3.生物技术制药-基因工程

null第二章　基因工程制药第二章　基因工程制药第一节　基础知识 第二节　基因工程制药的基本第一节　基础知识第一节　基础知识1. 细胞的结构（真核和原核）1. 细胞的结构（真核和原核）真核细胞原核细胞nullnull细胞大小null非细胞生命体2. 细胞核中的染色体2. 细胞核中的染色体nullnull染色体 chromosome染色体 chromosomenullDNA 长度: 4.6 x 107 bp = 1.5 cm Chromosome 长度: 2 µm 压缩率 = 8000130 nm 纤维null30 nm 染色质纤维5压缩率 = 50null4DNA组蛋白组蛋白3. DNA3. DNAhelical10 layer Lines Between Cross Patterns (10 Residues Per turn)碱基互补：A/T C/G碱基互补：A/T C/GnullABZ12DNA半保留复制DNA半保留复制4. 基因组4. 基因组任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes（基因组）。 null 几种生物的基因组比较病毒SV40 5.2 1 　 环状 大肠杆菌 4000 1 环状 酵母 17 × 17000 17 线状 人 23 × 5-7×106 23 线状 种类 大小 （ Kb） 染色体数 形状5. 基因5. 基因DNA上具有特定功能的一个片断，负责一种特定性状的达。一般来讲，一个基因只编码一个蛋白质。DNA上的基因DNA上的基因6. DNA、RNA与蛋白质6. DNA、RNA与蛋白质DNA:两条互补链。由ATCG四个字母（碱基）形成的字符串。 RNA:单链结构。由AUCG四个字母（碱基）形成的字符串。 蛋白质:一条或多条肽链。每个肽链是由20种氨基酸形成的长链，即20个字母（氨基酸）形成的字符串。 翻译：每3个碱基翻译成一个氨基酸。7. 电泳7. 电泳在凝胶一端小槽中放入荧光标记的DNA片断，两端加电压，短DNA片断跑得快，长DNA片断跑得慢。 测序时需要区分长度只差一个碱基的片断8. PCR8. PCRDNA体外扩增方法的一种，能够将很少的试样（比如只有罪犯的一滴血），扩增成完全相同的无数拷贝。 每PCR一轮，扩增两倍 1-2-4-8-16… PCR（polymerase chain reaction， 　聚合酶链式反应）很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...nullMullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……null PCR技术的发明Mullis教授开汽车时的联想逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖行驶的汽车——一小段DNA引物Mullis的第一个PCR实验Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37 ℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。PCR的发展史PCR的发展史1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。nullPCR不只是一个方法改进PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。null变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 复制延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链null每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段nullPCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4 小时PCR的应用领域: 生物学领域几乎无处不用PCR的应用领域: 生物学领域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） /基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）耐高温DNA聚合酶的种类耐高温DNA聚合酶的种类Taq DNA聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche) Tth DNA聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo) Pfu DNA聚合酶 （Pyrococcus furiosus，Stratagene） Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚合酶 （Thermus flavus，Promega) Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚合酶 ( Pyrococcus woesei，Roche) Pfx DNA聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen) Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme） FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilus？，复旦大学) Tma, Tne, KOD, ……9. DNA测序9. DNA测序确定一条染色体片断上的碱基顺序。 Sanger法： 在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA, ddT, ddC, ddG（相应于4种碱基） ddX的两个作用： 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接 电泳 谁终止，碱基就是谁 此方法获1974年的Nobel奖Sanger第一步：加入复制终止剂Sanger第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快Sanger第二步：荧光检测Sanger第二步：荧光检测全自动的测序仪器：MegaBace全自动的测序仪器：MegaBacenull已完成测序工作的生物面包酵母线虫果蝇拟南芥2002年中国科学家公布水稻基因组2002年中国科学家公布水稻基因组A Draft Sequence Assembly of the Rice Genome Science 2002 April 5; 296(5565): p. 79-92Refer Science Online： http://intl.sciencemag.org/cgi/content/abstract/296/5565/792000年6月白宫的庆典人类基因组测序完成2000年6月白宫的庆典人类基因组测序完成VenterCollins