于双相动作电位正相振幅，(P<0.05)；末梢端引导的单相动作电位时程为2.10±0.60ms，大于双相动作电位时程，(P<0.01)。刺激波宽为0.1ms时，阈刺激为0.26±0.06V，最大刺激为0.66±0.20V。刺激电压为1.0V时，动作电位的传导速度为26.87±6.14m/s。刺激电压1.0V，波宽为0.1ms时，第二对引导电极用3mol/LKCL处理前双相动作电位正相振幅为2.84±0.61mV，小于处理后双相动作电位正相振幅3.35±0.67mV，(P<0.01)；处理前双相动作电位负相振幅1.43±0.71mV，大于处理后双相动作电位负相振幅0.33±0.35mV，(P<0.01)。刺激电压1.0V，波宽为0.1ms时，第一对引导电极4％procaine处理前双相动作电位正相振幅8.07±2.32mV，小于处理后双相动作电位正相振幅9.21±2.28mV，(P<0.05)；处理前双相动作电位负相振幅3.53±2.32mV，大于处理后双相动作电位负相振幅1.05±1.15mV，(P<0.05)。结论：在一定范围内神经干动作电位振幅与刺激强度呈正相关，神经损伤、3mol/L KCl、4% procaine对神经干动作电位的传导均有阻滞作用，阻断神经的兴奋传导，兴奋可在神经纤维上双向传导，不对称的正相波和负相波叠加形成双相动作电位。 【关键词】：神经干；动作电位；损伤；刺激；传导速度 1 实验动物与材料 1.1 实验动物：蟾蜍（中华蟾蜍指名亚） 1.2 药品：任氏液、4% 普鲁卡因、3 mol/L 氯化钾 1.3 器材：RM6240 生物信号处理系统（成都仪器厂）、神经标本盒 2 实验方法 2.1 仪器连接和参数设置：神经干标本盒两对引导电极分别接微机生物信号处理系统1、2通道。仪器参数：第1、2通道时间常数0.02s、滤波频率3KHz、灵敏度5mV，采样频率：100KHz，扫描速度：0.2ms/div。单刺激模式，刺激幅度1.0V，刺激波宽0.1ms，延迟2ms，同步触发。 2.2 制备蟾蜍坐骨神经干标本：蟾蜍毁脑脊髓制作下肢标本，去上肢和内脏，下肢剥皮浸于任氏液中。蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；标本腹面向上，用玻璃分针分离脊柱两侧神经丛，用线在近脊柱处结扎，剪断神经；将神经干从腹面移向背面。标本背面向上固定，从大腿至跟腱分离坐骨神经。坐骨神经标本置任氏液中备用。 2.3 记录动作电位：用镊子夹持神经干标本扎线，置于标本盒的电极上，神经与其相应电极均接触良好，调节刺激电压，记录动作电位。 3 观察项目 3.1 检验神经干标本兴奋性：神经干中枢端置于刺激电极处，用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波刺激神经干，观察是否有动作电位。 3.2 测定中枢端引导的双相动作电位(biphasic action potential, BAP)：用1.0 V电压，波宽0.1ms的单个方波刺激神经干末梢端，观察中枢端两个引导电极的BAP正、负相振幅(amplitude，A)和时程(duration，D)。 3.3 测定末梢端引导的双相动作电位：用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定末梢端BAP正、负相振幅和时程。        3.4 兴奋传导速度的测定：用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波刺激神经干中枢端，测定第1和第2对引导电极引导CAP起点的时间差Δt，根据υ＝SR1-R2- /Δt计算出AP的传导速度。 3.5 引导电极间距离与动作电位振幅和时程的关系：用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波刺激神经干中枢端，测定第1对引导电极间距为10、20、30mm时的BAP正相振幅和时程。 3.6 测定单相动作电位（monophasic action potential，MAP）：用镊子夹伤第1对引导电极间的神经干，然后用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波刺激神经干中枢端，测定末梢端MAP振幅和时程。 