孢子悬浮液制备及孢子数测定

实验二  孢子悬浮液制备及孢子数测定   一、实验原理 孢子制备是发酵工业生产中不可缺少的一个环节，孢子质量的好坏将直接影响到发酵生产的成功与否。孢子制备一般采用琼脂斜面培养基或一般固体培养基经接种后在适宜的条件下进行培养而得，制备的孢子在外观上应生长丰满、色泽正常、无杂菌污染且发酵单位高、生产性能稳定。斜面或其它固体培养基中的孢子数量是衡量孢子质量的一个重要指标。孢子数的测定可采用血球计数板在显微镜下直接进行测定。 二、实验器材 （一）材料 1．PDA培养基 2．麸皮（市售） 3．菌种：黑曲霉Co827（柠檬酸产生菌） （二）仪器设备 1．显微镜 2．三角瓶（250ml） 3．血球计算板 4．高压灭菌锅 三、操作步骤 1．马苓薯培养基（PDA）配制：马铃薯（去皮）200g、蔗糖（或葡萄糖）20g、琼脂20g、水1000ml，将马铃薯去皮切成小块，于锅中加水1000ml煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加糖及琼脂完全溶解后加水补充至1000ml，pH自然。分装于试管后于121℃灭菌30分钟，冷却放置斜面即可。 2．麸曲培养基制备：取市售、无霉变麸皮过筛去除细粉（50目筛），称取8g麸皮，加入250ml三有瓶中，加水约8ml拌均，于121℃灭菌30min即得。 3．接种：取Co827菌种一支，采用无菌操作对斜面及麸曲瓶进行接种，其中麸曲瓶中接入一环原种孢子即可。 4．培养：将斜面及麸曲瓶置于培养箱内，32℃±1℃培养。斜面培养时间为6~7d；麸曲瓶培养8~10d，麸曲培养过程中要求每天翻动一次，直至有孢子产生时停止翻动。培养完成后即得斜面孢子及麸曲孢子。 5．孢子数测定： （1）取已培养好的Co827斜面菌种一支，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2~3次，最终使滤液体积达到10.0ml，待测孢子悬浮液即得。 （2）将孢子悬浮液用无菌水稀释至10-2、10-3，吸取适量的稀释液至血球计数板的计数室内，然后加上盖玻片，静置约5min，先在低倍镜下找到计数室，再转换成高倍镜观察并计数。 （3）计数时用16中格计数板，要按对角线方位，取左上、在下、右上、右下的4个中格（即100小格）的孢子数。如果是25中格计数板，除数上述四格外，还需数中央1中格的孢子数（即80小格）。由于孢子在计数室中处于不同的空间位置，要在不同焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部孢子，防止遗漏。如孢子位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 四、实验结果 1．正确描述斜面、麸曲瓶培养过程中菌丝生长及孢子形成的基本现象。 2．计算每ml悬浮液中的孢子数及每支斜面的孢子数 孢子数（个/ml悬液）= 稀释倍数 每支斜面孢子数=孢子数/ml悬液×悬浮液总体积（ml） n——为第小格中的孢子平均数（个）