蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

蛋白质分离纯化及鉴定综合实验 一、实验内容 将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度; 将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度; 将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。 二、实验过程: 1.蛋白质粗提液制备 溶液配制:0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液 (1)1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳; 磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L; (2)250mL 2.蛋白质浓度测定 (1)溶液配制 1mg/mL 牛血清白蛋白(BSA)溶液:5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中; 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂:称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。 (2)0~100ug/mL标准曲线测定: 取6支试管，按下配制蛋白质浓度梯度各2mL 蛋白质浓度0 20 40 60 80 100 µg/ml 1mg/mL BSA溶0 40 80 120 160 200 液(µl) 蒸馏水(µl) 2000 1960 1920 1880 1840 1800 总体积(µl) 2000 2000 2000 2000 2000 2000 测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值(OD595):500uL蛋白质溶液与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。 以OD595值(3次重复的平均值)为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=,。 (3)测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍(2mL)，取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。 3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离 (1)凝胶溶胀:将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。 (2)装柱:蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。 1 (3)平衡:用10倍于柱床体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的离子环境和样品中的一致。 (4)上样:柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋白粗提液(留过20uL供电泳用)缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来 (5)收集:打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液(注意不能把凝胶冲起来)使样品继续流出，分部收集流出物，第一管收集1mL，以后每管收集200uL，共收集6管。 (6)稀释20倍，测定每个组分的蛋白浓度，可只测定一个OD595值，计算各组分的蛋白浓度。 4.SDS—PAGE 溶液配制: 100ml 30%凝胶储液(arc/bis):29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml蒸馏水中，定容至100ml，避光保存。(该溶液有神经毒性，避免接触皮肤); 100mL 1.5M Tris-HCl 三(羟甲基)氨基甲烷，pH8.8:18.15gTris 碱溶于60mL蒸馏水中，用HCl调pH至8.8，定容至100ml蒸馏水中; 100ml 0.5M Tris-HCl(缓冲液),pH6.8:6gTris 碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl 调pH值至6.8，定容至100ml蒸馏水中; 10ml上样缓冲液:0.5ml ddHO(重蒸水，经过两次蒸馏的水) + 2.5ml of 0.5M 2 Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油 + 4ml 10% SDS(十二烷基硫酸钠)+77.1mg DTT (二硫苏糖醇)+1ml 0.05(W/V)溴酚蓝; 600ml 5×电泳缓冲液(,):9g Tris碱+43.2g甘氨酸+3gSDS，蒸馏水溶解定容至600ml; 1ml 10%过硫酸铵溶液(现用现配):0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水中。 1000ml固定液:取908ml 50%的甲醇和92ml冰乙酸混匀; 500ml染色液:0.25g考马斯亮蓝R(G?)250，加500ml固定液溶解，过滤后避光保存; 1000ml脱色液:取75ml冰乙酸和50ml甲醇，加蒸馏水定容至1000ml。 凝胶制备 7.5%分离胶(20ml) 10%SDS 0.2ml ddHO 11.87ml 2 10%的AP(过硫酸铵溶液) 0.1ml TEMED(.四甲基乙二胺) 10µl 30% arc/bis 5ml 1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml 4%浓缩胶(10ml) ddH2O 6ml 30% arc/bis 1.3ml 0.5MpH6.8Tris-HCl 2.5ml 2 10%SDS 0.1ml 10%的AP 0.05ml TEMED 5µl 灌胶:将电泳板组装好，先灌分离胶至2/3处，水封，分离胶凝固后，吸去水， 灌入浓缩胶至满，插入梳子，注意不要产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子。 样品准备: 分子量Marker、100µg粗提液、100µg分离组分与样品缓冲液混合(哪种，混合 比例)，煮沸3min，作为电泳样品上样。 电泳装置安装:安好后在正负极分别加入稀释好的电极缓冲液。 上样:将处理好的样品分别加入样品孔中，记好加样顺序。 电泳:接好电泳仪，通电，先恒压80V电泳，溴酚蓝前沿到达分离胶界面时， 加大电压至120V继续电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，结束电泳。 剥胶:拆开电泳装置，取出玻璃板，看清点样方向，从玻璃板的一角撬起，凝 胶留在长板上，在右下角切角作标记，用固定液冲下凝胶。 固定:将凝胶放在大培养皿中，用固定液固定1h; 染色:倒去固定液，加入染色液，染色1h， 脱色:倒去染色液，加入脱色液进行脱色，直至看清条带。 凝胶拍照。 三、实验结果 1、 各组分蛋白浓度 2、 电泳结果 四、 分析讨论 分离效果如何,实验设计如何改进, 3 4 5