3.7 观察刺激强度（U）与动作电位振幅的关系：刺激波宽0.1ms，刺激电压从0.1V开始， 按步长0.01V增加，刺激电压每增加一次刺激神经干一次，并记录刺激电压和MAP振幅。 3.8 测定KCl处理前后动作电位（AP）：刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms，记录 3 mol/L KCl 处理前，处理后2min时AP的振幅和时程。 3.9 测定 procaine 处理前后AP：刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms，记录4％ procaine处理前，处理后5min时AP的振幅和时程。 4 结果 4.1 中枢端引导BAP 用刺激强度1.0V波宽0.1ms刺激神经干时，中枢端引导的第一对引导电极双向动作电位正相振幅和负相振幅分别为3.77±1.75mV和2.38±0.98mV，正相振幅大于负相振幅（P<0.01）。第二对引导电极双向动作电位正相振幅和负相振幅分别为2.35±0.77mV和1.24±0.41mV，正相振幅大于负相振幅（P<0.01）。 第一对引导电极动作电位正相时程和负相时程分别为1.19±0.13ms和2.48±0.42ms，正相时程短于负相时程（P<0.01）。第二对引导电极动作电位正相时程和负相时程分别为1.69±0.21ms和2.78±0.48ms，负相时程长于正相时程（P<0.01）；第一对引导电极双向动作电位正相振幅与负相振幅均大于第二对（P<0.05，P<0.01）。 4.2 不同电极距离引导BAP 末梢引导时引导电极距离10mm、20mm、30mm时引导电位正相振幅A10p、A20p、A30p分为8.60±2.92mV、10.87±3.59mV、10.93±3.63mV，负相振幅为4.49±1.67mV、5.80±2.10mV、3.81±1.37mV，三种距离的正相振幅均大于负相振幅（P<0.01），A20p、A30p均大于A10p（P<0.01），而A20p、A30p无明显差异（p>0.05）。 在时程上，20mm引导电位时程A20n大于A10n与A30n（P<0.01），而A30n与A10n无明显差异（P>0.05）。末梢引导时10mm、20mm、30mm的正相时程分别为1.14±0.15ms、1.35±0.14ms、1.60±0.25ms，负相时程分别为2.43±0.38ms、2.83±0.47ms、3.09±0.26ms，负相时程均大于正相时程（P<0.01），t检验可以的出D30p>D20p，D30p>D10p，D20p>D10p（P<0.01），方差得出D30p>D>D10p（P<0.01），同样方法可以得到D30n>D20n>D10n（P<0.01）。 4.3 末梢引导BAP与MAP 末梢端引导的双相动作电位正相振幅为8.96±3.43mV，负相振幅为4.61±2.10mV，正相振幅大于负相振幅（p<0.01）；正相时程为1.15±0.18ms，负相时程为2.42±0.34ms，正相时程小于负相时程（p<0.01）。 末梢端引导的单相动作电位振幅为10.32±4.18mV，大于双相动作电位正相振幅（P<0.05）；末梢端引导的单相动作电位时程为2.10±0.60ms，大于双相动作电位正相时程（P<0.01）。 4.4 传导速度测定 末梢引导BAP测量AP传导速度为26.87±6.14m/s。 4.5 刺激强度与动作电位 引起动作电位的阈强度为0.26±0.06mV，最大刺激强度为0.66±0.20mV。选取一标本刺激强度-动作电位振幅数据绘制曲线变化见下图所示，可见该标本阈强度为0.15mV，最大强度0.58mV。从曲线上看，低于阈强度电位振幅等于0，从阈强度开始，动作电位上升速度增快，最后再上升速度减小，曲线慢慢趋于平稳，至达到最大刺激强度刺激，动作电位振幅几乎不再上升。 4.6 KCl溶液处理 引导电极用3mol/LKCl处理前双相动作电位正相振幅为2.84±0.61mV，处理2min双相动作电位正相振幅3.35±0.67mV，振幅增大具有统计学意义（P<0.01）。