真菌菌悬液的制备

真菌菌悬液的制备 1)白色念珠菌悬液的制备 1)取冻干菌种管,在无菌操作下打开,以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。取含 5.0 ml~10.0ml 沙堡液体培养基试管,滴入少许菌种悬液,置 37℃培养 18h~24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液,划线接种于沙堡琼脂培养基平板上,于 37℃培养 18h~24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落,接种于沙堡琼脂斜面,于 37℃培养 18h~24h,即为第 3 代培养物。 2)取第3代~14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h~24h),用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml~5.0ml 稀释液加入斜面试管内,反复吹吸,洗下菌苔。随后,用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s,或在手掌上振敲 80次,以使白色念珠菌菌悬浮均匀。 3)菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。 4)菌悬液保存在 4℃冰箱内备用。当天使用不得过夜。 5)怀疑有污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察,也可用墨水阴地法染色(将菌与黑墨水在玻片上混匀,推成薄膜)后观察。 (2)黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。 1) 在无菌操作下打开冻干菌种管,以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中,轻轻吹吸,使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中,置 30℃±1℃培养 42h~48h。用接种环划线接种第 1 代培养物 于MEA 培养基平板,置 30℃±1℃培养箱中培养 42h~48h。取平板培养物中的典型菌落,接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基,置 30℃±1℃培养箱中培养 42h~48h,即为第3代培养物。 2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml~10.0ml 第 3 代培养物,接种罗氏瓶,并摇动使菌液布满 MEA 培养基面,然后将多余肉汤培养物液体吸出,置 30℃±1℃培养 42h~48h。 3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml~10.0ml 0.05%(V/V)吐温 80 生理盐水溶液, 刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中,将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中,轻轻振摇 1min 后,滤过除去菌丝。滤过后,显微镜下(400 倍)观察是否存在菌丝,若悬液中有菌丝存在,可经 5000 r/min~6000 r/min,离心 20min。再次在显微镜下(400 倍)观察,若悬液中仍有菌丝存在,须再离心。 4) 黑曲霉分生孢子悬液在 2℃~8℃储存不能超过 2 d,使用前,混合均匀,在显微镜下(400 倍)观察是否有孢子出芽,若有孢子出芽,则弃之不用。 5) 使用时,可用稀释液适当稀释。 6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法,每片加菌悬液10μl。染菌后,置 37℃培养箱内烤干(约 30min),或置室温下自然阴干后再使用。 7) 回收菌数应达5×`10^5`cfu/片~5×`10^6`cfu/片,可依试验要求确定。 生孢梭菌菌悬液制备 其实无菌方法验证中的菌悬液的制备也是依中国药典(2005年版二部)附录XI H无菌检查法中“培养基灵敏度检查”项下的方法,制备成小于100 CFU/ml的对照用菌液。所以无论你做什么,菌悬液的制备方法都是一样的。 具体方法就是,先把生孢梭菌在硫乙醇中培养24小时,然后吸取1毫升培养液用生理盐水进行10倍稀释,我的经验是,稀释到10的-7次方就是在100cfu以下了(这个你得自己多做几次平行实验或验证实验,看到底稀释到多少倍。最初不好把握的时候可以同时培养几个临近的梯度),然后取至少200ml的硫乙醇酸盐培养基到试管里(要求无菌),然后接种1ml 制备好的菌悬液到硫乙醇试管里,在32.5度下培养18h,然后开始计数。 生孢梭菌在液体的硫乙醇里会长成梭子一样的单个菌落,这时拿的时候千万不要震动,然后开始计数(一个单独的“梭子”计一个菌落)。 注:如果培养时间太长会产生浑浊,不便于计数。如果震动试管也会浑浊。硫乙醇的量尽量大一点,这样便于计数。