微生物生长量的测定方法

2 微生物生长量的测定 微生物特别是单细胞微生物,体积很小,个体生长很难测定,意义也不大。通常测定微生物的生长是测群体的生长,而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。 2.1测生长量 测定生长量的方法有许多种,适用于一切微生物。 2.1.1直接法 2.1.1.1测体积 它是一种较为粗放的方法,通常用于初步比较用。例如将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心,然后观察沉降物的体积。 2.1.1.2 称干重 采用离心法或过滤法测定,一般干重为湿重的10%~20%。如用离心法,将待测培养液离心,再用清水洗涤离心1~5次后干燥,可用105℃、100℃或红外线烘干,也可在较低的温度(80℃或40℃)下进行真空干燥,然后称干重。如细菌一个细胞一般重10-12~10-13g。如为丝状真菌可用滤纸过滤,细菌可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后,细胞可用少量水洗涤,再真空干燥(40℃以下),称干重。以乳酸菌为例,在液体培养基中,细胞的浓度大约为2×108个/ ml。100 ml培养物可得10~70mg干重的细胞。 2.1.2间接法 2.1.2.1生理指标法 与生长量相平行的生理指标很多,它们均可用作生长测定的相对值。 1)测定细胞总含氮量来确定细菌浓度大多数细菌的含氮量为干重的12.5%,酵母菌为7.5%,霉菌为6.0%。总氮量与细胞粗蛋白的含量(因其中包括了杂环氮和氧化型氮)的关系可用下式计算: 粗蛋白总量=含氮量%×6.25 含氮量的测定方法有很多,常用凯氏定氮法。此法适用于细胞浓度较高的样品,同时操作过程也较麻烦,主要用于科学研究中。 2)含碳量的测定微生物新陈代谢的结果,必然要消耗或产生一定量的物质,以表示微生物的生长量。一般生长旺盛时消耗的物质就多,或者积累的某种代谢产物也多。将少量生物混入1ml水或无机缓冲液中,用2ml 2%重铬酸钾溶液在100℃下加热30分钟,冷却后,加水稀释至5ml,在580nm波长下测定光密度值(用试剂作空白对照,并用标准样品作标准曲线),即可推算出生长量。 3)其它磷、DNA、RNA、A TP和N–乙酰胞壁酸等的含量,以及产酸、产气、产CO2(用标记葡萄糖作基质)、耗氧、粘度和产热等指标,均可用于生长量的测定。 2.1.2 .2比浊法 微生物在液体培养基中生长,由于原生质含量的增加,引起培养物混浊度的增高。最古老的 比浊法是采用McFarland比浊管,用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管,其中形成的BaSO4有10个梯度,表示10个相对的细菌浓度(预先用相应的细菌测定)。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较,如果两者的浊度相当,即可目测出该菌液的大致浓度。 精确的测定,要用分光光度计进行。在可见光的450~650nm波长内均可测定。 2.2计数法 计数法即是计算微生物繁殖出的个体数目,此法适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。 2.2.1直接法 直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法,其计数结果是包括死细胞在内的总菌数。 2.2.1.1比例计数法 是一种粗放的计数方法。将已知颗粒(例如霉菌的孢子或红细胞等)浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合,然后镜检各自的数目,求出未知菌液中的细胞浓度。 2.2.1.2血球计数板法 计数一定容积中的细胞总数的常用方法,此法对细胞较大的酵母菌较为适用。详细方法见实验指导书。 2.2.2间接法 是一种活菌计数法,其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混浊,在固体培养基表面形成菌落,然后计数活菌的方法。 2.2.2.1平板菌落计数法 是一种常用的食品中细菌总数的计数法,有标准方法将待测样品稀释,然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀,凝固后培养,然后计数平板上出现的菌落数乘以样品的稀释度,即可计算出样品的含菌数。也可用涂布法将稀释样品接种在凝固的平板培养基上,后续方法同前。此法的优点是检测的结果较为精确,缺点是方法烦琐,获得检测结果的时间长。 2.2.2.2液体稀释法 对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的10倍稀释液各取5ml,接种到3组共15支液体培养基试管中,每管接入1ml,培养一定的时间后,计录每个稀释度出现生长的试管数,然后查MPN(most probable number , 最近似数)表,根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。 随着科学技术的发展,出现了一些快速测定的方法,其形式有小型纸片(1~10cm2),圆形或长方形等。原理是在滤纸上有适宜的培养基和活菌指示剂——2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC, 无色)。用刻度吸管取一定的样品液于滤纸上或浸取样品液,置于密封包装袋中,经短期培养,在滤纸上就会出现一定密度的玫瑰红色微小菌落。计数小红点可计算出样品的含菌量。此外还有DNA指纹技术和PCR扩增等快速测定方法。