处理前负相振幅1.43±0.71mV，处理后负相振幅0.33±0.35mV，振幅减小亦具有统计学意义（P<0.01）。 4.7 Procaine溶液处理 第一对引导电极4%procaine处理前双相动作电位正相振幅8.07±2.32mV，处理后正相振幅9.21±2.28mV，振幅增大具有统计学意义（P<0.01）；处理前双相动作电位负相振幅3.53±2.32（mV），处理后双相动作电位负相振幅1.05±1.15mV，振幅减小具有统计学意义（P<0.01）。 5 讨论 4.1 刺激电压从Uth增加至Umax，神经动作电位振幅随刺激电压增加而增高。明神经干动作电位不具有“全或无”性质。坐骨神经干为不同类型的神经纤维组成，各个类型纤维的兴奋水平不同【1】，在一个有限的范围内神经干动作电位的大小与刺激的强度成比例【2】。在阈刺激以下刺激无法引起神经干兴奋性最高的神经细胞兴奋，阈刺激刚刚好能引起上述细胞兴奋，随刺激强度进一步增大，更多的神经细胞开始兴奋，其动作电位互相叠加，表现为复合动作电位振幅逐渐增大，当刺激强度超过最大刺激强度时，所有的神经细胞已经兴奋，这时复合动作电位达到最大值。 4.2 刺激神经干中枢端所得双相传导电流（BAP）和刺激神经干末梢端所得BAP，正相振幅均大于负相振幅，正相时程均小于负相时程，表明在蟾蜍坐骨神经干动作电位引导时，两个引导电极处神经纤维的多寡不是形成BAP正相振幅大于负相振幅以及正相时程小于负相时程的主要原因。同时，也说明神经兴奋在神经干上具有双向传导的特性。 4.3 测定第1对引导电极间距为10、20、30mm时的BAP正相振幅和时程，发现20、30mm时的BAP正相振幅和负相振幅均大于10mm时，有显著性差异（p<0.01），表明不同神经纤维传导速度的不同也不是导致双相动作电位中正相振幅大于负相振幅的主要原因。 4.4 在两引导电极间靠近正引导电极端夹伤神经，神经冲动传导被阻断，双相动作电位负相波消失，形成一正相波形，提示，双相动作电位是神经冲动先后通过两个引导电极形成的，冲动通过第1个电极，形成动作电位的正相波，冲动通过第2个电极，形成动作电位的负相波。 同时实验数据显示单相动作电位振幅大于双相动作电位正相振幅，即负相波的存在，使双相动作电位中正相波的振幅减小。由此可以推测，正相波与负相波在时间轴上重叠，并相互叠加，叠加的结果导致了振幅与时程的改变。若叠加发生在正相波去极后期，正相波波峰减小，时程缩短，故由于神经冲动传导被阻断而使负相波消失时，正相波叠加抵消的那部分重新出现，正相波的波幅和时程均增大。若叠加发生在正相波复极期，正相波波峰不减小，但时程缩短，当神经冲动传导被阻断后，正相波被叠加抵消的复极化部分出现，正相波时程延长。双相动作电位负相波的去极期完全与正相波叠加，其波幅减小程度大于正相波。负相波的复极后期，正相波已复极完毕，没有叠加发生，动作电位复极后期的时程较长，负相波时程缩短的程度比正相波小。实验数据表明阻断神经冲动的传导后正相波的振幅和时程均增大提示本实验的正负相波的叠加发生在正相波的去极后期。在本次实验中观察到的波形都是正负波叠加后的波形，要想同时观察到完整的正相波跟负相波可将第一对引导电极两电极间的间距逐渐增大，使负相波在正相波完全复极化之后才出现，正负两相波的振幅相等，此时便能观察到正负两个方向上的两个完整的波形。 4.5 蛙神经冲动的传导速度在20℃时约为每秒30米[2]，本实验所测得的蟾蜍坐骨神经干动作电位的传导速度26.87±6.14m/s与参考值较接近。 4.5 用一定浓度的KCL溶液或procaine处理神经干，与处理前对照，负相波基本消失，正相波的幅度增大，说明KCL溶液或procaine能够阻断神经传导，同时也印证了双相动作电位是由正相波和负相波叠加而成的猜想。KCL溶液处理神经干时，细胞外的钾离子浓度增大，使膜静息电位绝对值减小，神经细胞兴奋性降低[3]。Procaine主要作用于神经细胞钠通道，阻断钠内流，抑制动作电位的产生[4]。 【参考文献】： [1]MaryA.B.勃雷兹尔.神经系统的电活动.1984.第1版.科学出版社.北京P45 [2]D.J.AIDLEY.可兴奋细胞的生理.1983年09月第1版.科学出版社.北京P35 [3] 陈主初. 病理生理学. 人民卫生出版社，北京，2001 [4] 吴基良，罗建东. 药理学. 科学出版社，北京，2007